Read Microsoft Word - Nanotech_Biosensori_A4_final_2.docx text version

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

Nanomateriale aplicaii în biosenzori, surse de energie, medicin biologie

Elemente de nanotehnologie

ioan stamatin 2008

Cuprins

1. Introducere în nanotehnologie 2. Biosenzorii în contextul transdisciplinaritii tiinelor 2.1 De la chemosenzor la biosenzor 2.2 Biosenzorii i nanotehologiile 2.3 Biosenzori, biodiagnostic, nanobiotehnologie, nanomedicin 2.3.1 Biocipurile i tehnologiile actuale ale secolului XXI 2.3.2 Biocipuri, nanobiotehnologia, nanomedicina 2.3.3 Scurt istoric 2.3.4 Referine 3.Stadiul dezvoltrii actuale în domeniul biosenzorilor 3.1 Sisteme, arii de biosenzori, caracteristici de rspuns 3.1.1 Sisteme integrate 3.1.2 abloane 3.1.3 Sensibilitate 3.1.4 Stabilitate 3.1.5 Selectivitate 3.1.6 Parametrii de caracterizare a semnalelor biosenzorilor 3.1.7 Zgomot, rezoluie, drift 3.2 Componentele biologice ale biosenzorilor 3.2.1 Principiile recunoaterii moleculare 3.2.2 Imobilizarea moleculelor gazd 3.2.3 Transducia semnalului 3.2.4 Tipuri de componente biologice 3.2.5 Integrarea componentelor biologice în biosenzori 3.3 Traductori i electrozi 3.3.1 Electrozi 3.3.2 Electrozi în senzori electrochimici 3.4 Fenomene de transport 3.4.1 Cinetica Enzimelor 3.4.2 Fenomene de transport 4. Biosenzori electrochimici 4.1 Senzori chimici vs senzorii biochimici 4.2 Biosenzor electrochimic 4.3.Clasificare 4.4 Receptorul 4.5 Moduri de transducie electrochimic 4.6 Analii, reacii monitorizate. 4.7 Construirea unui biosenzor electrochimic. 4.8 Criterii de performan 1 7 7 11 14 14 15 18 23 25 27 27 27 28 29 29 30 33 34 35 42 42 43 46 51 52 53 54 55 56 59 59 62 62 63 65 67 67 69

4.9 Exemple de biosenzori electrochimici 4.10 Referine 5. Biosenzori microbieni 89 5.1 Principiu de funcionare 5.2 Rspunsul fiziologic al senzorului microbian 5.3 Referine 6. Senzori pe structuri semiconductoare FET 99 6.1 Tranzistori FET, ISFET, CHEMFET, REFET 6.2 Referine 7. Biosenzori cu fibr optic 105 7.1 Fibre optice, caracteristici generale 7.2 Fibre optice cu reele Bragg induse 7.3 FOBS în medicin 7.4 Referine 8. Celule de biocombustie 117 8.1 Necesitatea implementrii surselor alternative de energie 8.2 Celule de biocombustie-celule bioelectrochimice 8.3 Mecanisme în celulele bioelectrochimice 8.4 Clasificare 8.5 Celule de biocombustie microbiene (MFC) 8.6 Elemente de electrochimia MFC 8.7 Referine 9. Nanoparticule în medicin 131 9.1 Nanofbrile, Nanocarboni, rolul lor în microbiologia clinic 9.2 Nanocarboni 9.3 Puncte cuantice 9.4 Referine 10 Nanotuburi de carbon 165 10.1 Istoric 10.2 Structur, proprieti 10.3 Funcionalizare 10.3.1 Purificarea nanotuburilor 10.3.2 Evaluarea puritii CNT 10.3.3 Selectarea nanotuburilor dup lungime i diametru 10.3.4 Separarea CNT dup proprietile lor metalice sau semiconductoare 10.3.5 Ataarea de grupe funcionale 10.4 Referine 11 Nanofire, nanosenzori 179 11.1 Senzori FET cu nanofire 11.2 Limitele de detecie i rspuns pentru nanobiosenzori 11.3 Referine

73 85 90 93 98 99 104 106 109 110 116 117 118 119 121 122 125 128 133 136 147 162 165 167 169 169 170 172 172 174 176 179 183 186

Aceeast carte este dedicat în primul rînd celor doi copii Ionu i erban pentru înelegerea i sprijinul acordat, suportul spiritual al timpurilor grele, acelor Oameni care mai cred în adevr i lui Nini Pop prietenul de o via

1. Introducere în nanotehnologie

,,Discovery consists of seeing what everybody seen and thinking what nobody has thought"

Albert von Szent-Gyogyi The Scientist Speculates,1962 If our small minds, for some convenience, divide this...Universe into parts - physics, biology, chemistry, geology, astronomy, and so on ­ remember that nature does not know it! R. P. Feynman, 1963 "When nature finishes to produce its own species, man begins using natural things in harmony with this very nature to create an infinity of species" Leonardo da Vinci

Secolul XXI se confrunt cu transformri de anvergur atît în tiinele naturii cît i la nivel social, economic, uman. Societatea tinde spre informatizare i globalizare a schimburilor comerciale datorit dezvoltrii i integrrii pe vertical respectiv pe orizontal a proceselor de producie avansate ce înglobeaz ultimele inovaii ale tiinei i tehnologiei. Ca orice transformare impactul asupra mediului, dezvoltrii sociale, sntii, dezvoltrii demografice respectiv a necesarului de energie este considerabil. Asistm la transformri i crize de neimaginat altdat: reducerea considerabil a combustibililor fosili, noi tipuri de boli, epidemii care altdat erau necunoscute, transformri ale naturii datorit înclzirii glo-bale, creterea accelerat a stresului, modificri drastice în mediu datorit noxelor i deeurilor, dispariii de specii naturale etc. Cum acionm s prevenim? Cum monitorizm aceste fenomene? Ce soluii avem pentru surse noi de energie i combustibili ecologici? Cum reintegrm deeurile? Cum prevenim bolile sau le vindecm pe acelea incurabile? Ce soluii ne ofer tiinele i tehnologiile actuale sau cele de viitor? Un rspuns categoric nu exis iar lucrurile trebuiesc privite în dinamica dezvoltrii societii care este o societate de consum adic lucrurile bune astzi devin neutilizabile mîine datorit apariiei altora mai performante. Un rspuns actual este dezvoltarea i implementarea nanotehnologiilor la orice scal de dezvoltare a societii în curs de globalizare. Nanotehnologia este germinat de rezultatele tiinelor interdisciplinare din secolul XX i a noilor instrumente de investigare la scal nanometric a materiei. Ea a generat ulterior o larg intermixare a tiinelor altdat considerate fundamentale i a propulsat noi domenii de cercetare de neimaginat cu cîteva decenii în urm. În sens restrictiv este tiina materialelor a cror proprieti depind de dimensiune i cuprinde: 1

· Nanotiinele: fenomenele i legile fundamentale ale fizicii, chimiei, biologiei aplicate la scal nanometric. · Nanoinginerie: manipularea moleculelor pentru a construi noi tipuri de materiale; instrumentele i metodele prin care sunt proiectate i realizate dispozitive la scal nanometric, asamblarea lor în produse de larg consum i pentru noi cercetri avansate. Nanotehnologia, "tehnologia fabricaiei secolului 21", cuprinde ingineria de înalt precizie, direcia principal în aplicaiile biomedicale din arii ca terapia genetic, transportul dirijat de medicamente, noi tipuri de medicamente, tehnici de sintez la scal nanometric sau mai concis arta manipulrii atomilor individuali i a moleculelor pentru a construi structuri cu proprieti dirijate. Nanotehnologia reprezint abilitatea de a construi obiecte prin asamblarea de atomi în secvene de timp bine precizate. A construi structuri pornind de la atomi i molecule este necesar inventarea de dispozitive de asamblare la scal nanometric. Rolul lor este de a asambla atomii i moleculele în miliarde de configuraii specifice unei structuri nanometrice. Capacitatea ansamblurilor de a se autoreplica este una din cerinele de baz a instrumentelor nanometrice. Fiecare nanoinstrument va trebui s opereze în mod propriu i s fie programabil. Materialele sintetizate a cror dimensiuni caracteristice se situeaz între 1nm i 100 nm au proprieti dependente de dimensiune. Aceasta prezint un interes tiinific deosebit. Cu cît dimensiunea unui material se reduce cu atît fenomenele cuantice sunt mai pronunate iar defectele sunt mai puin importante ca în procesele de sinterizare ca exemplu. Interesele industriale sunt enorme: depirea limitrilor din litografie pentru tehnologia semiconductorilor, cererea de control la nivel molecular, simplificarea proceselor, durificarea suprafeelor, aplicaii fotonice, controlul permeabilitii, biocompatibilitate pentru a enumera cîteva din ele Nanotehnologia: este un domeniu multidisciplinar care aduce marile realizri tiinifice din Fizic, Chimie, Biologie, Matematic i tiina materialelor spre aplicarea lor la a construi cu atomi i molecule materiale la scal nanometric cu inteligen artificial, structuri biocompatibile, surse de energie neconvenionale, nanoroboi pentru medicin, cipuri cu densitate mare a componentelor i biomateriale auto-replicabile etc. Metoda de construcie de jos în sus este astzi cunoscut ca "building from bottom-up". Este domeniul unde structurile biologice (ADN, proteine, oligomeri i bio-oligomeri) sunt arhitecturate cu materiale sintetizate la scal nanometric utilizînd tehnici combinte din fizic i chimie (microscopia de fore atomice, nanolitografia, fascicule mole-culare, nanoelectrochimie, sol-gel) cu cele din genetic; domeniul unde moleculele i polimerii devin dispozitive electronice (electronica molecular); domeniul unde proprietile materialelor sunt exploatate la extrem pentru tehnica spaial; domeniul unde se dezvolt întrega tehnologie a informaiei. Ramurile Nanotehnologiei: nanofabricaie, nanomecanic, nanorobotic, nanocompozite i compozite nanostructurate, nanobiotehnologie, nanomedicin, electronic 2

molecular, MEMS, NEMS (sisteme micro/ nanoelectromecanice), microfluidic, medicamente inteligente, textile inteligente, biosenzori, econanotehnologie. Nanotehnologia a revigorat întreaga industrie electronic; astzi dimensiunile unui tranzistor nu depete 180 nm într-un procesor Aceste domenii de cercetare vor profita de combinarea eforturilor teoretice i experimentale din electronica molecular i materialele inteligente supramoleculare. Conexiunea dintre ramurile nanotehnologiei o constiuie Sistemele Micro i Nanoelectromecanice, discipline noi create o dat cu dezvoltrile rapide din nano i microlitografie, microelectronic, stereolitografie. Dispozitive MEMS, NEMS, bioMEMS sunt aplicate la structuri complexe inteligente care cu o decad în urm practic erau de domeniul science fiction. Domeniul este focalizat în prezent pe crearea de micro/nanosisteme în efortul de combatere a terorismului, aplicaii în securitatea domestic (protecia caselor, terenurilor etc), securitatea electronic, siguran în exploatare. Aspectele multidiscipinare sunt extem de complexe pentru înelegerea ingineriei acestor sisteme ce acoper arii extem de largi: nanostructuri, nanoelectronic, microfluidic, senzori biochimici de înalt rezoluie, detecia substanelor chimice i a agenilor biologici nocivi, microsenzori pentru radioactivitate, senzori cu consum redus de putere, aplicaii medicale, investigri noninvazive, biomimetic, secvenierea rapid a ADN-ului, transportul la int a medicamentelor, polimeri electronici, nanooptic, tehnici analitice la nivel nanometric, nanoasamblare, nanointegrare, tehnologia informaiei la scal nanometric, nanosisteme multifuncionale, bionanointerfee. Tehnologiile implicate în aceast ramur: microstereolitografie, microformri prin matriare i extrudare la dimensiuni submironice. Produse i servicii generate de nanotehnologie: · Dispozitive chimice inteligente, compatibilitate pentru microsisteme; chimice, biocompatibilitate pentru bioMEMS; · Senzori i actuatori inteligeni; · Microsisteme MEMS inteligente pentru microanalize; · Nanosisteme utilizate în transportul la int a medicamentelor; · Electronica comunicaiilor: microantene cu autocontrol, reconfigurabile; tehnologia Bluetooth; RF-MEMS; · Laborator-pe un cip (lab on chip): compensare, autocalibrare, transmisie de date; cipuri hibride; interfee auto-adaptabile; · Materiale pentru electronic packaging; · Polimeri, biopolimeri autoasamblabili; · Sisteme CAD/CAM pentru structuri MEMS: modelare electro-termomecanic, microfluidic; · Pentru medicin, farmacie, bioingieria dispozitivelor Lab- on cip, biologie molecular, inginerie genetic, proteomic, biomimetic: nanoboi transportori de medicamente reparatori de esuturi, nanoboi cu proprieti de anticorpi, nanoboi sanepizi. 3

· Tehnologie IT: dispozitive pe structuri CNT (nanotuburi de carbon), nanofotonic, pile sau celule de combustie nanometrice, dispozitive spintronice. Practic este imposibil de a predicta implicaiile nanotehnologiei dar simplu am putea considera c noile domenii ce apar se dezvolt într-un ritm alert. Oricum trebuie s remarcm un lucru esenial despre nanotehnologie i produsele ei: ,,Primul lucru care trebuie a fi cunoscut despre tehnologie este acela c tehnologia prin ea însi nu creaz bogie, plus valoare i bunstare. Numai produsele i serviciile care sunt create de tehnologie pot fi vîndute sau comercializate. În timp ce este adevrat c tehnologia poate conduce la procese care pot crea plus valoare prin îmbuntirea eficienei unor operaii existente, dezvoltarea i furnizarea acestor procese este frecvent realizat de ctre o alt firm ce ofer acest tip de serviciu. Exist deasemeni o asociere apropiat dintre un nou proces i un nou produs sau serviciu" Denzil J. Doyle, Making Technology Happen,2001 Întrucît capitolele ce trateaz diferite aspecte ale implicaiilor nanomaterialelor în biosenzori i medicin, consider c este necesar a da unele definiii: Nanobiotehnologie: tiin multidisciplinar care aplic instrumente i procese din nano /microfabricaie pentru a construi dispozitive în vederea studierii biosistemelor, microanaliza biomoleculelor prin interfaarea unei singure celule, ridicarea profilului metabolismului i biochimismului ei, analiza rspunsului la diferii analii; nanoparticule inspirate din biologie; biosenzori, celule de combustie microbiene, noi tipuri de markeri etc Nanomedicin: descrie un set de capabiliti a sistemelor de maini moleculare care pot fi utilizate în diagnostic, tratament i reparri de esuturi sau organe: dispozitive medicale nanorobotice, abilitatea de a recunoate, sorta i transporta molecule, autogenerare, comunicare cu medicul, abilitatea de a migra prin tot corpul de a manipula obiecte microscopice, de a dezafecta celule i virui, evidenierea genelor responsabile de cancer eventual repararea lor. Econanotehnologie: nanotehnologia în protecia mediului i a polurii, epurarea mediului i soluii noi de energie regenerabil, recuperarea i meninerea biodiversitii, toxicitatea nanoparticulelor (nanonoxe). Lucrarea de fa abordeaz teme i subiecte de mare actualitate fiecare capitol putînd fi studiat separat. Ea este rezultatul leciilor de curs inute la seciile de master de Biofizic i Fizic medical, Fizica Polimerilor dar mai ales al cercetrilor din diferite contracte naionale i internaionale pe teme diverse ce au dezvoltat aceste subiecte: 1. FP-6, TOK, Biological and microbial fuel cells ( TOK-Marie Curie) 2. NATO-SfP 974214, Carbon-Ceramic composite materials for electrical engineering applications. 3. PN-II-2007, Dezvoltare de biosensori bazai pe acizi nucleici pentru evaluarea i monitorizarea unor ageni toxici cu aplicaii în bioterorism. 4

4. CEEX-PD-3158, proiect postdoctoral, Celule de combustie ­ stocare de hidrogen. 5. CEEX- Ctr 25/2005, Impactul micotoxinelor produse de specii de fungi ale genului Fusarium, asupra lanului alimentar; investigarea unor metode de contracarare a toxicitii acestora în scopul îmbuntirii calitii i securitii alimentare la nivelul standardelor impuse de aderarea la UE. 6. CEEX-Ctr 88/2005, Materiale alternative multifuncionale cu cost sczut, pentru pile de combustie cu electrolit polimer (PEMFC) ce opereaz la temperaturi mai mari de 180°C. 7. CEEX-Ctr. 635/2005, Sticle ecologice obinute prin nanotehnologii, pentru atenuarea, adaptarea i reastaurarea factorilor de mediu naturali . 8. PCI 2006-Universitatea din Bucureti, Msurarea, caracterizarea i manipularea structurilor nanometrice cu microscopia de fore atomice 9. CEEX-Ctr 60/2006, Administrarea dirijat de medicamente prin nanostructuri procesate prin tehnici laser pulsate avansate 10. CEEX- Ctr. 110/2006, Model experimental pentru studiul biodisponibilitii unor factori nutriionali (Ca, B, fitosteroli) i influena lor asupra mineralizrii osului la porc, suport tiinific în studiul osteoporozei 11. MATNANTECH / PF 256 / 2004 Nanostructuri pe baz de carbon sintetizate prin tehnici avansate i aciunea lor asupra microorganismelor patogene. 12. CERES / PED, 2004, Acoperiri nanostructurate de biopolimeri obinute prin evaporare laser pulsat asistat de o matrice pentru aplicaii în industria farmaceutic Prin multitudinea subiectelor tratate cartea se adreseaz specialitilor din diferite domenii ale fizicii, biologiei, chimiei, medicinei i ingineriei încercînd s furnizeze instrumente utile de investigare, concepere, design de dispozitive de senzare i de utilizare a nanomaterialeor în diverse domenii. Este conceput în aa fel încît s furnizeze cunotinele necesare pentru iniierea studenilor, tinerilor cercettori în a aborda domenii multidisciplinare dar i pentru cercettori avansai care doresc s-i extind aria de investigare spre multidisciplinaritae. Cartea include o serie de rezultate originale, idei i concepte de utilizare ale nanomaterialelor care sunt publicate pentru prima dat. Fiind rezultatul multiplelor cercetri i experimentri în domenii diverse aduc pe aceast cale mulumiri cercettorilor i profesorilor care au participat i sprijinit aceast iniiativ: Profesor universitar dr Ioan Pânzaru, Rector al Universitii din Bucureti, pentru sprijinul acordat în abordarea acestor cercetri multidisciplinare i de a înfiina primul centru de cercetare în nanotiine i surse alternative de energie Profesor universitar dr. Ion Mihilescu, pentru primul ajutor acordat de a iniia i forma centrul de cercetare. Profesor universitar dr. Emil Barna, Prorector al Universitii din Bucureti, pentru înelegerea i încrederea acordat. 5

Profesor universitar dr. Anton Ciucu, pentru discuiile i sugestiile în elaborarea capitolelor de biosenzori Profesor universitar dr Ion Mihailescu, INFLPR, pentru dezvoltarea de cercetri i a aplicaiilor radiaiei laser în manipularea biopolimerilor Dr. Ion Morjan i Dr. Ion Voicu, INFLPR, pentru discuiile fructuoase de utilizare a nanocarbonilor Dr. Luminia Stamatin, S.C Biolumimedica, pentru experimentele i cercetrile dezvoltate pe bionanocompozite, aplicaii în parazitologie i microbiologie medical Dr. Ionela ranu, IBNA, pentru discuiile fructuoase de utilizare a punctelor cuantice în detecia micotoxinelor. Dr. Rîmbu Gimi Aurelian i Dr Iulian Iordache, ICPE-CA, pentru multiplele discuii i cercetri comune în domeniul celulelor de combustie respectiv biocombustie Dr. Rodica Cristescu, INFLPR, pentru dezvoltarea de cercetri în metode de transport dirijat al medicamentelor la int. Dr. Elisa Mihai, Dr. Bogdan Sava Alexandru, INOE, pentru de dezvoltarea de cercetri în domeniul sticlelor ecologice.

6

2. Biosenzorii în contextul transdisciplinaritii tiinelor

2.1 De la chemosenzor la biosenzor

Lumea în care trim este rapid dominat de informaia digital i de necesitatea de a investiga materia la scal din ce în ce mai mic cu instrumente aparent ultrasofisticate ce pot ,,vedea" atomii i moleculele la lucru prin interacia i asamblarea lor pe diferite nivele de organizare. Iniial, revoluia digital a implicat în principal computere autonome care gradual s-au integrat în reele complexe practic globalizate. Unirea calculatoarelor cu sistemele de telecomunicaii a dus la o cretere enorm a accesibilitii la informaie i de aici creterea cerinei pentru aceasta. În prezent, aceast cerin este dominat de un amestec de texte, audio i imagini structurate în baze de date care astzi sunt omniprezente prin accesibilitatea la internet. Comunicaiile i internetul din ultima decad va alimenta cererea pentru mai multe surse de informaii i date despre aspecte importante din viaa noastr, sntatea, mediul înconjurtor, mîncarea, munca noastr. Corpul uman i în general toate fiinele vii i-au dezvoltat, în decursul evoluiei, senzorii specifici care s menin echilibrul fiziologic i metabolic în raport cu interaciunea i schimburile cu mediul înconjurtor. Din nefericire modificrile ambientale, societatea din ce în ce mai tehnologizat, implicarea abuziv i neraional a omului asupra biosistemelor regulatoare ale naturii a condus la dezechilibre pe care fiinele vii nu i le mai pot regla prin sistemelor lor senzoriale proprii. Avem din ce în ce mai mult nevoie de senzori artificiali care s fie interfaa monitorizrii i schimbrii.

Figura 2.1- Schema tipic a unui instrument de control i msurare în senzor. Semnalul de la senzor trece într-un buffer- amplificator operaional-cu impedan mare de intrare i protecie. Semnalul este digitizat de ctre ADC transformându-se din analog în digital.În form digital poate fi procesat, stocat, afiat, disponibil spre alte locaii prin reeaua de comunicaii

Astfel senzorii ofer portale dintre lumea "real" sau analoag în care trim i lumea digital a computerelor i a sistemelor moderne de comunicaie prin care ne racordm 7

spre mediul ambiant. Senzorii fac posibil ca s se obin informaii în timp real despre lucruri pe care le putem vedea, atinge, mirosi i auzi i despre alte lucruri care nu le putem detecta ­ lucruri care pot fi nocive sau folositoare pentru noi. Semnalul electronic colectat de la senzor este trecut într-un circuit unde este digitizat de un convertor analogdigital (ADC) (figura 2.1). Informaia digital poate fi apoi stocat în memorie, reprodus vizual pe un monitor sau facut accesibil lumii reale printr-un port digital de comunicaie. Din lumea extrem de diversificat a senzorilor ne vom ocupa de biosenzori, clas a senzorilor chimici, îns pentru o descriere concis a problematicii biosenzorilor atît de vast i variat o definiie se impune de la început în contextul general a noiunii de senzor aa cum figura 2.1 descrie conceptul de detecie i prelucrare a semnalului.

Senzorul în accepiune larg este un dispozitiv ce detecteaz un ,,analit", A, prin intermediul unui ,,receptor", R, ce este cuplat la un ,,traductor", T. Interacia analit-receptor produce un schimb de electroni sau emite/absoarbe fotoni pe care traductorul îl transform într-un semnal electric sau fotonic, analogic sau digital

În figura 2.2 este prezentat schema de principiu a unui senzor.

Figura 2.2- Principiul general de construcie i funcionare a unui senzor. Interacia A-R produce un semnal intern preluat de detector , aflat în contact intim cu transfer spre traductor (figura 2.1)

Un senzor chimic sau biologic funcioneaz pe principiul descris în figura 2.2 prin emiterea de semnal (tensiune sau curent electric, fotonic) ca rspuns la o reacie chimic cum ar fi legtura dintre dou molecule. Acest eveniment implic un receptor chimic sau biologic, R (ligand macrocilic, enzim anticorp etc) care se leag cu o molecul int specific dintr-o prob de studiat, analitul, A. Transmiterea semnalului este realizat prin cuplarea cu un traductor, T care interfaeaz procesele din senzor cu unitatea de prelucrare ­transformare într-un semnal msurabil. Detaliu de funcionare i construcie pentru chemosenzor /biosenzor este prezentat în figura 2.3. Conceptul descris în figura 2.3 arat c biosenzorii sunt o clas, astzi extrem de vast cu particulariti specifice. Astfel putem s adîncim definiia de biosenzor spre particualaritile lui. Biosenzor-dispozitiv sensibil la un stimul fizic sau chimic (cum ar fi cldura sau aciditatea, metabolismul) care transmite informaii despre procesele vitale. Biosenzorii se 8

ocup cu detectarea semnalelor fiziologice i transformarea lor în semnale "tehnice" standardizate, de cele mai multe ori electrice, pentru a fi cuantificate din analog în digital.

Figura 2.3 În chemosenzor, procesul chimic selectiv ce apare în sau pe filmul /membrana chemosenzitiv este cuplat cu traductorul de semnal . Exemple de mecanisme comune implicate includ legarea host-guest (reactantsubstrat reactiv), reacii catalitice sau redox. În senzorul biologic un proces biologic selectiv este direct legat de membran care este cuplat la traductor pentru generarea semnalului

Analiza de semnale în medicin i biologie vizeaz prelucrarea semnalelor înregistrate prin msurtori în scopul extragerii maximului de informaie util în diagnosticare i monitorizare. Pe baza acestei descrieri generale se observ c senzorii în particular biosenzorii pot fi clasificai dup natura traductorului sau a semnalului procesat, figura 2.4. Figurile 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 arat c un senzor este un instrument de msurare a mrimilor fiziologice transformîndu-le în semnale msurabile. Acest aspect a parcurs în ultimii ani drumul de la simpli traductori i aparate de msur la sisteme complexe care integreaz atît electronica analogic, cît i digital.

Figura 2.4- Clasificarea senzorilor dup natura proceselor msurate de traductor

9

Stadiul actual de dezvoltare este cel din figura 2.1 unde totul este integrat i digitizat. Operaiile care în mod tradiional se efectuau analogic (filtrare, sumare, scdere, difereniere, integrare) tind s se fac în msur tot mai mare prin algoritmi de calcul implementai în unitatea de achiziie i procesare de date devenind sisteme moderne de msurare i transmitere a mrimilor fiziologice. Efectul acestei tendine de miniaturizare i digitizare a aparaturii simultan cu cretearea performanelor a condus la implementarea de funciuni mai complexe care la nivelul analogic ar necesita un numr mare de componente liniare discrete (rezistori, condensatori, tranzistori, diode, amplificatoare operaionale). Biosenzorii au o istorie recent. În a doua jumtate a secolului XX biosenzorii erau considerai ca o ramur derivat a chemosenzorilor. Dezvoltarea ca tiin transdisciplinar s-a datorat succeselor curente ale biosenzorului de msurare a glucozei pentru diabetici o metod convenabil, igienic, compact de automonitorizare. Cu acest eveniment biosenzorii au artat un potenial enorm de a detecta o varietate larg de analii în medicin, industria alimentar, monitorizarea mediului, aprare, securitate. În tabela 2.1 sunt sumarizate interferenele aplicaiilor chemosenzorilor -biosenzorilor în decursul evoluiei lor. Aa cum este prezentat în tabela 2.1, exist multe domenii cu aplicaii importante pentru senzorii chimici i biologici, de la monitorizare continu a proceselor chimice din industrie, sesizarea monoxidului de carbon în case, din mediu ambiant la medicina curent, terapie intensiv, telemedicin

Tabela 2.1: Aplicaii de uz comun ale chemo i biosenzorilor Aplicaii Exemple Automobile Sistemul de control al alimentrii cu combustibil, monitorizarea emissilor de gaze i noxe Aprare Aplicaii militare, contramsuri în armele biologice i chimice Industria aeronautic Sisteme de monitorizare a calitii aerului în carlinga avionului, Agricultur Detecia pH, ierbicide, pesticide Industria Chimic Sisteme de monitorizare a emissilor de gaze toxice, testare materiale Securitate civil Detcia gazelor Mediu, Protecia Detecia poluanilor din aer, api sol, BOD, controlul mediului detergenilor Medicin Diagnostice clinice in vivo sau in vitro, determinarea concentraiei de gaze anestezice, telemedicin, terapie intensiv Control Vamal Detecia substanelor ilegale, periculoase, droguri, explozivi, substane radioactive Alimente, Buturi Determinarea compoziiei chimice, mirosuri, nivelul de degradare, odorante, controlul fermentaiei, etc

10

2.2 Biosenzorii i nanotehologiile

Dezvoltarea impetuoas a biosenzorilor ca`o consecin a cerinelor din medicin, protecia mediului, securitate alimentar a impulsionat tehnologiile actuale spre limite i performane nebnuite. Noiunea de senzor, respectiv biosenzor, a evoluat pe msura creterii cerinelor de diagnostic noninvaziv, de investigri i analize fr reactivi suplimentari, de a fi utilizai de nespecialiti, de a lucra on-line (regim continu de monitorizare) sau de a fi de unic folosin. Datorit evoluiilor actuale spre nanotehnologii biosenzorul îi perfecioneaz definiia. Actual prin biosenzor se înelege încorporarea sau integrarea unui element biologic cu un traductor fizic i cu instrumentele i electronica aferent. Se ateapt ca în urmtorii anii s includem în definiie termeni ca interfee hibride alctuite din biocomponente i procesoare moleculare În mileniul III biosenzorul nu mai poate fi disociat de tehnologiile avansate din optoelectronic, tehnologia siliciului, procesarea de date, electronic molecular, tehnologia IT&C. Aa cum se va prezenta în urmtorul capitol clasele de biosenzori se extind i se perfecioneaz odat cu noile avansri în nanotehnologie cu un impact asupra biotehnologiei i medicinei, ecotehnologiilor care acum o decad era de neimaginat. Domenii specifice ale biologiei i medicinei unde nanotehnologia se implementeaz cu o puternic vigurozitate a generat noi direcii astzi cunoscute sub denumiri de nanomedicin, nanobiotehnologie termeni deja consacrai (subdomeniul biosenzori deja este privit ca interdisciplinar dintre nanobiotehnologie i nanomedicin). Nanotehnologia i biosenzorii s-au impulsionat reciproc în dezvoltare. În etapele iniiale s-au interferat reciproc prin implementarea unor algoritmi numerici mai puternici i mai compleci (software) ce s-au realizat în cadrul structurii fizice de calcul numeric, (hardware) existente. La acestea au concurat progresele tehnologice în termeni de reducere a volumului fizic al componentelor discrete iar ulterior a circuitelor integrate digitale care au continuat cu o integrare i ultraminiaturizare pîn la nivelul de 1nm. În paralel dezvoltarea în timp a medicinii a urmat, în mare, evoluia încercrilor omului de a se cunoate mai bine, de a împinge tot mai departe cunotinele în ceea ce privete mediul în care se dezvolt. Treptat, tehnologii avansate i nanotehnologii din ce în ce mai sofisticate au ptruns tot mai mult în cercetarea medical i a mediului înconjurtor, realizînd o investigare tot mai amnunit, mai riguroas, a fenomenelor vieii, a bolilor, a mediului. Secolul 21 aduce disciplinele din tiinele naturii, anterior considerate independente, într-un context de interdisciplinaritate nebnuit odat cu dezvoltarea acestui nou concept: nanotehnologia. Nanotehnologia reprezint tiinele la scal nanometric, manipularea materiei nanometrice în realizarea de noi structuri i ansamble moleculare. Un nanometru reprezint a miliarda parte dintr-un metru, aproximativ 1/80000 din diametrul firului de pr sau de 10 ori diametrul atomului de hidrogen.

O definiie: Nanotehnologia este tehnologia bazat pe arta manipulrii atomilor individuali i a moleculelor pentru a construi structuri cu proprieti dirijate.

11

Nanotehnologia reprezint abilitatea de a construi obiecte prin asamblarea de atomi la un moment de timp în secvene bine precizate. În prezent cu instrumentele puse la dispoziie de nanotehnologie, inginerie genetic, proteomic construim obiecte de ,,jos în sus=bottom-up" adic ansamblm atomi i molecule în structuri.

Figura2.5- Dispunerea organizrii materiei pe scal nanometric-micrometric

Pentru a realiza aceasta este necesar de alte tipuri de instrumente i dispozitive de dimensiuni nanometrice. Pentru a realiza obiecte macroscopice avem nevoie de miliarde de aceste mici dispozitive (ansambleri). A reproduce aceste tipuri de instrumente avem nevoie de o metod de a se autoreproduce sau de instrumente de replicare (replicatori). Noile instrumente nanometrice necesit a fi programabile pentru a realiza un anumit tip de operaie. În figura 2.5 sunt prezentate diferite nivele de organizare ale materiei. la scal nanometric i micrometric. Se constat imediat c instrumentele nanotehnologiei au dimensiuni sub acelea ale virusurilor. Obsevm uor din figura 2.6 cum noile instrumente ale nanotehnologiei pot manipula atomi i molecule la scal nanometric. Iat c în acest context traductorii, componente eseniale într-o structur senzorial, capt semnificaii cu totul deosebite datorit miniaturizrii i integrrii pe scar larg în circuitele integrate devenind ele însi cipuri cu o puternic interfaare a proceselor de reacie analit-receptor. Cînd receptorul conine componente biologice parial sau total integrate pe traductor atunci orice tip de senzor capt definiia de BIOSENZOR- ca un atribut generic. În acest context i noiunea de biosenzor evolueaz mai ales privit ca domeniu de aplicaie. În ultima decad termenul de biosenzor a fost în variate moduri aplicat la un numr de dispozitive fie pentru monitorizarea sistemelor vii sau pentru acelea care au încorporate elemente biotice. Recent comitetul IUPAC [1] a încercat o lmurire a definiiei termenului de biosenzor printr-o sistematizare a literaturii de specialitate care în decursul timpului a fost utilizat pentru a descrie termometre, spectrometre de mas, dispozitivele de determinare a daphniei în ecosistemul apelor, echipamente electrofiziologice, identificri de elemente chimice prin electrozi ionselectivi. 12

Figura 2.6- Manipulatoare al materiei de la scal micro (a) -implantri din ingineria genetic- la nanoscal (b) unde prin AFM ( microscopia de fore atomice) se pot poziiona i asambla atomi sau molecule (mecanosinteza) sau lucra cu fluide i transport de elemente bio( micro/nanofluidic) (c)

Prin consens s-a stabilit c termenul trebuie s fie rezervat pentru utilizarea în context modern ca un senzor ce încorporeaz elemente biologice cum ar fi, enzime, anticorpi, acizi nucleici, microorganisme sau celule. IUPAC sugereaz ca acest termen s fie pe deplin folosit în acest context. O dat cu dezvoltrile din nanotehnologie care au adus o extrem de larg interdisciplinaritate iar materialele sunt în prezent manipulate la scal nanometric noiunea de biosenzor capt o definiie mai larg:

Biosenzorul va fi definit ca un dispozitiv analitic compact încorporînd un element senzorial biologic sau derivat biologic integrat intim cu un traductor fizico-chimic. Scopul biosenzorului este de a produce un semnal electronic analogic sau digital care este proporional cu concentraia unui analit singular sau a unui grup de analii [2].

Actual, biosenzorii sunt utilizai în foarte multe domenii cum ar fi medicin, industria chimic, alimentar, farmaceutic, tehnic militar i de aceea este necesar cunoaterea principiilor de construcie i funcionarea lor. Domeniul în care aceste dispozitive iau gsit o larg utilizare fiind cel medical se impune cunoaterea mecanismelor de reacie i a afinitii enzimelor i microorganismelor pentru diferite substraturi de interes. Cercetrile actuale au ca scop miniaturizarea de a crea arii de senzori, structuri integrate, laboratoare de analiz pe un singur cip, creterea sensibilitii i a timpului de via, scderea timpului de rspuns, lrgirea plajei de utilizare i scderea costurilor de fabricaie a acestor dispozitive.

13

2.3 Biosenzori, biodiagnostic, nanobiotehnologie, nanomedicin

Astzi vorbim despre platforme de diagnostic, imagistic molecular i diagnostic molecular, caracterizarea proceselor i structurilor biologice. Toate acestea au la baz fundametarea i dezvoltarea biosenzorilor. Fr ei nu am putea astzi s dezvoltm domenii ca: sisteme de detecie i identificare, recunoatere molecular, nanoparticule funcionalizate cu sisteme biologice, arii de senzori cu înalt sensibilitate i rspuns rapid, imagistic cu microscopia de baleiaj prin fore atomice- SPM (scanning probe microscopy) a structurilor biologice, detecia intracelular a biomoleculelor, ingineria nanobiointerfeelor. Dup cum se observ ne apropiem de punctul unde detecia unei singure molecule, determinarea in vivo cu precizie a proprietilor biologice i a interaciunilor specifice va fi posibil. Atingerea acestui el va permite cercettorilor, medicilor, tehnicienilor de: - A obine o detecie sigur a biomoleculelor în volume de probe minimale, evaluarea i diagnoza rapid din materiale neprocesate, direct prelevate- de exemplu diagnoza rapid a bolii sau detecia incipient a contaminrii biologice. - A studia ciclul de via în timp real a organismelor la nivel molecular, de exemplu pentru determinarea interaciei intracelulare a proteinelor virale cu celulele lor int conducînd astfel la o mai bun înelegere a bolilor asociate. - Investigarea dinamicii proteomice i astfel diferenierea cilor i a rspunsului celular la schimbrile din mediul ambiant. Astzi discutm i elaborm concepte despre: 1. Platforme de diagnostic: arii de biosenzori incluzînd acelea de a utiliza nanoparticule imobilizate i metode de identificare rapid cu cantiti minimale de probe de material. 2. Diagnostic imagistic la nivel molecular: utilizarea nanoparticulelor ca soluie alternativ de diagnostic în timp real a analizei intracelulare, imagistic medical cu nanoparticule. (Un capitol special în lucrare va fi acordat punctelor cuantice fluorescente ca elemente de identificare i analiz) 3. Caracterizarea structurilor i a proceselor biologice: utilizarea de instrumente cum ar fi SPM- cu sond nanometric pentru investigarea in situ a interaciilor biomoleculare i de aici îmbuntirea, perfecionarea înelegerii dinamicii celulare i a ciclurilor de via. 4. Senzori: detecia în timp real de biomolecule sau organisme cu aplicaii pentru dispozitive de diagnostic fie la distan fie în sistem ambulatoriu

2.3.1 Biocipurile i tehnologiile actuale ale secolului XXI

Ce este un Biocip? Un biocip este un dispozitiv ce conine o structur de elemente senzoriale individuale (biosenzori) interconectate dup funcii i specificiti de recunoatere, integrate pe 14

un cip. Numrul de biosenzori pe un cip poate fi de ordinul 106 uniti. În acest grad de integrare se pot realiza un imens set de teste distincte extrem de rapid i eficient. Biocipurile sunt adesea construite pe acelai principii ale microtehnologiei ca i microcipurile. În contrast cu microcipurile, biocipurile nu sunt în general structuri electronice ( dei ele pot conine diferite structuri electronice cuplate la elementele biosenzoriale). Premiza cheie a biocipurilor este aceea c ele pot realiza reacii chimice/ biochimice la micro i nanoscal. Fiecare biosenzor poate fi gîndit ca un "microreactor" care realizeaz a reacie chimic specific cu un analit. Biosenzorii din biocip pot fi realizai pentru a detecta o larg varietate de analii incluzînd ADN, anticorpi, proteine, biomolecule. Biocipurile în contextul micro i nanotehnologiilor Biocipurile în general sunt arii 2D de senzori plasai într-o reea specific cu coordonate bine precizate. De exemplu (figura 2.7) un senzor la coordonatele x-y de valoare (4,5) poate senza anticorpul pentru HIV, în timp ce senzorul la coordonatele (7,3) poate detecta anticorpul pentru virusul Influenza. Pentru a aranja senzorii în coordonate precise sunt abordate tehnici sofisticate de microdepunere de construire a unui lan sau o matrice de senzori. Tehnica microdepunerii este costisitoare i de randament sczut. O alt tehnic recent angajeaz tehnica indexrii dup funcia ce o îndeplinete i forma microbiosenzorului. Astfel senzorii pot fi plasai oriunde pe cip iar softurile de recunoatere de imagini pot fi utilizate pentru a citi biocipul. Dispunerea i formarea biosenzorilor pe cip este realizat prin microlitografie sau tehnologia ink-printing sau de contact-printing. Avantajele sunt multiple: 1. senzorii pot fi produi în loturi sau secvene care pot fi asamblai în paralel sau serial furnizînd un randament înalt de fabricaie. 2.Senzorii pot fi asamblai pe arii foarte mici, cu distane reduse între ei. 3. Pot fi generate structuri 3D furnizînd semnale mari fa de structurile 2D . 4. Poate fi încorporat orice tip de reacie biochimic 5. Senzorii pot fi produi separat i asamblai ulterior dup specificitate i natura aplicaiei. Iat un concept avansat de platform de diagnostic tip biochip (figura 2.7) pentru a detecta o clas de virusuri.

2.3.2 Biocipuri, nanobiotehnologia, nanomedicina

Implementarea cuceririlor din biologie chimia supramolecular i biochimie pe suportul nanotehnologiei i a instrumentelor de investigare la scal nanometric dezvoltate în fizic a generat noul domeniu, acela al nanobiotehnologiei, unde biosenzorii i biocipurile ocup un loc preferenial. Inferarea lor în medicin a generat noul domeniu: nanomedicina domeniul unde tehnicile non invazive i autoreparatorii sunt elementele eseniale ale viitorului medicinei. Curînd vom asista la sisteme i nanoroboi care vor lua locul chirurgiei i tratamentelor invazive: transportul dirijat al medicamentelor la int, nanoboi injectabili cu informaii precise ce vor repara organe, generarea intern de celule de biocombustie pentru întreinerea activitii inimii sau a sistemelor pulmonare, neuronale, reglarea glucozei din sînge de ctre celulele de biocombustie miniaturizate etc.

15

Figura 2.7- Arii de senzori interconectai prin nanofire (NW) ce pot detecta natura virusului care trece prin structura de microcanale dintr-un fluid biologic colectat. Fiecare arie de senzori detecteaz forma, dimensiunea tipul de toxin, activitatea specific, preluând un semnal de prezen (S) i un semnal de detecie specific

Cîteva din perspective sunt sumarizate, începînd de la faimoasa publicaie a lui Feynman: (Richard Feynman Plenary Lecture on Nanotechnology, 1963): 1. Electronica la scal molecular- manipularea electronilor pe structuri ADN i proteine, asamblarea lor în structuri cu proprieti electronice 2. Nanobioelectronica pentru biosenzori 3. Celule de biocombustie- sursa intern de energie ce consum glucoza sau alte polizaharide din sînge generînd energie elec-tric pentru biostimulatoare sau pentru reglarea dozelor din bolile de diabet. Ele sunt surse de convertire a deeurilor i biomasei în materiale rgenerabile ( agricultur, pesticide, etc). Celulele de biocombustie sunt componentele de baz în designul biosenzorilor microbieni. 4. Circuite bioelectronice 5. Arhitecturi supramoleculare la interfaa electrod-electrolit, pentru aplicaii în biosenzori 6. Detecia electrochimic a acidului 2,4 diclorofenoxiacetic sau a altor toxine, mirosuri, odorizante etc. ( nasuri electronice) 7. Nanostructuri polimere,1D-2D-3D, elemete suport în biosenzori, protezare medical 8. Microarii ca pori de legtur cu sistemele biologice. Interfeele neuronale artificiale 9. Dispozitive de calcul nanometrice formate din biomolecule cuplate cu interfee clasice i biologice 10. Optica nanometric în biosenzori i biotehnologie 11. Materiale nanocompozite, nanostructurate 16

Biocipuri, componente în alte tipuri de arhitecturi Asamblarea de peptide la interfee Dinamica i fluctuaiile ADN-ului Imprimare molecular Investigarea sistemelor de polimerizare electrochimic în procese sol-gel. Modificarea electrozilor prin funcionalizarea xerogelurilor anorganice 17. Biosenzori impedimetrici pe structuri de proteine i celule 18. Polimeri inteligeni: aplicaii la elaborarea de dispozitive bioanalitice 19. Investigri în timp real cu biosenzori în timpul operaiilor chi-rurgicale 20. Investigarea mediilor moleculare prin optica neliniar, lumi-niscen, etc Alte domenii transdisciplinare generate de biosenzori i nanotehnologii · Microarii, biocipuri, sisteme microbioanalitice · Neuroprocesoare- senzarea i procesarea In-Vivo i In-Vitro a semnalelor neuronale · Transportul electric prin ADN, · Cip genetic · Msurarea amperometric a exocitozei veziculare din neurotransmitori: descifrarea semnificaiei biologice i fizico-chimice Nanobiotechnologie i NanoBiosisteme · Nanoimprintarea biomoleculelor i a biosuprafeelor cu microscopia de fore atomice · Studiul relaxrilor în ADN cu "pensetele" optice (optical tweezers) · Recunoaterea de mono/oligonucleotide pe monostraturi de filme polimere. · Dinamica biopolimerilor, starea dinamic a motilitii pe baz de actin · Reglarea proteinelor motor, microtubule Nanobiotehnologie i Biosenzori · Monitorizarea noninvaziv a glucozei prin biocipuri ce controleaz ultrasonic pielea permeat · Arii de microace, cip-microfluidic pentru integrarea unei celule în sistem · Senzori colorimetrici pentru analiza bacterial · Senzori bacterieni pentru detecia metalelor grele · Efectul biorecunoaterii (bioafinitatea) i implicaiile asupra vieii cotidiene. Monitorizarea genotoxicitii în timpul degradrii fotocatalitice a paranitrofenolului. · Monitorizarea electrochimic a bacteriilor biotinilate denitri-ficatoare · Celule-biocip pentru detecia toxicitii Iat numai cîteva din domeniile unde biosenzorii au impulsionat cercetrile cu realizri notabile. Biosenzorii au propulsat domenii de grani i au creat noi domenii i tiine: chimia supramolecular; tehnici de autoasamblare; concepia de noi receptori sin17

12. 13. 14. 15. 16.

tetici utilizînd metode combinatoriale; imprintri moleculare (molecular imprinting); nanosisteme; ingineria proteinelor, acizilor nucleici i a zaharidelor ca receptori i sisteme catalitice; ingineria biomoleculelor capabile de a avea funciuni suplimentare cum ar fi transducia semnalelor (fire moleculare) sau transmiteri mecanice (motoare moleculare, brae moleculare; senzori cu acizi nucleici, cipuri cu ADN; imunosenzori, senzori pe structuri enzimatice; receptori naturali i sintetici; proteomica i analiza individual a celulei; bioelectronica, celule de biocombustie, sisteme nanoanalitice Dei aceste cuceriri ale tiinelor de grani apreau ca lucruri de neimaginat acum 20 ani totui avem cîteva elemente cheie de control care indiferent de scala de lucru sunt de o importan perpetu: selectivitatea, sensibilitatea, stabilitatea în proiectarea de sisteme senzoriale integrate cu structuri i aranjamente de elemente senzitive. Observm c indiferent ce concept se abordeaz în construcia i realizarea de biosenzori ne confruntm cu urmatoarele probleme: 1. Sterilizarea direct a biosenzorilor este imposibil; 2. Pentru calibrarea biosenzorilor sunt necesare msuratori discrete; 3. În majoritatea cazurilor, concentraiile compuilor depesc domeniile de rspuns liniar ale biosenzorilor; 4. Stabilitatea biosenzorilor este afectat de stresul mecanic i termic; 5. Sensibilitatea i reproductibilitatea: parametrii ce asigur bu-na funcionare a biosenzorilor, gradul de noninvazivitate. Merit în acest context s sumarizm o scurt retrospectiv a dezvoltrii istorice a biosenzorilor pentru a realiza conexiunea dintre fenomene fundamentale i tendinele actuale.

2.3.3 Scurt istoric ,,1986: ROYAL SOCIETY, Londra, s-au definit biosenzorii ca fiind dispozitive bazate pe cuplajul spaial direct al unui compus biologic activ imobilizat cu un traductor i un amplificator electronic". ,,as a compact analytical device incorporating a biological or biologically-derived sensing element either integrated within or intimately associated with a physicochemical transducer. The usual aim of a biosensor is to produce either discree or continuous digital electronic signals which are proportional to a single analyte or a related group of analytes".[2]

Succesul biosenzorului pentru determinarea de glucoz, a constituit placa turnant a exploziei biosenzorilor. El s-a dezvoltat datorit cerinelor extraordinare a bolnavilor de diabet i a abilitii biosenzorilor de a oferi o metod convenabil, igienic i compact de moni-torizare personal. Biosenzorii ofer un mare potenial de a detecta o larg varietate de analii în medicina curent specifice laboratorelor clinice sau tratamentelor în regim ambulator; în industria alimentar, în monitorizarea factorilor poluani din mediu. 1950 -1960 Electrodul Clark O problem deosebit de important in chimia analitic o constituia selecia i în particular, cea fcut la concentraii sczute i în prezena substanelor care interfereaz. 18

Determinarea sensibil i selectiv a unui mare numr de compui era i este în continuare foarte util pentru cercetrile tiintifice, ca i pentru unele ramuri industriale (chimic i alimentar). În domeniul snatii devenea indispensabil gsirea de metode pentru diagnosticarea unor boli iar senzorii cu o fin selectivitate i uor de manevrat devenise o problem cheie în perfecionarea analizelor de laborator. În aceast perioad o serie de senzori pe structuri solide erau folosii la determinarea parametrilor fizici cum ar fi temperatura, presiunea, energia sunetului dar analizele calitative i cantitative fcute asupra compoziiei chimice rmîneau dificile. Cele mai cunoscute în aceast etap erau pH-metrele care sunt puin aplicabile msurtorilor unor substane fiziologice importante cum ar fi: ureea, colesterolul. Ele au devenit utile în primele investigri în cazul macromoleculelor cum sunt: enzimele, anticorpii, sau microorganismele. Fiinele vii îns sunt capabile s se adapteze la schimbrile propriului lor metabolism i la mediul inconjurator cu ajutorul aa numiilor receptori care sunt alctuite din structuri proteice complexe i sunt, în mare parte, legate de membranele celulare. Ele posed o mare afinitate pentru factorii specifici, cum ar fi: hormoni, enzime sau anticorpii. Legtura dintre aceti factori determin activarea unor "cascade" de enzime, care provoac schimbri în proteina receptoare i o amplificare a semnalului. Aceste considerente erau oarecum bine statuate în aceast perioad dar pîn în 1956 nu s-a realizat nici un progres semnificativ de a gsi o metod de msurare. În 1956, pentru a simplifica msuratorile de glucoz s-a adoptat principiul hîrtiei folosit la determinarile de pH, [3]. Impregnînd o hîrtie de filtru cu enzime de glucoz, Free a obinut primul "test-fîie de enzime", care poate fi privit ca un predecesor al biosenzorilor optoelectronici. În aceast perioad se ridica necesitatea de determinare a coninutului de oxigen din sînge, respectiv a glucozei. Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod destinat a fi folosit pentru msurarea oxigenului dizolvat în sîngele bolnavilor operai. Acesta este format dintr-un electrod de platin i un electrod cu o membran de plastic permeabil la gaze. Polaritatea electrodului a fost astfel stabilit încît intensitatea curentului prin circuit s depind de viteza de difuzie a oxigenului prin membran, vitez ce este direct proporional cu concentraia extern a oxigenului. O dat cu electrodul Clark, considerat primul biosenzor, începe i clarificarea scopului i definiiei conceptului de biosenzor ce continu a fost modificat i reactualizat. Profesorul Leland C Clark Jr este considerat printele domeniului biosenzori. În 1956, Clark public articolul su despre electrodul de oxigen (discutat pe larg în [3]). Clark prin acumularea unei bogate experiene lanseaz în 1962 prin conferina susinut la Academia de tiine din New York o viziune general asupra conceptului de biosenzor i direciile de dezvoltare: "to make electrochemical sensors (pH, pola-rographic, potentiometric or conductometric) more intelligent" by adding "enzyme tran-sducers as membrane enclosed sandwiches".[4]

1962 Electrodul enzimatic

Clark extinde folosirea acestui "electrod de msurare a oxigenului" la determinarea nivelului de glucoz in sînge. El a ,,îmbrcat" senzorul pentru oxigen cu un strat subire 19

de gel ce contine un biocatalizator, enzima glucozoxidaza, urmat de o membran semipermeabil de dializ ce permite glucozei s difuzeze în senzor, dar oprete enzima s difuzeze. Cu cît intr mai mult glucoz, cu atît mai mult oxigen este consumat de enzim. Deci, o cantitate mic de oxigen existent se traduce prin existena unui nivel ridicat de glucoz. Clark i Lyons [4] introduc termenul de electrod enzimatic, adeseori greit atribuit de muli autori de recenzii ca fiind introdus de Updike i Hicks [5] care au avut meritul de a descrie experimental detaliile necesare de a construi un electrod cu enzim pentru glucoz. Prima descriere a unui biosenzor a fost realizat de Clark i Lyons în anul 1962, unde era prezentat de fapt un electrod de platin cu enzima oxidoreductaza, într-o construcie de sandwich. Anodul de platin polarizat la +0,6V, rspunde la peroxidul produs de enzim în reacie cu substratul. Acest tip de biosenzor deschide calea pentru msurarea glucozei din sînge.

1969 Senzori enzimatici, traductori poteniometrici

Guilbault i Montalvo [6] descriu un electrod-enzim poteniometric. Autorii descriu un senzor de uree folosind ureaza imobilizat pe un electrod-membran, selectiv la amoniac. G.Guilbault a in-ventat un sistem de masur pentru uree în fluidele corpului uman. Dispozitivul lui folosete enzima ureaza ce transform urea în bioxid de carbon i amoniac. Electrodul sesizeaz schimbrile concentra-iei ionilor de amoniu. Acest dispozitiv a constituit o îmbuntire pentru c se bazeaz pe o detecie poteniometric (senzor poteniometric). În timp ce senzorii de tip Clark msoar trecerea curentului prin electrod (senzor amperometric), senzorul poteniometric msoar tensiunea cerut pentru meninerea curentului la zero. Electrodul nu consum nici un fel de reactani de aceea este mai puin susceptibil la erori cauzate de schimbrile survenite în mediul extern. În plus, sistemul poteniometric are o curb logaritmic de rspuns astfel încît poate urmri o concentraie de peste 100 de ori mai mare în raport cu alte tipuri. Ulterior au fost folosite în construcia de biosenzori peste 100 de enzime. Cercettorii în domeniu au realizat c nu numai enzimele singulare se pot folosi, ci i esuturi ce reacioneaz la aminoacizi i la alte bio-molecule. De exemplu, folosirea pulpei de banan pentru msurarea dopaminei, miezul de porumb pentru piruvat, frunza de castravete pentru cistein, sfecla de zahr pentru tirozina, ficatul de iepure pentru guanina i pudra de muschi de iepure pentru monofosfat de adenozina. Rechnitz [7, 8] a mers i mai departe în folosirea unor pri din sisteme biologice; unul din senzorii si conine o antenul, un mic organ de sim, de la un crab albastru, supus diseciei pentru a folosi fibrele nervoase conectate la un electrod. Acest dispozitiv poate msura concen-traia unor droguri, precum i a toxinelor din mediu.

1970 Miniaturizarea electrozilor.

La începutul anilor "70" au fost perfecionai primii senzori enzimatici, cu indicaii calorimetrice iar ulterior s-au folosit indicatori optici [2]. Noile descoperiri din biotehnologie au perfecionat biosenzorii. În 1970, s-au construit multielectrozi miniaturizai pe un cip de siliciu [2, 8] ce poate realiza msurtori pe esuturi neuronale. Toate 20

cercetrile în acest sens au condus la adoptarea unei tehnici generale de combinare a componentelor chimice cu circuitele integrate intr-un singur sistem. Unii cercettori au miniaturizat biosenzorii electronici, alii au dezvoltat un întreg sistem bazat pe sensibilitate optic - în 1969, G.Vurek si R.Bowman [9] au demonstrat primii senzori pe fibre optice folosit la analize clinice.1970- Yellow Springs Instrument Co. (Yellow Springs, OH) comercializeaz primul senzor pentru monitorizarea glucozei

1974 Traductorii termici. Termometrele în variate forme, termorezistenele i termistorii au fost propui ca biosenzori prin imobilizarea de enzime pe suportul traductor i msurarea efectului termic datorit efectelor termice induse de reacia enzimatic. Biosenzorii cu traductori termici propui în 1974 au devenit termeni uzuali astzi ca sonde termice enzimatice [10] sau termistori enzimatici [11].

1975 Bioanalizoare de glucoz, senzori microbieni, optici

In anul 1975, DIVIES [12] a folosit o bacterie într-un senzor de alcool în timp ce GUILBAULT a construit în 1976, un NADH-senzor folosind o mitocondrie. Aplicarea modelelor enzimatice de mare stabilitate în biosenzori a oferit o nou alternativ enzimelor. În 1975 JANATA (citat în [7]) a realizat un "imunoelectrod". Ideile lui Clark devin realitate în 1975 prin lansarea de succes de compania Yellow Springs Instrument Company (Ohio) a analizorului de glucoz pe principiul deteciei amperometrice a peroxidului de hidrogen. Este perioada lansrii, în lume, a primului analizor de laborator. Biosenzori microbieni. În 1975 biosenzorii iau o nou rut evoluionar cînd Divies [12] sugereaz c bacteriile pot fi utilizate ca element biologic într-un electrod microbian pentru msurarea concentraiei de alcool. Articolul marcheaz începuturile eforturilor de cercetare din Japonia i ulterior în toate rile a aplicaiilor biosenzorilor în protecia mediului i biotehnologie. Optode. Lubbers i Opitz [13] introduc termenul de optod în 1975 pentru a descrie senzorul cu fibroptic ce are imobilizat un indicator pentru msurarea bioxidului de carbon i a oxigenului. Autorii extind conceptul dezvoltînd un biosenzor optic pentru alcool prin imobilizarea alcooloxidazei la o terminaie a senzorului cu fibr optic pentru oxigen [14]. Optodele comerciale au în prezent performane excelente pentru msurarea in vivo de pH, pCO2 i pO2, îns optodele enzimatice înc sunt sub lupa cercetrii fr a primi o larg audien comercial.

1976 Implementri noninvazive, mediatori pentru transferul de electroni

În 1976, Clemens i colab.[15] încorporeaz un biosenzor electrochimic de glucoz la un pancreas artificial marcînd implementarea comercial de ctre compania Miles (Elkhart) a Biostatorului. Biostatorul nu a fost comercializat pe scar larg el fiind înlocuit de un analizor de glucoz cu cateter continu - VIA Medical (San Diego). În acelai an La Roche (Elveia) introduce Lactate Analyser LA 640 în care mediatorul solubil hexacianoferatul este utilizat pentru transferul mediat de electroni de la lactat dehidrogenaza spre electrod. Cu toate c nu a cptat un uz comercial s-a deschis generaia biosenzorilor 21

cu mediatori în transferul de electroni cu aplicaii în analizorii de lactate pentru domeniul sportiv i aplicaii chimice. Un important avans pentru aplicaii in vivo a senzorului de glucoz a fost raportat de Shichiri i colabl.[16] ce descrie un electrod enzim tip ac pentru implantri subcutanate, 1982, un succes tiinific îns fr o valorificare comercial.

1980- 2000-2007

Imunosenzori, efectul SPR. Ideia construirii de imunosenzori cu fixare direct de anticorpi pe un traductor piezoelectric sau poteniometric a fost explorat din anii 70. Îns pavarea drumului spre un succes comercial este realizat de Liedberg et al. [17] descriind aplicarea fenomenului de rezonan a plasmonilor (SPR) pentru a monitoriza afinitatea reaciilor în timp real. 1987, MediSense (Cambridge, MA) introduce primul biosenzor pentru monitorizarea glucozei în regim ambulatoriu. BIAcore ( Pharmacia, Suedia), lansat în 1990 utilizeaz tehnologia SPR Ferocenii ca mediatori în electrozii enzim, aplicaii în ambulatoriu, microminiaturizarea În 1984, una din cele mai citate publicaii [18] anun un electrod enzim cu utilizarea ferocenilor i a derivailor si ca un mediator de imobilizare pentru oxidoreductaz. Acest principiu st la baza electrozilor enzim lansat de MediSense (Cambridge, USA) în 1987 ca un instrument de msur în form de creion pentru monitorizarea glucozei din sînge a pacienilor în regim ambulatoriu. Întreaga sa electronic a fost proiectat pe modelul de credit card în formatul unui "mouse-computer". MediSense a atins o cretere exponenial în vînzri (US$175 milioane) fiind ulterior adsorbit de Abbott. Companiile Boehringer, Mannheim i Bayer au în prezent biosenzori cu mediatori deinînd 85% din totalul pieei internaionale. Interesant c cele trei companii dezvolt tehnologii pe baza fotometriei de reflexie convenionale pentru diagnosticul ambulatoriu. Jurnalele academice conin descrieri de largi varieti de dispozitive exploatînd enzime, acizi nucleici, celule receptor, anticorpi, celule în combinaie cu traductori electrochimici, optici, piezoelectrici i termici [19]. În cadrul oricrei permutri în tehnicile traductorilor alte mirade de posibiliti apar în concepte de proiectare ale senzorilor rezolvînd diverse probleme din medicin [20], alimente i buturi [21], procese industriale [22], monitorizarea mediului [23], aprare i securitate (detecia drogurilor, explozivilor). Biosenzorii au început s fie folosii cu succes i în alte domenii decît cele medicale de exemplu msurarea necesarului de oxigen biochimic, ce reprezint un indiciu al prezenei materiilor organice din apa uzat. Biosenzorul bazat pe drojdie, realizeaz o citire a rezultatelor în 30 minute fa de 5 zile pentru a obine rezultatele prin metode conventionale. Biosenzorii sunt folosii i pentru a determina calitatea hranei i prospeimea ei. Cu mare succes sunt folosii în procesele industriale, pentru a determina compoziia chimic a materialelor. Aceste msurtori sunt importante în special în biotehnologie unde în mod curent nu se pot monitoriza culturile de microorganisme procese de fermentaie ce produc proteine active i alte pro22

duse ca interferon sau insulina. O larg gam de aplicaii sunt cuprinse într-o serie de monografii ce au condus la un important impuls al dezvoltrii biosenzorilor [24, 25, 26, 27 -34].

2.3.4 Referine

1 Theavenot Daniel R., Toth Klara,. Durst Richard A,. Wilson George S, Electrochemical Biosensors: Recommended Definitions and Classification Pure Appl. Chem., Vol. 71, 12, pp. 2333-2348, (1999) 2.Turner, A.P.F., Karube, I. and Wilson, G.S. Biosensors: Fundamentals and Applications. Oxford University Press, Oxford. 770p. (1987) 3 Clark, L.C. Jnr. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956). 4 Clark L.C. and Lyons C., Ann. N.Y.Acad. Sci., 102, 29-45 (1962) 5 Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967). 6 Guilbault, G.G. and Montalvo, J. JACS 91, 2164-2569 (1969). 7 Ho MYK, and Rechnitz GA, "An Introduction to Biosensors," in Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s, Nakamura RM, Kasahara Y, and Rechnitz GA (eds), Washington, DC, American Society for Microbiology, pp 275290, (1992). 8 Rechnitz GA, Chem Eng News, 5:2436, (1988) 9 Vurek G. si Bowman R ,Scientific American, August pag 48 (1991). 10 Cooney, C.L., Weaver, J.C., Tannebaum, S.R., Faller, S.R., Shields, D.V. and Jahnke, M. In: "Enzyme Engineering" (Eds. E.K. Pye and L.B. Wingard Jnr.) 2, 411-417. Plenum, New York. (1974). 11 Mosbach, K. and Danielsson, B. Biochim. Biophys. Acta. 364, 140-145 (1974). 12 Divies, C. Annals of Microbiology 126A, 175-186 (1975). 13 Lubbers, D.W. and Opitz, N. Z. Naturforsch. C: Biosci. 30c, 532-533 (1975). 14 Voelkl, K.P., Opitz, N. and Lubbers, D.W. Fres. Z. Anal. Chem. 301, 162-163 (1980). 15 Clemens, A.H., Chang, P.H. and Myers, R.W. Proc. Journes Ann. de Diabetologie, Paris (1976). 16 Shichiri, M., Kawamori, R., Yamaski, R., Hakai, Y. and Abe, H. Lancet, 1129-1131 (1982). 17 Liedberg, B., Nylander, C. and Lundstrm, I. Sensors and Actuators 4, 299-304 (1983). 18 Cass, A.E.G., Francis, D.G., Hill, H.A.O., Aston, W.J., Higgins, I.J., Plotkin, E.V., Scott, L.D.L. and Turner, A.P.F. Anal. Chem. 56, 667-671 (1984). 19 Turner, A.P.F. "Advances in Biosensors", I; II; Suppl. I; III. JAI Press, London, UK, 1991; 1992; 1993; (1995). 20 Alcock, S.J. and Turner, A.P.F. IEEE Engineering in Medicine and Biology, June/July, 319 (1994). 21 Kress-Rogers, E. "Handbook of Biosensors and Electronic Noses: Medicine, Food and the Environment", CRC Press, Boca Raton, USA, (1996). 23

22 White, S.F. and Turner, A.P.F. In: "Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation"(Eds. M C Flickinger and S W Drew). Wiley, New York, USA, (1997) 23 Dennison, M.J. and Turner, A.P.F. Biotechnol. Adv., 13, 1 (1999) 24 Kress-Rogers E, Handbook of Biosensors and Electronic Noses, Boca Raton, USA: CRC Press (1997) 25 Scheller F, Schmid R D, Biosensors:Fundamentals, Technologies and Applications, GBF-Monograph, vol 17, Germany, VCH, (1992) 26 Schmid R D, Scheller F, Biosensors Applicationsin Medicine, Environmental protection and Process Control, GBF-Monograph, vol 13, Germany, VCH, (1989) 27 Wagner G, Guilbault G G, Food Biosensors Analysis, New York, USA, Marcel Dekker Inc, (1994) 27. Cooper Jon M., Cass A. E. G., Cass Tony (Eds), Biosensors, Oxford Univ Press, pp268 (2004) 28. Marc Lambrechts & Willy Sansen,(Eds) Biosensors, Taylor&Francis, pp360, (2006) 29. Stamatin Ioan Berlic C. Vaseashta A., Thin Solid Films 495,1-2 pp 312-315, (2006) 30 Vaseashta A, Gallios G, Miroslava Vaclavikova, Brumfield James, Vaseashta Sherri, Ornprapa Pummakarnchana, Stamatin Ioan, Nanostructures in Environmental Pollution Detection, Monitoring, And Remediation, International Symposium on Nanotechnology in Environmental Protection and Pollution, ISNEPP2006, June 18 21, 2006 , The Hong Kong University of Science & Technology International Conference Center, China (http://www.isnepp.org/) 31. Vaseashta A., Irudayaraj J., Vaseashta S., Stamatin I., Erdem A. Approach To An Interdisciplinary Bionanotechnology Education Program: International Network Perspective, MRS-spring meeting 2006, symp KK, 0931-KK05-04, (2006) 32. Vaseashta A., Erdem A., Stamatin I., Nanobiomaterials For Controlled Release Of Drugs & Vaccine Delivery, MRS-spring meeting, symp S Smart Nanotextiles, MRS Proceedings Volume 920, 0920-S06-06 (2006) 33. Ciucu Anton, Biosensors For Environmental Monitoring. Ed Niculescu, Bucuresti, pg. 352, (2000) 34. Ciucu Anton, Aplicaiile Analitice ale Biosenzorilor în Controlul Polurii Mediului, Editura Ars Docendi, Bucureti, pg 175, (2000)

24

3.Stadiul dezvoltrii actuale în domeniul biosenzorilor

Componente i terminologie

Analit(A): Elementul necunoscut ce trebuie determinat Receptor(R): Molecula de biorecunoatere, elementul biologic/ biochimic care interacioneaz cu analitul printr-o reacie specific. Traductor: Elementul care detecteaz semnalul de la interacia analit-receptor Procesare de semnale: Preluarea de date credibile, eliminarea zgomotului, parametrizare.

Lanul de comand

Recunoaterea specific a analitului Transducia- transformarea efectului fizico-chimic a interaciei A-R într-un semnal msurabil Procesarea semnalului i amplificarea

Trstura unic a biosenzorului este aceea c încorporeaz un element biologic în proximitate sau este integrat cu traductorul de semnal pentru a da un sistem de investigare specific pentru un analit int fra a fi necesar reactivi suplimentari

25

26

3.1 Sisteme, arii de biosenzori, caracteristici de rspuns

Cinci arii cheie de dezvoltare a tiinei i tehnologiei sunt identificate ce au contribuit la facilitarea implementrii pe scar larg a biosenzorilor: sensibilitatea, selectivitatea, stabilitatea, sisteme integrate, paterningul (modelarea i multiplicarea ca arii de senzori cu funciuni i aplicaii multiple). Vom descrie acestea în ordine invers luînd în considerare stadiul actual i metodele moderne de analiz a semnalelor rezultate din interacia analit-receptor conform cu figurile 2.1, 2.2, 2.3.

3.1.1 Sisteme integrate

Succesele notabile atinse cu senzorii individuali prin soluii pragmatice au implicat dezvoltarea de sisteme care s integreze o gam larg i variat de senzori cu performane optimizate i suportate de electronic i software sofisticate. În procesele de monitorizare sistemele integrate au înglobat i multe elemente din fluidic i tehnologia separrilor/ fracionrilor. Unul din sistemele integrate cuprinzînd modul rotaional aseptic de prelevare probe, sistem de injecie de fluide robotizat i electrozi reutilizabil formai prin metoda ink-jet printing a fost descris în [1]. Sistemul conine electrod enzimatic cu GOX imobilizat în gel iar detecia de ap oxigenat se realizeaz pe un electrod de carbon rodinizat (acoperire cu Rh). Dei electrodul enzim are bune caracteristici de stabilitate i eficien, problema monitorizrii i prelevrii automate de probe într-un sistem integrat cere optimizarea de muli parametri datorit interferenelor reciproce. Exist o cerin crescînd pe domenii specifice (mediu i analize medicale) de sisteme integrate ultraperformante care s funcioneze în condiii in vivo cum ar fi cele de dializ iar mai recent s utilizeze biointerfee, tehnici evanescente, microscopie de fore atomice pentru a senza în adîncimea fenomenelor biologice (de exemplu identificarea i înelegerea interaciei proteinelor) [2]. Exploatarea in vivo a sistemelor de detecie atît pentru glucoz i lactat a fost confirmat prin eficacitatea utilizrii de copolimeri fosfolipidici i îmbuntirea hemocompatibilitii [3]. Imunosenzorii ofer un alt exemplu pentru dezvoltarea de sisteme integrate unde sunt înglobate microseparrile, metodele cromatografice, cuplaje electrochimice cu detectorii optici care în final conduc la un sistem miniaturizat. Sunt cî-teva din exemple prin care nivelul de integrare i miniaturizare devine din ce mai accen-tuat. În seciunile urmtoare se va prezenta unele dintre exemple de tipul ADN-nanotub, sau biocipuri-biointerfee care arat direciile de evoluie ale domeniului.

3.1.2 abloane

Succesul senzorilor analitici individuali a continuat dup cum s-a prezentat în seciunea anterioar cu sistemele integrate astzi larg utilizate în laboratoarele clinice medicale. Necesitatea integrrii i diversificrii parametrilor investigai impune crearea de arii de senzori într-o singur unitate de msur. Astfel a aprut necesitatea realizrii de modele de senzori dispuse pe arii i geometrii sofisticate utilizînd tehnologii avansate de fotolitografie, autoasamblare, ink-jet printing denumite tipare sau abloane (templates) ce îndeplinesc o serie de funcii predeterminate. 27

Metoda de asamblare de arii de senzori cu funciuni diversificate dar specifice pentru un set cît mai larg de analii se numete ablonare sau simplu astzi prin termenul asimilat de patterning. Tipare sau abloane de senzori ofer meniuri relevante pentru locaii i situaii specifice. Un exemplu în acest sens îl constituie situaiile critice din medicina ambulatorie. Clinicianul are la dispoziie instrumente portabile de la care poate obine informaii asupra concentraiilor a ase analii cheie din probele de sînge: iar în seciile medicale / spitale instrumentele pot msura pîn la 4 parametrii. Aceste instrumente sunt configurate pentru glucoz, lactat, uree, creatinin. Multiplicarea numrului de analii pentru investigare necesit instrumente cu senzori cu un mare grad de miniaturizare, integrare pîn la arii nanometrice. Aceste solicitri vin acum nu numai din domeniul medical, industria farmaceutic solicit intens senzori de evaluare medicamente produse în regim de producie de serie cu înalt productivitate i care necesit analiza fiecrui produs pentru anumite caracteristici bine precizate cum ar fi dozarea relativ la funciunea i rolul lor în organism. Ariile de nanosanzori sunt preconizate a fi larg utilizate în condiii de ambulatoriu i medicina de urgen unde trebuiesc identificai para-metrii fiziologici/ biochimici i stabilit medicaia de urgen. În prezent sunt dezvoltate tipuri de arii de senzori optici utilizînd 12 canale de interferometre de tip Mach-Zhender [4] construite pe 1cm2 de siliciu cu 244 electrozi adresabili individual. Tehnologia avansat ink-jet a dezvoltat metode de a analiza fracii de nanolitri pe o suprafa de senzori tridimensional la o vitez de 6m/sec [5]. Este de ateptat ca în viitor s se produc arii de 1 milion senzori/cm2 utilizînd fotolitografie, imprintarea prin contact sau tehnici de autoasamblare, adsorpie/desorpie sub fascicul laser ce va permite s "scriem" proteine pe suprafaa de analizat cu foarte mare precizie. Tehnici laser, MAPLE (Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation) sau DW (direct writting) abordate pentru imobilizarea materialelor biologice pe substraturi sunt înc în stadiul de laborator dar au mari perspective de utilizare ca metode de imprintare molecular.

3.1.3 Sensibilitate

Fie c sunt senzori individuali, sisteme integrate sau arii de senzori toi sunt caracterizai prin parametrii unici iar unul din acetia este sensibilitatea i limita de detecie pentru o gam de analii. Detecia de urme a diferiilor analii (indicatori, aditivi, contaminani) cu o suficient sensivitate i siguran sunt criteriile de baz a unui biosenzor pentru a fi utilizat. Desigur astzi limita de detecie în laborator este împins pîn la un atom atunci cînd este folosit microscopia de fore atomice. Îns în cazul biosenzorilor aceasta este pe departe decît un deziderat. De exemplu electrozii enzimatici, larg studiai i continu perfecionai utilizeaz înc paleative cum ar fi concentrarea analitului de interes ceea ce conduce la dificulti majore de proiectare i miniaturizare [6]. S-au raportat pe acest principiu microbiosenzori pentru vapori de fenol unde fenoloxidaza s-a imobilizat pe gel de glicerol cu o arie de electrozi interdigitizai [7]. Vaporii de fenol sunt direct partiionai în gel i oxidai la chinon. Amplificarea semnalului pentru a obine o sensibilitate rezonabil s-a îmbuntit prin amplificare redox a cuplului chinon/catechol rezultînd o limit de detecie de 30 ppb fenol. Acest 28

principiu este fezabil a fi extins i la ali compui carbonici pîn la limite de pri per trilion. Limite de detecie ultrajoase pot fi atinse cu senzorii de afinitate cuplat cu detecia electrochimic [8] pentru a obine dispozitive senzoriale performante. Structurile ADN au fost studiate ca posibili receptori. Structuri sandwich de dispersii de cristal lichid i compleci ADN-polication au fost studiate cu relativ succes pentru identificarea a diferii analii [9]. Policationul cu rol de a menine integritatea structural a ADN-ului iar complecii formai de ADN-protamine permit detectarea hidrolitic a enzimei tripsin la limita de detecie de 10-14 M. Eliminarea policationului conduce la creterea distanei dintre cele dou lanuri ADN rezultînd apariia unei benzi intense în spectrul de dicroism circular ca urmare a modificrii texturii.

3.1.4 Stabilitate

Practic este cel mai mare dezavantaj al complexelor biologice-instabilitatea lor inerent. S-au abordat diferite strategii de a îmbunti longevitatea i a prezerva structura receptorilor biologici. Imobilizarea în matrici prin tehnica sol-gel în optode pentru senzorii de glucoz este una din strategii. În acest caz se utilizeaz doi indicatori de fluorescen: clorura hexahidratat de (2,2'-bipiridil) rutenium(II) i 1-hdroxipirene-3,6,8 acid trisulfonic. Pe lîng proprieti optice bune ale gelului s-a îmbuntit i stabilitatea enzimei GOX [10].Alte exemple cu succese limitate este cazul monooxigenazei utilizat în detecia hidrocarbonilor; detecia halogenurilor organice cu metaloporfirine; tetraclorura de carbon, haloalchene (percloretilena) i insecticide (DDT) [11]

3.1.5 Selectivitate

Îmbuntirea selectivitii unui biosenzor poate fi abordat pe dou nivele: interfaare direct traductor-receptor biologic pentru reducerea interferenelor (figurile 2.12.4) i noi receptori cu afinitate îmbuntit sau cu noi capaciti de afinitate. De notat c selectivitatea este un parametru cheie care impune performanele unui senzor. Sunt cîteva strategii de îmbuntire a acestui parametru. Utilizarea mediatorilor pentru îmbuntirea performanelor unui biosenzor amperometric a devenit o strategie comun. În [12] se descrie utilizarea pirolochinonei ca mediator într-un electrod enzim cu glucozoxidaz pentru msurarea glucozei din buturi. Alternativ detecia electrocatalitic a produilor de reacie rezultai din reaciile enzimatice poate fi îmbuntit prin electrozi modificai chimic ca de exemplu electrozi rodinizai [13] sau electrozi de carbon modificai cu hexacianoferat [14]. De exemplu folosirea albastrului de prusia pentru modificarea suprafeei electrodului la detecia amperometric a apei oxigenate la ambele poteniale de oxidare i reducere pentru electrodul enzimatic în detecia lactatului [15] i a glucozei [14]. O soluie mult mai elegant este de a cuta centrii redox a enzimei via un fir molecular pentru a se realiza transferul de electroni spre electrod. În acest sens s-a publicat mult despre enzime legate prin fire moleculare dar în general preocuprile s-au axat pe mediatori imobilizai pe diferite lanuri polimerice. Firele moleculare sunt privite ca intermediari în transferul de electroni pe distane lungi fiind alctuite din grupuri de dou 29

piridine legate de tiofene cu lungimi diferite (tienoviolagen). Firele de acest tip pot fi folosite în conjucie cu tehnici de autoasamblare pentru a produce un electrod izolat care transfer electroni pe ci moleculare predeterminate [16]. Aceasta ar conduce la electrozi enzimatici liberi de interferene electrochimice. Modelarea i proiectarea asistat de calculator ne permite de a modela reaciile cu transfer de electroni, legarea receptorilor i interaciile acestora cu o mare acuratee. Aceasta îmbuntete înelegerea noastr a interfeei receptor/traductor permiîndu-ne astfel s dezvoltm noi tipuri de receptori cu selectivitate mare. Pentru a obine liganzi îmbuntii pentru utilizri în optosenzori cum ar fi glicohemoglobina (HbA1c), o nou peptid sintetic, aceasta a fost construit pe baz de librrie combinatorial chemometric format din 1 milion L-amino acid hexapeptid pornind de la 10 aminoacizi [17]. Librria de hexapeptide a fost selectat si analizat în raport cu HbA1c, HbA1b, HbAF, HbA0, i gsii liganzii secvenai. Liganzii individuali sau arii de liganzi în conjuncie cu tehnica de recunoatere a formelor sunt domenii ce vor contribui la cresterea selectivitii i stabilitii.

3.1.6 Parametrii de caracterizare a semnalelor biosenzorilor

Paragrafele precedente au introdus calitativ parametrii de care depinde rspunsul senzorilor în particular a biosenzorilor pentru a atinge performanele dorite. Interacia analit-receptor este preluat de traductor i transformat într-un semnal fizic. Figura 3.1 prezint tipurile de semnale ce pot fi preluate de la suprafaa unui biosenzor ca rspuns al interaciei A-R conform cu figurile 2.1-2.6. Semnalul fizic preluat de traductor este transmis spre lanul electronic de msur. Se observ din figura 3.1 c exist o varietate foarte larg de mrimi ce pot fi colectai de la traductorii biosenzorilor i transformate în semnale fizice. Procesarea semnalelor în general este adaptat din tehnicile standard acumulate din tehnologia siliciului. Pentru msurarea parametrilor chimici i fizici ( mas, concentraie, temperatur, indice refracie, cîmp electromagnetic, cureni, poteniale etc) ca rezultat al transferului interaciei A-R este necesar un traductor specific. Acesta este interfaa transmiterii procesele fizice, chimice i biologice care le transform în semnale spre procesare electronic, optic, stocare, comunicaii, integrare în sisteme web sau de supra-veghere. Orice interacie A-R implic un rspuns iar pentru fiecare set de valori rezult o curb de rspuns specific. Curba de rspuns este un rspuns calibrat a unui senzor ca funcie de msurandul respectiv aplicat la intrare (ceea ce rezult din interacia A-R). Mrimea msurat poate fi de orice natur dar pentru cei mai muli biosenzori unde interfaa este electrochimic sau electrooptic vom lua în considerare unul din parametrii: rezistena electric R sau inversul ei conductana (G=1/R), frecvena (f)-mult utilizat în fenomenele de rezonan; în cazul optosenzorilor, absorbana, deplasarea frecvenei, randamentul cuantic, etc. Pentru fiecare biosenzor vor fi analizai aceti parametrii în paragrafele destinate lor.

30

Figura 3.1 ­ Tipuri de mrimi ce pot fi transformate de ctre traductori în semnale fizice msurabile

Este recomandat conform normelor dezvoltate în micro i nanoelectronic s utilizm urmtoarele notaii pentru rspunsul la ieire [18]: · G (conductan); · G/G0 (conductan relativ); · (G - G0) (conductan, variaia absolut); · (G - G0)/G0 (conductan, variaia relativ). În cazul în care semnalul la ieire este frecvena, reprezentarea semnalului la ieire este: · f (frecven); · f/f0 (frecven relativ); · (f - f0) (variaia absolut a frecven); · (f - f0)/f0 (frecven ,variaia relativ). Pentru comunicaii i integrarea sistemelor senzoriale spre telemedicin, securitatea i controlul de la distan a modificrilor mediului sau controlul degradrii mediului, în lanul de msur trebuiesc introduse sensibilitile blocurilor electronice sau a altor mrimi, figura 3.2

31

Figura3.2 - Schema unui senzor complex. M- mrimea rezultat din interacia (msurandul) A-R, Y1- semnalul electric obinut la traductor, Yi- semnalele rezultate din lanul de msur. S-sensibilitile pentru fiecare verig din lanul de msur

Cu definiiile din figura 3.1 i 3.2 sensibilitatea, introdus calitativ în paragraful 3.1.3, capt semnificaii msurabile. Sensibilitatea, S, este definit ca derivata rspunsului ( ce este o funcie de punctul i momentul de msur) în raport cu msurandul M. Pentru cazul conductanei G avem patru cazuri de definiie a sensibilitii:

dG ; dM d ( G/G 0 ) S= ; dM d ( G-G 0 ) S= ; dM S=

3. 1

Cazul ideal pentru care rspunsul senzorului este liniar expresia sensibilitii se simplific, relaiile 3.1 luînd forme uor prelucrabile i adaptabile la o larg serie de convertori analog digitali (ADC). În tabelul 3.1 sunt prezentate expresii des utilizate în evaluarea biosenzorilor în condiii de offset nul. Pentru ali parametrii msurabili de un biosenzor cum ar fi frecvena sau absorbana expresiile din tabela 3.1 se modific doar prin înlocuirea mrimii msurate de traductor.

32

Tabela 3.1- Expresii ale sensibilitii pentru biosenzori cu rspuns liniar în conductn electric Rspuns liniar pe poriuni a curbei Rspuns liniar cu offset nul de rspuns G G S= ; S= ; M M ( G - G0 ) G - G0 S= ; S= ; M M ( G - G0 ) / G0 ( G - G0 ) / G0 ; ; S= S= M M

Cu referire la figura 3.2 se observ c introducerea în lanul de msur a o serie de componente electronice acestea la rîndul lor contribuie cu sensibilitatea i nivelul de amplificare specific. Propagarea sensivittii în lanul de msur se descrie simplu ca un produs de sensibiliti.

dY1 - S interna; dM dY S T = 2 - S traductor; dY1 Si = SA = SF = dY3 - S- amplificator (I,V,G,R,etc); dY2 dY4 - S- filtru; dY3 dYies - S- convertor analog-digital; dY4

3. 2

S A/ D =

Sensibilitatea general a biosenzorului se estimeaz astfel:

S= dYies dY1 dY2 dY3 dY4 dYies = × × × × dM dM dY1 dY2 dY3 dY4 = Ai × AT × AA× AF × AA/D

3. 3

Unele din aceste definiii se vor utiliza pentru cazuri specifice de clase de biosenzori.

3.1.7 Zgomot, rezoluie, drift

Zgomotul este un factor important ce afecteaz sensibilitatea, selectivitatea i rezoluia biosenzorilor. În situaii practice sunt prezente diferite tipuri de zgomote care sunt legate de modul de operare sau de punctul de msurare a biosenzorului: zgomote termice, electrochimice, de contact electric, fluctuaii, generare-recombinare sarcini electrice, bariere de potenial aleatorii. Toate aceste tipuri de zgomote nu sunt generate simultan într-un biosenzor, ele sunt dependente de natura interaciei A-R i de lanul de m33

sur în care este integrat traductorul. Orice tip de zgomot este caracterizat prin densitatea spectral i descris printr-o funcie S(f) ce reprezint ptratul tensiunii de zgomot la o frecven dat. Pentru un domeniu de msur unde se realizeaz înregistrarea semnalului i pe o gam de frecvene de interes (f1-f2) unde se manifest zgomotul atunci se estimeaz valoarea medie a ptratului tensiunii de ieire:

V 2 = s( f )df

f1 f2

cu s( f ) = 4kTR, pentru zgomot termic s( f ) = 2qI , pentru acumulari/descarcari spontane de sarcina s(f)=kV 2 / f , 1; pentru fluctuatii de sarcina k1k2 s(f)= pentru generare-recombinare sarcini 1 + w2 2

3. 4

parametrii reprezentînd caracteristicile fiecrui proces ce produce un anumit tip de zgomot: k-constanta Boltzman, q-sarcina electric, I-curent, R-rezistena electric, V-tensiunea de zgomot, - timp de recombinare Rezoluia este definit ca fiind cantitatea de msurand care produce un semnal de zgomot pentru o tensiune de ieire. Definiia rezoluiei se exprim:

R= tensiune zgomot S

3. 5

unde S este definit în 3.2. Se observ c senzorii cu sensibiliti mai mari ce produc zgomote egale reprezint o soluie practic important. În practic relaia 3.5 se reconsider acceptînd zgomote de 3, 6, 9 ori mai mari fa de relaia de evaluare teoretic 3.5. Aceasta este în funcie de nivelul de precizie al msurtorilor ce trebuie realizate cu un senzor. Driftul reprezin deplasri fluctuante, nepredictibile, a semnalului la ieire. Nu are semnificaie statistic. Prezena sa poate fi redus printr-un design adecvat al componentelor biosenzorului. Driftul se accentueaz pe msura îmbtrînirii componentelor biosenzorului. Analize detaliate asupra rolului acestor parametrii se pot gsi în diferite referine specifice microtehnologiei semiconductorilor. Particular pentru senzori i biosenzori se pot consulta [19, 20,21, 22].

3.2 Componentele biologice ale biosenzorilor

În capitolul 2 s-a prezentat evoluia noiunii de senzor cu o larg extindere spre inter i transdisciplinaritatea domeniului. În aceast seciune se vor descrie succint componentele biologice ale biosenzorului ca element activ imobilizat pe membran (fig 2.3) i proprietile specifice cerute în contextul general al parametrilor de caracterizare i componentelor sale. Dei aceast parte este bine dezvoltat în domeniul tiinelor vieii 34

iar celelalte componente constituie arsenalul micro i nanotehnologiilor considerm oportun o succint prezentare a elementelor necesare pentru dezvoltarea conceptelor ulterioare. Vom accepta ca o definiie general: un senzor ideal este un dispozitiv care va detecta un "analit", inta supus analizei i care este prezent într-o prob dat. Majoritatea probelor conin i ali "analii" care pot interfera cu rspunsul biosenzorului. Acesta trebuie s posede o selectivitate specific pentru a identifica "analitul" int. Prin urmare este necesar s se proiecteze biosenzori cu selectivitate pentru un "analit" cu capacitatea de discriminare a interferenelor produse de ceilalali componeni din proba analizat. Capacitatea de identificare i selectivitate specific reprezint componenta cheie a recunoaterii moleculare. Recunoaterea molecular se realizeaz prin componenta din senzor format din o molecul gazd (de exemplu, host-chemoreceptor) ce se leag selectiv cu "analitul" (guest) int (molecula/ complexul molecular ,,oaspete") ce necesit a fi identificat. Pentru fiecare sistem ,,host-guest" (gazd-oaspete) întotdeauna exist o reacie chimic specific din multitudinea canalelor de reacie posibile. Cînd ansamblul host-guestreacie specific a fost identificat atunci molecula gazd se imobilizeaz sau încorporeaz în senzor, de regul pe o membran ce interfaeaz traductorul sau un electrod de contact. În final, trebuie gsit un mod de a semnala c evenimentul de legare/ recunoatere a avut loc (transducia spre traductor). Figura 2.3 schieaz toate aceste aspecte într-un concept unitar

3.2.1 Principiile recunoaterii moleculare

Una din cerinele cheie pentru recunoaterea molecular este existena gruprilor sau de centrii cu reactivitate specific din molecula gazd care pot "închide" sau lega ioni, atomi, molecule, biomolecule. Exemple pentru acest fel de sisteme gazd-oaspete cu capaciti de recunoatere pot fi vzute în procesele din viaa cotidian. Toate organismele vii folosesc enzime, care sunt proteine ce conin "buzunare", centre active, proiectate s recunoasc un analit specific. Acest lucru înseamn c numai un analit specific este capabil s intre în buzunarul enzimei. Enzimele pot fi folosite în biosenzori ca elemente receptoare gazd cu capacitate de recunoatere molecular, dar sunt în general instabile[23,24]. Este astfel necesar s se sintetizeze clase noi de macromolecule/ biomolecule care sunt capabile s joace rolul de molecule gazd-receptoare. Pentru a proiecta molecule gazd ce pot fi folosite într-un biosenzor sunt luate în considerare urmtoarele criterii: · Molecula gazd trebuie sa fie stabil la condiiile în care va fi folosit · Trebuie sa fie capabil s lege selectiv analitul din prob · Trebuie sa fie capabil s fie imobilizat într-un film/membrana care este în contact cu proba. · Trebuie s semnaleze c un eveniment de legare gazd-oaspete a avut loc · În mod ideal trebuie s elibereze analitul dup detectare astfel încît gazda s fie liber pentru a fi reutilizabil. 35

Receptori Sintetici

Receptorii biologici includ: anticorpi, receptori membranari, enzime, ribozomi, lectine etc. Ei leag analiii utlizînd mecanisme de recunoatere molecular de tipul "lock-and-key" (cheie-lact, identificare-imobilizare), figura 3.3. Receptorii biologici în general nu sunt soluii practice pentru multe aplicaii deoarece specificitatea, sensibilitatea i stabilitatea nu pot fi optimizate. Receptorii artificiali sunt medii de imobilizare care pot fi optimizai prin proiectare molecular pentru orice tip de aplicaie. Figura 3.3 arat pe un model generat c numai un tip de receptor are specificitate i reacioneaz la un analit-protein, ceilali rmîn neutri. Proiectarea i sinteza receptorilor sintetici se bazeaz pe instrumentele dezvoltate de proteomic i ingineria genetic producînd componente de recunoatere ce pot rspunde la apariia i identificarea unor boli necunoscute, în bioterorism, la dezvoltarea de medicamente anticancer, antivirale, kituri de testare rapid, diagnostice clinice i veterinare. În prezent se dezvolt platforme i arii de receptori artificiali fundamentate pe tehnici de matematic combinatorial, biologia interfeei, chimia suprafeelor. Acestea au indus dezvoltarea de diverse medii de receptori artificiali cu capacitate de selecie rapid i diversificat pentru orice analit Figura 3.3- Model, generat de computer, program Accelrys int. Developer Studio. Numai un Tehnica actual de producere a receptorilor tip de receptor identific sintetici se numete CARA- combinatorial array of proteina din analit, model lockreceptor analysis. Se vor prezenta cîteva exemple de and-key, tehnica CARA recunoatere molecular pe structuri relativ simple de receptori sintetici, macrocicluri cu capacitate de imobilizare i identificare pentru ioni metalici. Aceste exemple vor crea o baz mai profund de a înelege mecanismele implicate în biosenzori cu enzime, anticorpi, celule etc., unde joac un rol important de sisteme receptor. Chimia supramolecular a dezvoltat o gam variat de macrocicluri [25, 26, 27] cu rol de receptori sintetici. În figura 3.4 sunt descrise clase variate de macrocicluri. Cea mai comun caracteristic pentru clasele de macrocicluri este c ele conin caviti ce se comport ca buzunare gazd pentru moleculele oaspete. Selectivitatea gazdelor poate fi realizat în modul de ,,citire" prin variaia mrimii cavitilor preformate. De exemplu, 12-crown-4 are o cavitate mic ideal pentru legarea ionilor mici cum ar fi Li+, în timp ce18-crown-6 are o cavitate mare care se potriveste mai bine ionilor mai mari cum ar fi K+. Este evident c mrimea cavitilor este important pentru selectivitatea gazdei, dar rmîne întrebarea ce anume atrage un ion sau molecul într-o cavitate preformat i ce factori stabilizeaz complexul gazd-oaspete [28]. 36

În enzime, interaciile necovalente slabe (legtura de hidrogen, electrostatic, dipol-dipol, van der Waals, -) sunt folosite s lege oaspetele în buzunarul enzimei. Aceste interacii stabilizeaz interacia gazd -oaspete. Macrociclurile descrise în figura 3.4 conin functionaliti polare care sunt capabile de interacie cu oaspeii prin legtura de hidrogen, interacii electrostatice i interacii dipol-dipol. Este de asemenea de dorit ca legarea din cavitate s nu fie prea puternic, pentru c este important ca analitul, oaspetele, s fie eliberat din gazd dup ce a fost detectat i msurat. Eterii crown i calixarenele sunt ideali pentru legarea cationilor metalici, lucru bazat pe mrimea cavitii lor dar i pe densitatea mare de electroni prezent pe atomii de oxigen din cavitate.

Figura 3.4- Clase de macrocicluri cu caviti de diametre diferite i reactiviti specifice

În figura 3.5 este prezentat structura tetraetilestercalix[4]arena. Acest compus a fost preparat din macrociclul de baz calix[4]arena prezentat în figura 3.4. Dei compusul de baz leag selectiv Li+ fa de ali cationi metalici [29, 30, 31], versiunea modificat a mocrociclului de baz are o selectivitate foarte bun pentru Na+. Astfel prin modificare sintetic este posibil s se mreasc capacitatea cavitii gazdei i pot fi introduse funcionaliti noi care vor favoriza legarea unor molecule i ioni specifici. Alt exemplu de calixarene modificate, care demonstreaz mai mult acest principiu, este grupul de tetrafosfinoxid de calix[4]arena (figura 3.5).

37

Tetraetilestercalix[4]arena

Tetrafosfin oxid de calix[4]arena

Figura 3.5-Cavitatea tetraetilesterului este selectiv pentru sodiu în timp ce cavitatea oxidului tetrafosfinic este selectiv la calciu

Schimbînd grupurile de legare asupra aceluiai ablon calix[4]arene din esteri în oxizi de hidrogen fosforat, se schimb selectivitatea de la Na+ la Ca2+. Mrind numrul de uniti repetabile în esteri i oxizi de hidrogen fosforat la ase, crete capacitatea cavitii iar selectivitatea se schimb în favoarea cationilor mai mari cum ar fi Cs+ si respectiv Pb2+. Acest tip de senzori a fost folosit la detectarea cationilor metalici de interes biomedical i pentru mediul înconjurtor. Unii compui gazd au fost dezvoltai de asemenea pentru detectarea selectiv a moleculelor neutre mici fr sarcin. S-a decoperit c structurile de calixarene au aplicaie larg în acest domeniu [5,6]. Un exemplu implic folosirea amidei de tetra-(S-propanol) calix[4]arena ce conine patru jumti chirale laterale pentru diferenierea selectiv dintre enantiomerii de fenilalanilol. Structura acesteia este prezentat în figura 3.6 Alte tehnici ale chimiei supramoleculare pot fi angajate în sinteza de receptori sintetici ce simuleaz proprietile enzimelor. Amintim structuri de baz ce pot fi modificate: porfirinele, polimerii semiconductori din clasa tetrahialofulvenelor, poliacene, PPV (poliparafenilvinilidene). Alte abloane pot fi considerate polizaharidele modificate. Un arhetip liniar sunt polianilinele ce conin cele dou tipuri de stri redox

38

Figura 3.6-Model, vedere lateral, a complexului format de S-fenilalanilol i amida de S-propanalol calix[4]arena (model generat cu MacroModel v 6.0

Bazele moleculare ale interaciunii Ag-Ac

Dintre multiplele clasificri ale biosenzorilor cei de bioafinitate au o larg gam de aplicaii iar interaciunile antigen-anticorpi (Ag-Ac) joac un rol important i din ce mai mult sunt considerate un important instrument în dezvoltarea principiilor de recunoatere molecular. Prezentm în continuare noiunile strict legate de biosenzori. Interaciunile Ag-Ac, in vivo sunt întotdeauna reversibile. Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt: · Complementaritatea structural dintre determinantul antigenic i situsul de combinare al anticorpului. Acesta este factorul exclusiv al specificitii reaciei. Complementaritatea structural presupune adaptarea conformaional a celor dou grupri reactante i a fost gîndit în termeni structurali, pe principiul cheie-lact similar cu mecanismul descris anterior · Complementaritatea chimic a gruprilor reactante este consecina complementaritii structurale i semnific intrarea în aciune a unor fore intermoleculare care stabilizeaz i consolideaz interaciunea celor dou grupri. Formarea legturilor intermoleculare necesit existena unor grupri atomice suficient de apropiate pe cele dou molecule. Distana dintre ele este invers proporional gradului de complementaritate. Dei complementaritatea structural nu este strict obligatorie, o potrivire spaial cît mai înalt este mai favorabil interaciunii. Ea se exprim prin congruena suprafeelor de contact care furnizeaz fore de atracie intermolecular ce stabilizeaz complexul. 39

La interaciunea Ag-Ac particip urmtoarele tipuri de legturi necovalente: legturile de H, forele electrostatice, legturi van der Waals i legturi hidrofobe. Toate sunt fore nespecifice cu valoare mic i natura lor face ca reacia s fie reversibil.(figura 3.7)

Figura 3.7- Interacii specifice Ag-Ac

Legturile de H se formeaz cînd doi atomi au în comun un nucleu atomic de H (un proton). Protonul comun se gsete între doi atomi de N sau de O sau între unul de N i unul de O. Nucleul de H este legat covalent de unul dintre cei doi atomi (de N sau de O). Legtura de H are energia de legare de 3-7 kcal/mol. Forele intermoleculare implicate în formarea complexului Ag-Ac. Aciunea acestor fore necesit un contact strîns între cele dou grupri reactante. Legturile de H rezult prin formarea unei puni de H între doi atomi apropiai. Forele electrostatice se datoreaz atraciei grupelor ionice cu sarcini opuse situate la periferia celor dou lanuri proteice. Forele Van der Waals rezult prin interaciunea între diferii nori electronici, reprezentai sub forma dipolilor oscilani. Legturile van der Waals, cele mai slabe fore de interaciune, sunt active pe distane foarte mici dintre gruprile reactante. Energia de legare este de 1-2 kcal/mol. Legturile Van der Waals nu se bazeaz pe o separare permanent a sarcinilor electrice, ci pe fluctuaii ale acestora, induse de apropierea moleculelor. La o distan intermolecular limit se formeaz cîmpuri electrice instantanee, cu efect polarizant asupra moleculelor învecinate. Între atomii suficient de apropiai, apare o for de atracie reciproc indus de sarcina dipol fluctuant, pe care un dipol o induce în dipolul învecinat. Aceste fore se mai numesc i fore de dispersie. Intensitatea lor depinde de distana dintre gruprile implicate i este invers proporional cu puterea a 7-a a distanei. Valoarea lor este optim la 1-2 Å. 40

Legturile hidrofobe, care pot contribui cu jumtate din fora de legare Ag-Ac, sunt produse prin asociaia gruprilor nepolare i hidrofobe, de unde moleculele de ap sunt excluse. Distana optim dintre gruprile reactive variaz cu tipul de legtur. Forele electrostatice (coulombiene sau ionice) sunt rezultatul atraciei dintre atomi sau dintre grupe de atomi cu sarcin electric opus, situate pe cele dou grupri reactante: de exemplu, între un cation (Na+) i un anion (Cl-) sau între COO- i NH3+. Energia de legare a acestor fore este semnificativ la distane foarte mici (sub 100 Å) dintre gruprile reactante. Juxtapunerea exact a ionilor favorizeaz aciunea acestor fore. Energia de legare este de 5 kcal/mol i variaz invers proporional cu ptratul distanei dintre cele dou grupri reactante (1/d2). Legturile hidrofobe (sau apolare) apar între grupri nepolare (neionizate) în soluii apoase i sunt consecina tendinei de excludere a reelei ordonate de molecule de ap, dintre molecula de antigen i cea de anticorp. Aceste legturi sunt favorizate de aminoacizii cu grupri apolare, care au tendina de asociere, diminuînd numrul moleculelor de ap din vecintatea lor. Prin eliminarea moleculelor de ap dintre gruprile reactante, distana dintre situsurile active scade foarte mult i crete valoarea forelor stabilizatoare. Complementaritatea spaial sau forele intermoleculare nu sunt, fiecare în parte, suficiente pentru a forma legturi stabile. Pentru stabilitatea interaciunii Ag-Ac sunt necesare ambele condiii. Cu cît energia de legare a reactanilor este mai mare, cu atît complexele Ag-Ac sunt mai stabile. Interaciunea gruprilor reactante ale antigenului i anticorpului este definit de doi parametri: afinitatea i aviditatea anticorpilor. Msurarea afinitii anticorpilor se poate realiza prin dializa la echilibru (figura 3.8). Interaciunea Ag-Ac este reversibil. În interiorul sacului de dializ, haptena este parial sub form liber i parial legat cu anticorpii, în funcie de afinitatea anticorpilor. Prin membrana sacului de dializ poate difuza numai haptena liber i concentraia sa extern va egala concentraia haptenei libere din interiorul sacului. Msurarea concentraiei haptenei în sacul de dializ permite calculul cantitii de hapten legat de anticorpi. Reînoirea constant a tamponului duce la disocierea total i la pierderea haptenei din sacul de dializ, ceea ce denot natura reversibil a legturii Ag-Ac [32]. Afinitatea anticorpilor msoar fora de legare dintre un determinant antigenic i situsul complementar de legare la un anticorp specific. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie Figura 3.8-aranjament experimental pentru i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani. msurarea prin Tria acestor interaciuni se msoar în reacia dintre un dializ a interaciunii Ag-Ac antigen monovalent ( haptene) cu anticorpii specifici. O interaciune cu afinitate înalt presupune structuri complementare perfecte în timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i 41

sunt diminuate de forele de respingere. Complexele Ag-Ac formate de anticorpi cu afinitate mic, persist în circulaie i se depun pe membrana bazal a glomerulilor renali. Complexele formate de anticorpii cu afinitate mare se elimin rapid din circulaie, fr efecte defavorabile asupra funciei renale. Interaciunea Ag-Ac este caracterizat permanent prin formarea i anularea diferitelor tipuri de legturi intermoleculare. In vivo, probabil toate reaciile Ag-Ac sunt reversibile, dar reaciile secundare, in vitro (aglutinarea, precipitarea), în condiiile echilibrului reactanilor, sunt ireversibile.

3.2.2 Imobilizarea moleculelor gazd

O dat ce un compus receptor a fost dzvoltat pentru identificarea unui analit specific este necesar ca acesta s fie imobilizat în dispozitivul senzorial. Cea mai folosit metod este incorporarea moleculei gazd în membrane flexibile de polimeri fixate pe suprafaa senzorului. Majoritatea membranelor sunt formate fie turnate din soluie de polimeri sau polimeri plastifiai i preformai în filme subiri. Polimerii utilizai sunt în general solubli în solveni organici uzuali. Este esenial ca receptorul-molecula gazd s fie solubil într-o varietate de solveni organici. Aceasta se obine prin introducerea de grupri lipofile cum ar fi t-butil în calixarene. Problemele acestor metode de imobilizare apar cînd membranale intr în contact cu proba (care este de obicei apoas). S-a constatat c moleculele gazd se filtreaz în timp din membrane micorînd astfel perioada de via a senzorului. O modalitate de a evita aceast problem este s se lege covalent molecula gazd în polimerul membranei. Aceast abordare poate fi destul de greoaie din punct de vedere sintetic pentru c trebuie încorporate unitile reactive in molecula gazd, care poate afecta selectivitatea. În cazul în care gruprile reactive au fost introduse în molecul acestea pot fi folosite s lege covalent gazda în polimeri i la suprafeele substratului (de exemplu silice) cu cuplare simultan la electrod (platina). Detalii asupra tehnicilor de imobilizare sunt descrise în [33]. Alte tehnici de imobilizare abordate în prezent sunt: ink-jet printing, polimerizrile în plasm, transport electroforetic, electro-polimerizrile, fiecare cu avantaje specifice.

3.2.3 Transducia semnalului

Aa cum a fost menionat anterior, este esenial ca evenimentul de legare dintre gazd i oaspete (interaciunea receptor-analit, R-A) s fie detectat. Este astfel necesar s fie disponibil un mod de identificare i transducie a semnalului provenit de la evenimentul interaciei receptor-analit spre exterior pentru a fi prelucrat sau procesat. Acesta este în termen general definit ca traductor. Prin urmare traductorul trebuie s fie în contact intim cu receptorul sau membrana ce a imobilizat receptorul. Electrozii, interaciile interfaciale sunt determinante în captarea semnalului de la o interacie R-A i transformarea acestuia în semnal electric sau fotonic. Exist diverse moduri de identificare a evenimentului R-A, colectare de semnal i transducia lui spre exterior ca semnal electric. Modul de identificare a semnalelor i de transducie a acestora definete tipul de biosenzor. De exemplu dac interacia R-A este identificat prin metode 42

electrochimice atunci biosenzorul se va numi ,,Biosenzor electrochimic". Aceasta semnific imobilizarea receptorului pe un traductor electrochimic care msoar un curent ( metoda amperometric) sau o tensiune (poteniometric) între doi electrozi. Dac R este imobilizat pe un component optic atunci vom defini biosenzorii optici. ( cu fibr optic, de fluorescen, de absorbie, de rezonan plas-monic -SPR). Aceste metode de msurare i transducie a semnalului induce i clasificarea biosenzorilor ce va fi prezentat în detaliu în capitolele urmtoare. În continuare se va prezenta cîteva din aspectele generale legate de metodele de încorporare a elementului de transducie în gazd (elementul receptor). Pentru detecie, la majoritatea biosenzorilor electrochimici, este necesar ca membranele ce conin molecula gazd s fie plasate pe o suprafa a unui electrod care la legarea oaspetelui conduce la un rspuns electrochimic (figura 2.2, 2.3). Aceast abordare funcioneaz foarte bine cînd analiii int sunt specii încrcate cum ar fi cationii metalici. Din pcate moleculele neutre nu pot fi detectate din punct de vedere al transduciei electrochimice. Pentru a evita aceast problem s-au folosit cu succes metodele optice de detectare. De exemplu o gazd chiral în calixarene ce conine uniti de naftil, fluorescente. La legarea cu oaspetele are loc atenuarea fluorescenei ca rezultat al interaciei dintre grupurile naftil­fenil din gazd respectiv Figura 3.9- Calixaren fluorescent, gruprile analit. Atenuarea fluorescenei este propor-ional cu conpirenice ataate sunt centraia de analit. Metodele optice sunt deseori folosite suficient de libere pentru a pentru c ele ofer o sensibilitate mai mare decît tehnicile permite atenuarea fluorescenei la legarea electrochimice O calixaren ce prezint fluorescen la leNa+.[29] garea cu un analit este prezentat in figura 3.9 [34]. În absena analitului oaspete acest compus nu prezint fluorescen pentru c substituentul pirenic nu poate veni în contact cu substituentul nitrofenil invecinat (iar atenuarea fluorescenei are loc datorit interaciei lor). Totui în prezena ionilor Na+ este observat fluorescena, pentru c ionul Na+ intr în cavitate i se leag cu oxigenii din gruprile fenoxi i carbonil din gazd. Aceast legare induce o conformaie mai rigid îndeprtînd gruprile de nitrofenil de pirene prevenind atenuarea fluorescenei.

3.2.4 Tipuri de componente biologice

Din cele prezentate anterior rezult c biosenzorul este un sistem de analiz, bioelectronic care combin un traductor cu un component biologic ce se afl într-o interdependen specific. Biosenzorii utilizeaz sisteme biologice cu diferite nivele de recunoatere ale substanelor ce vor fi determinate. Primul pas în aceast interacie este formarea complexului specific al substanei biologic active, imobilizate, R (receptorul, substratul cu componenta biologic senzitiv) cu analitul A ( definit adeseori ca semnalul chimic). În tabelul 3.2 sunt prezentate succint scheme specifice dup care este conceput 43

un biosenzor în relaie cu natura receptorului i a semnalului chimic/ biochimic. Se constat c exist dou clase generale de biosenzori care sunt bazai pe rspunsul datorit bioafinitii dintre R cu A ce modific distribuia de sarcini electrice ce poate fi msurat cu traductori specifici, fie de consumarea substratului printr-o reacie specific a acestuia.

Tabela 3.2- Clasificare biosenzori dup acticvitatea biologic 2. Biosenzori metabolici 1.Biosenzori de bioafinitate

A + R AR

Modificarea densitatii electronilor Receptorul R 1. 2. 3. 4. 5. Colorant Lectina Apoenzima Anticorp Sistem de trans-port 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Semnalul chimic A Proteine Zaharide Glicoproteine Substrat Inhibitor Grup Prostetic Antigen Hormon Substrat Analog.

A + R AR P + R

Raspunsul chimic A 1. 2. 3. 4. 5. Substrat Cofactor Inhibitor Activator Activitatea enzimei

Consumarea substratului si formarea produsului Receptorul R 1. Enzime 2. Microrganisme 3. Microbi 4. Tesut Striat

Componenta biologic din care este alctuit elementul de recunoatere molecular (R) este reprezentat prin diferite specii active ce pot fi: enzime sau sisteme enzimatice, anticorpi (Ab) sau antigeni (Ag), receptori, populaii de bacterii sau celule eucariote, fragmente de esuturi, uneori chiar celule embrionare. Analiii sau substanele ce pot fi analizate (A) sunt: glucoza sau alte zaharuri, aminoacizi, alcooli, lipide, nucleotide. Ei pot fi identificai prin interacia lor specific sau poate fi masurat concentraia lor prin diverse metode. Atît R cît i A reprezint specii moleculare distincte, cu înalt specializare macromolecular (anticorpi, antigene, enzime, receptori, etc), sau sunt sisteme complexe (celule, esuturi, chisturi de protozoare, ou de parazii intestinali). Din cele prezentate mai sus i din tabela 3.2 observm c biosenzorii se pot clasifica în general în dou grupe dup componenta biologic. Senzori catalitici ce utilizeaz enzime, microorganisme sau celule pentru a cataliza o reacie cu o substan int. Senzorii de afinitate ce utilizeaz anticorpi, receptori i acizi nucleici ce se leag de o substan int. Reaciile sunt cuantificate prin traductori electrochimici, optici, evanesceni etc Dup componenta biologic activ ei pot fi subclasificai dup cum urmeaz: 1. Biosenzorul enzimatic. Enzimele sunt proteine cu înalt energie, caracterizate prin funcia lor catalitic. Moleculele de substrat modificate conduc la reacii de oxidare, reducere, hidroliz, ce pot fi msurate cu ajutorul biosenzorului enzimatic. Biosenzorul enzimatic produce un rspuns linear in funcie de concentraia substratului. 2. Imunosenzorul. Anticorpii sunt glicoproteine produse de sistemul imunitar la intervenia unui substane din exterior, antigenul. Teoretic este posibil producerea de anticorpi i fr s se identifice un antigen. Imunosenzorul este un senzor de mare sensibilitate. Principiul de funcionare se bazeaz pe interaciunea Ag-Ac, descris la paragraful anterior, de recunoatere molecular (3.2.1) 44

3. Biosenzorul cu receptori Normalitatea proceselor biologice este asigurat de procese moleculare de sensibilitate mare bazate pe specializarea unor proteine structurale, numite receptori capabile de a recunoate un numr de semnale fiziologice. Este i cazul neurotransmitorilor, a cror aciune este mediat prin prezena unor receptori în membrana plasmatic, în situsuri sau inte celulare. În acest caz activarea situsului biologic activ se face prin canalele ionice. Receptorul pentru acetilcolina este primul receptor cunoscut în feno-menele de neurotransmisie.(Un excelent studiu a fost prezentat de Costa M, Department of Physiology and Centre of Neuroscience, School of Medicine, Flinders University, Adelaide Australia, NATO-ASI,Il Ciocco,Italy Biosensors 2005, ,,Advances In Sensors; The Lessons From Neurosciences"). Acest domeniu este în stadiu de laborator cu rezultate notabile [35, 36,37, 38, 39, 40, 41,42 ,43, 44, 45, 46] 4. Biosenzorul bazat pe celule sau esuturi Msurarea speciilor moleculare în acest caz nu se rezum la interacia cu compuii de analizat, transformrile ce au loc pot fi msurate ca produi rezultai. Este de dorit s se opereze cu populaii de celule a cror ci metabolice principale s fie cunoscute. Un relevant exemplu este oferit de de biosenzorul L-arginina, care asociaz populaii de celule bacteriene de Streptococcus faecium în combinaie cu un electrod pentru amoniac. Arginina este metabolizat de microorganisme, dup schema din figura 3.10 [47 ]

Figura 3.10-Mecanismele pentru transformarea L-argininei prin intermediul Streptococcus faecium

Este dificil de obinut asemenea complexe de reacii în afara structurilor celulare. Asemntor cu utilizarea populaiilor celulare ca elemente senzitive se pot folosi fragmente sau pri de esuturi, vegetale sau animale. În acest caz, avantajul este mai mare, deoarece nu se fac eforturi suplimentare pentru meninerea celulelor viabile, într-un aranjament natural. Pentru biosenzorul de adenozin a fost propus un element biosenzitiv tisular, obinut din mucoasa intestinului subire de la un soarece. Pentru biosenzorul de dopamina, specialistii s-au orientat la pulpa fructului de banana, avînd in vedere c aceasta are proprietati biocatalitice remarcabile. 5. Biosenzori cu proteine redox. Proteinele redox sunt implicate în procese biochimice precum respiria celular i reaciile caracteristice sistemului de fotosintez. Principalele tipuri de proteine redox implicate i cunoscute sunt: 1. CITOCROMII, conin ionii de fier în grupul prostetic, iar citocromul "c" este implicat în transferul de electroni în mitocondrie. 45

2. FEREDOXINELE, conin ioni de fier i sulf, în combinaii dimerice ale cloroplastelor (2Fe-2S) feredoxina i combinaii tetramerice din feredoxina bacterian 2 (2Fe- 2S), implicate în procesele de fotosintez i respectiv de transferul ionilor fixai de azot. 3. PROTEINELE ALBASTRE, conin cupru legat de cel mai mic rest de cistein, implicat într-o structur tetraedric, cum ar fi plastocianina i azurina, ce mediaz transferul de electroni în fotosintez i posibil în reducerea nitriilor. 4. FLAVOPROTEINELE, conin un un grup prostetic i un cunjugat organic, sunt implicate în transferul proteinelor ca de exemplu flavotoxinele. Aceste proteine au un rol important în natur, datorit localizrii pe suprafaa lor a centrilor redox. Arhitectura subtil a moleculelor ofer selectivitate i specificitate acestor molecule în interacia lor cu alte proteine sau enzime, ca de exemplu structura citocromului "c". Fierul porfirinic (hemul), este situat în centrul moleculei i bine învelit sau ascuns, el este expus solvenilor într-o mica proporie de 0,06%, din totalul suprafeei moleculare. Proteina suport un potenial pozitiv de +9mV datorit excesului de resturi lizinice, bazice. Se manifest un moment de dipol de 324 Debye, ce produce un dezechilibru în balanul distribuiei spaiale a lanurilor acide. Un numr de resturi de lizin se distribuie în jurul solventului la care este expus centrul hemului ce interacioneaz cu proteinele redox [48].

3.2.5 Integrarea componentelor biologice în biosenzori

Recunoaterea specific a analitului, transformarea semnalului fizico-chimic produs de interaciunea cu receptorul într-un semnal electric, procesarea i amplificarea semnalului au fost desrise pe larg în seciunile anterioare, ele constituind elementele principale din alctuirea oricrui tip de biosenzor. Biosenzorii descrii în literatura de specialitate se subdivid în trei generaii (figura 3.11). La senzorii din prima generaie, biocatalizatorul este prins la suprafaa membranei i apoi acest aranjament este fixat pe suprafaa traductorului (fig 3.11a). Adsorbia sau fixarea covalent a componentului biologic activ la suprafaa traductorului permite eliminarea membranei semipermeabile, care este a doua generaie (fig.3.11b). Legarea direct a biocatalizatorului la dispozitivul electronic care traduce i amplific semnalul, cum ar fi tranzistorul cu efect de cîmp, st la baza miniaturizrii biosenzorilor care este a treia generaie (fig.3.11c). În funcie de natura imobilizrii i a interaciei dintre cele trei com-ponente A-R-membran-contact cu electrozii spre traductor i procesele din biosenzor au evoluat în funcie de generaie. Dei numrul i varietatea metodelor utilizate în cazul construciei biosenzorilor este foarte mare, totui cîteva principii fundamentale sunt în general valabile pentru toate tipurile. În primul rînd, specificitatea i selectivitatea este dominat de componenta biologic i este direct legat de natura ei: enzimele, anticorpii, microorganismele. Specificitatea deriv din legarea analitului la componentul biologic folosit ca receptor.

46

La baza acestei secvene dominant este reacia biochimic A-R i procesul de ciocnire dintre A i R. În al doilea rînd, tran-sportul analitului spre i prin suprafaa considerat spre R constituie de asemenea un factor important. Acest proces este legat de transportul unei mrimi fizice prin meca-nisme tipice de difuzie, migraie, convecie. În al treilea rînd, semnalul senzorului este dependent reaciei A-R presupus a fi la o vitez constant. Strile tranzitorii i condiiile de pseudoechilibru biochimic, sunt dominate de cinetica reaciilor, natura transportului care la rîndul lor sunt cuplate cu reaciile de interfa A-R ­substrat de imobilizare. Chiar i în cazul unui echilibru real, viteza reaciei în apropierea strii de echilibru va fi important în determinarea timpului de DIALIZOR RECEPTOR TRADUCTOR ELECTRONICA rspuns. În acest caz, cinetica acestor procese necesit considerarea unor condiii suR plimentare. Clasificarea din figura 3.11 suPRIMA GENERATIE R marizeaz stadiul integrrii biosenzorilor cu R microtehnologiile secolului XX. Mileniul III MEMBRANA SENZOR a produs, o dat cu dezvoltarea nanotehnolgiilor i a instrumentelor de mani-pulare a R atomilor (microscopia de fore atomice), o A DOUA GENERATIE R adevrat revoluie în medicin. Noile tipuri de materiale la scal nanometric cu diferite R SENZOR MODIFICAT BIOCHIMIC nivele de biocompati-bilitate, noua generaie de celule de biocom-bustie fundamentat pe R o mai bun îne-legere a metabolismului, A TREIA GENERATIE manipularea informaiei stocate la nivel moR lecular au condus la o generaie de biosenR zori cu un înalt nivel de integrare. InforBIOCHIP Figura 3.11- Generaiile biosenzorilor. Rmaia molecular stocat iniial în comporeceptorul nentele moleculare de baz poate fi exprimat dirijat la un nivel superior numit "supramolecular" în care interaciunile dintre molecule se realizeaz dup algoritmi prestabilii, putînd conduce la materiale adaptative, funcionale i inteligente. Mai precis, se construiesc materiale pe baza unor principii moderne de concepie, supramoleculare i combinatoriale. Sunt dezvoltate tehnici separative, de stocare i detecie utilizînd membrane "biomimetice" care funcioneaz dup modele biologice sau dup principii fizicochimice precise. Prin urmare avem posibilitatea explorrii diversitii moleculare, supramoleculare i combinatoriale în scopul elaborrii de materiale adaptative cu proprieti optime sau funcii multiple. Aceste concepte sunt utilizate de natur, de exemplu, din milioane de conformaii pe care le poate adopta o protein numai una prezint activitate enzimatic foarte precis. Prin astfel de exemple, natura ne înva s optimizm explorînd diversitatea. În acest context se exploreaz sisteme integrate de nivel nanometric format din senzori, surse de energie (celule de biocombustie- adeseori denumite gastroboi) ce utilizeaz metabolismul corpului uman, manipulatoare pentru chirurgie nanometric, 47

rezervoare de medicamente înglobate în polimeri inteligeni.Toate acestea au dimensiunea unui virus. Termenul astzi este din ce mai mult utilizat: Nanomedicin [49]. Pentru a realiza avansurile de integrare ne vom limita la prezentarea schematic a unui biosenzor de ultim generaie bazat pe ADN, structuri de nanotuburi i polimeri semiconductori [50]. Figura 3.12 descrie principial secvenele de formare a unui senzor cu ADN. Biosenzorul electrochimic cu ADN din figura 3.12 este rezultatul cerinelor diagnosticului medical de a determina rapid i cu acuratee segmentele din secvena unui ADN. Rezultatele din genetic, biologia molecular preluate pe suportul nanotehnologiilor au condus la una dintre cele mai precise metode de detecie: senzor electrochimic cu ADN (combinarea principiului senzorului ISFET cu fire moleculare din nanotuburi). Principiul de funcionare prezentat în figur const în colectarea de semnal între doi electrozi ­ unul electrod de lucru i altul de referin. Electrozii auxiliari au la rîndul lor un rol bine precizat. Mecanismul de senzare const în modificarea caracteristicii I-V ( curent ­tensiune) în prezena unei molecule int. Nanotuburile de carbon sunt excepionali pentru electrodul de lucru avînd vitez de transfer de electroni mare i o rezoluie spaial excelent. Numai capetele nanotuburilor sunt active electrochimic, prile laterale fiind inerte, aceasta ofer un avantaj excepional i anume electrozii de CNT pot fi fixai într-un strat izolator lsînd numai capetele expuse spre mediul electrochimic.inta în senzorul ADN este o secven necunoscut de ADN (sau oligonucleotide) ataat prin funci-onalizare la gruprile carboxilice sau aminice de CNT.

48

Figura 3.12- Principiul de construcie a unui biosenzor tip FET realizat prin funcionalizare nanotuburilor cu ADN

49

50

3.3 Traductori i electrozi

Din paragrafele precedente rezultat c orice eveniment al interaciei R-A este identificat i transdus spre traductori prin intermediul electrozilor. Prin urmare traductorul transform detecia indus de variaia fizico-chimic din elementul senzitiv al biosenzorului într-un semnal, de regul electric care este amplificat de un circuit electronic (vezi figura 2.1). Traductorul este în contact intim prin intermediul electrozilor cu materialul biologic iar activitatea acestor componente poate fi masurat cu un sistem electric, termic sau optic. Traductorii sunt necesari pentru transformarea mrimii primare de intrare într-o mrime electric, i reprezint unul din elementele cheie al întregului sistem. Principalele tipuri de traductori folosii în msurarea interaciei R-A sunt [51]: Traductori de tensiune sau de curent ce msoar între doi electrozi o diferen de potenial sau un curent electric. În acest caz electrozii nu reprezint un traductor în adevratul sens al cuvantului, deoarece nu transform o mrime de alt natur într-una electric, ci doar intermediaz preluarea i transmiterea semnalelor electrice dintr-un mediu cu proprieti fizico-chimice aparte, mediul biologic spre exterior. Pot fi traductori cu electrozi de suprafa (în contact) sau de volum (imersai în mediu). Electrozii sunt în general mini sau microminiaturizai Traductori de temperatur · prin contact: termistorii, termocupluri, jonciuni semiconductoare, tranzistori, circuite integrate specializate. · prin radiaie termic: detectori semiconductori, bolometre rezistive, bolometre piroelectrice. Traductori de debit : mecanici optici, prin efect Doppler, ultrasonici, prin efect Doppler, magneto-electrici, bazai pe tensiunea electromotoare produs de particule încrcate care se mic într-un cîmp magnetic folosii pentru msurarea debitului de aer, sînge, fluide biologice în general cu aplicaii în micro i nanofluidica sistemelor biologice Traductori de presiune: manometre clasice, cu membran i traductor de deplasare piezoelectrici, piezorezistivi, inductivi, cu semiconductori, circuite integrate 51

Traductori de deplasare. poteniometrici, optici. Traductori pentru msurarea concentraiilor (pH-metre) semiconductori cu proprieti de suprafa, dependente de concentraia diferitelor substane, traductori spectrometrici Traductori de radiaie ecrane fluorescente, scintilatori, semiconductori.

3.3.1 Electrozi

Tipuri de electrozi : A. electrozi externi, sau de suprafa, sunt în general electrozi metalici, care fac contact cu componenta bioactiv din senzor fie în mod direct (electrozi uscai sau solizi), fie prin intermediul unei soluii electrolitice (electrozi lichizi). Electozii solizi sau uscai sunt realizai în general din argint, platin, aur, sau nichel. Pentru cazul în care avem contact direct cu epiderma va trebui s se ia în considerare c suprafaa pielii nu este în general uscat sau inert chimic, ci exist poluri electrochimice care au ca principal component clorura de sodiu. În momentul în care un electrod metalic vine în contact cu soluia electrolitic va aparea un schimb de ioni între metal i electrolit. Ionii metalici, în masura în care sunt solubili în soluia electrolitic vor migra în electrolit, în timp ce ionii negativi a electrolitului vor migra ctre electrodul metalic, recombinîndu-se cu ionii metalici pentru a forma o sare a metalului din care este fomat electrodul. Aceast migrare a ionilor în direcii opuse echivaleaz cu un transfer de sarcina ce duce la apariia unui potenial de electrod. O condiie pe care trebuie s o îndeplineasc electrozii este aceea c metalele din care sunt confectionai s nu fie solubile în electroliii prezeni pe suprafaa pielii, sau dac sunt solubile, reaciile chimice aprute s fie total reversibile la aplicarea unui potenial electric pe electrozi. În aceast clas de electrozi numii i reversibili intr: · electrozii din metal în contact cu un electolit ce conine proprii si ioni, · electozii nemetalici în contact cu un electrolit, · electrozii compui dintr-un metal i o sare greu solubil a acestui metal în electrolitul cu anion comun cu sarea metalului. B. Electrozi interni, sunt în general realizai din fire foarte subiri, dintr-un metal rezistent: oel inoxidabil, platin, wolfram. Poriunea activ a electrodului poate fi acoperit cu cu un strat metalic bun conductor (aur, argint) iar cea inac52

tiv cu un strat izolator, de exemplu un polimer sau o pelicul subire de sticl. Suprafeele de contact cu componenta activ din senzor au totui dimensiuni mari în comparaie cu dimensiunile celulare, de aceea se folosesc pentru înregistrri extracelulare. C. Microelectrozii, sunt tot electrozi interni, îns sunt asfel construii încît s poat msura potenialele în contact direct cu receptorul din biosenzor. Suprafaa de contact cu R are dimensiuni micronice. Microelectrozii pot fi : · solizi, compui, care pot fi realizai prin depunerea unui strat conductor (platin, aur,) pe un suport de sticl avînd un vîrf deosebit de subire. O alt variant constructiv const în inserarea unui conductor metalic sau din fibr de carbon într-un suport de rain epoxidic amestecat cu o past conductoare. · lichizi, sunt folosii în prelevrile celulare i constau dintr-o pipet de sticl avînd un vîrf de dimensiuni micronice, umplut cu o soluie electrolitic coninînd în general clorur de potasiu. În soluia de electrolit este cufundat un fir conductor, pentru a prelua potenialul electric.

3.3.2 Electrozi în senzori electrochimici

Electrodul de aur . Muli ani s-a crezut c nu este posibil transferul direct al electronilor între electrod i proteine, datorit denaturrii lor. Cîteva considerente de ordin practic au dus la concluzia c centrul activ din hem este adsorbit ireversibil atunci cînd rezult denaturarea proteinelor în contact cu electrodul. Modificarea suprafeei electrodului de aur prin adsorbia pe suprafaa lui a 4,4'bipiridil, a dus la modificarea configuraiei suprafeei electodului pentru interacia cu citocromul "c"[59]. Este important de subliniat c 4,4'bipiridil nu este o substan electroactiv, în regiunea de potenial i deci nu joac rol de mediator. Aceast achiziie în domeniul electrochimiei a fost posibil datorit legrii cvasireversibile a citocromului "c" de electrodul modificat, de aur, cu 4,4' bipiridil, din acest demers rezultînd c legturile de hidrogen din resturile de lizin s-au legat de azotul din piridil care a modificat suprafaa electrodului.Tranzitul prin proteine-electrod complex, orienteaz rapid transferul de electroni, care se realizeaz dup urmtoarea schem: · difuzia citocromului "c" pe electrod, · legarea proteinelor pe suprafa, · transferul de electroni, · desorbia proteinelor. Urmînd acest procedeu au fost posibile mai mult de 60 de modificri de suprafee pentru electrochimia proteinelor i a electrodului de aur. Prin urmare folosind un reactiv bifuncional (X-Y), în care grupul X este electrodul legat cu azot (N), fosfor (P) sau sulf (S) i grupul Y, ce trebuie s fie legat prin legturi slabe de proteine. Rezultatele din electrochimia proteinelor s-au extins i la aminoacizi i peptide. 53

Electrodul de grafit. Electrochimia proteinelor a fost extins i la electrodul de carbon. Formele de carbon- grafitul pirolitic, carbonul vitros, mezocarbonii, sunt structuri în care planele grafenice, se aranjeaz ordonat în reele hexagonale de tipul ABABA..sau dezordonat luînd diferite forme turbostratice Planul grafenic bazal este hidrofob dar defectele existente sau induse conduc la legturi C-C libere i se produce o cretere a legturilor C-O prin oxidare (detalii în cap 9). Electrochimia direct a proteinelor încrcate pozitiv poate prin urmare s fie efectuat pe marginile planurilor grafitice ale electrodului de carbon. Transferul direct al electronilor pentru proteinele încrcate negativ, cum ar fi plastocianina cu electrodul de grafit (marginile sau muchiile planelor), poate fi ajutat cu cationi de mangan, calciu, crom, complexai cu compui amino, Cr (Am6)3+, folosii ca promotori al reaciilor. În acest context promotorii sunt specii redox inactive în soluii dar care dau posibilitatea s se fac transferul electronilor la proteinele redox. Electrozii de Au i grafit i tehnicile de microminiaturizare pîn la dimensiuni de 10 sunt discutai în detaliu în referinele [52, 53]. Electrozii microminiaturizai prezint avantaje specifice printre care amintim îmbuntirea polarizrii, contacte cu materialul biologic la nivelul situsurilor active. Electrozi pentru variate sisteme de pH metre, ISE au fost analizai pentru variate sisteme de analiz de ctre IUPAC [54, 55, 56].

3.4 Fenomene de transport

Specificitatea i selectivitatea sistemului considerat depind de componentul biologic receptor al biosenzorului i de afinitatea lui pentru analit. Afinitatea este o caracteristic specific enzimelor, anti-bioticelor i receptorilor fiind folosit în multe funcii din organismelor vii. Afinitatea se bazeaz pe cuplajul chimic dintre un component i partenerul su complementar. În cazul componenilor cu afinitate mare, procesul de difuzie este foarte rapid, conducînd la formarea complexului ca exemplu cel de tipul antigenanticorp (figura 3.12). Reacia de asociere specific recunoaterii moleculare va fi caracterizat prin constanta ratei de reacie care în general este de ordinul întîi. În msurtorile cu biosenzori este esenial s considerm concentraia unui component constant iar pe a celuilalt, variabil. Cu aceast condiie, suma concentraiilor anticorpilor liberi i a celor legai la echilibru va fi constant i independent de concentraia antigenului adugat. O discuie de detaliu asupra cineticii antigen-anticorp se poate gsi în orice monografie de biochimie, cu particularitate pentru aplicaii în biosenzori pot fi recomandate referinele [57, 58, 59, 60]

54

3.4.1 Cinetica Enzimelor

Adugarea enzimelor în soluii coninînd molecule de substrat este condiia esenial în reaciile de cataliz a enzimelor. O discuie de detaliu asupra cineticii enzimelor i a mecanismelor enzimatice este practic imposibil într-un paragraf. Mai mult extragerea informaiei necesare din tiina enzimelor pentru a fi aplicate la dezvoltarea de senzori cum ar fi electrodul enzimatic este o sarcin extrem de dificil. Se va utilza referinele [61,62] pentru a schia cîteva din proprietile enzimelor necesare descrierii senzorilor enzimatici. Considerm o reacie simpl, cu un singur substrat S, care se combin cu enzima E pentru a forma complexul intermediar enzim ­ substrat, ES. Acest complex fiind instabil sufer o nou reacie în urma creia se obine produsul P. Schematic aceste reacii se pot scrie:

E+S k 1 ES k 2 E + P k -1

unde: k1 -constanta ratei reaciei de formare a complexului ES; k--1 -constanta vetezei de reacie Figura 3.12- Cinetica interaciei Ag-A , c de consumare (dispariie) a complexului; k2 ­con- reprezentare general. [A-A] reprezint stanta vitezei de reacie de obinere a produsu-lui P concentraiile reactanilor. Kd-constanta de Vitezele de formare i de consumare a com- reacie. a) Curba generala a rspunsului funcie de concentraia de antiplexului sunt egale. Imediat ce E i S intr în reac- interaciei Reprezentarea în valori reciproce gen Ag.b) ie, sistemul se dezechilibreaz, concentraia com- conduce la liniarizarea proce-sului i plexului va fi zero i viteza de formare a complex- determinarea constantei de reacie ului este cu mult mai mare decît viteza consumrii ( prelucrare dup [53-56]) lui. Pe msur ce reacia se desfoar, ES crete i implicit crete viteza dispariiei complexului în raport cu rata formrii lui. Se observ c, iniial excesul substratului determin consumul enzimei iar în timpul desfurrii reaciei începe regenerarea constant a enzimei ajungîndu-se la atingerea strii de echilibru. Din analiza acestor reacii rezult dou concluzii importante : · La o concentraie mic a substratului: rata reaciei este proportional cu concentraia substratului i invers proportional cu constanta ratei reaciilor de formare i de dispariie a complexului sau rata reaciei de disociere în reactanii iniiali plus rata reaciei de descompunere în produi. La o concentraie mare a substratului: viteza maxim este limitat de concentraia enzimei. Astfel cele dou secvene corespund celor dou procese care pot controla viteza total a reaciei. 55

·

O detaliere asupra proprietilor i caracteristicilor catalitice a enzimelor precum i o sintez asupra tehnicilor de imobilizare sunt prezentate în [56,57]

3.4.2 Fenomene de transport

Cînd reacia are loc în soluii omogene, cu o vitez uniform, aceeai în tot mediul, este necesar s considerm modificarea în timp a concentraiei componenilor. Dac reacia se produce la suprafa, concentraia reactanilor i produilor prezint modificri locale. Variaia în funcie de distan a concentraiei este semnificativ la scar molecular.Transportul de la regiuni cu concentraii mai mari spre cele cu concentraii mai mici este un factor important în controlul vitezei reaciilor. Trei mecanisme ale transportului de mas au loc în soluie: difuzia,convecia, migraia . Difuzia Considerm c moleculele din soluia studiat prezint micare brownian suferind ciocniri cu solventul. În acest caz, probabilitatea ca o molecul s se mite într-o direcie va fi egal cu probabilitatea ca orice alt molecul s se mite în alt direcie. Punînd condiia egalitii probabilitilor pentru fiecare molecul, probabilitatea net a micrii globale a moleculelor dintr-un element de volum dat din soluie spre altul alturat, este dependent de numrul de molecule din fiecare element de volum al soluiei. Rezult c micarea speciilor chimice se face din regiunile cu concentraie mai mare spre cele cu concentraie mai mic cu o vitez dependent de diferena de concentraie dintre cele dou regiuni, ajungînd la echilibru cînd aceast diferent devine egal cu zero. Timpul necesar ajungerii sistemului la echilibru reprezint timpul de rspuns i reprezint un criteriu important pentru stabilirea performanei biosenzorului. Determinarea timpului de rspuns în funcie de membranele permeabile este necesar în operaionalizarea aplicaiilor biosenzorilor. Grosimea membranei trebuie s fie atent aleas, astfel încît difuzia s conduc la sensibilitatea optim i la cel mai stabil rspuns. Convecia Convecia se refer la micarea soluiei în întregime sub aciunea unor fore mecanice externe. Cînd reacia se produce la suprafaa membranei, convecia este folosit pentru sporirea vitezei transportului de mas, prin înlocuirea soluiei în contact cu membrana cu alta nou. Meninerea reaciei la o vitez constant este important pentru controlul difuziei i determinarea sensibilitii. Vîscozitatea reprezint mrimea fundamental care controleaz fluxul i ea reflect rezistena soluiei la micarea de alunecare reciproc a straturilor. Aceast rezisten este descris formal de legea lui Newton. Pentru o for dat, fiecare subsecven a stratului de soluie se mic în raport cu secvena anterioar, asfel încît viteza soluiei, în raport cu subsecvena staionar, crete constant cu creterea distanei faa de ea. Cînd reacia are loc la suprafaa membranei i speciile sunt generate sau consumate, ele trebuie s difuzeze prin stratul staionar, numit strat de difuzie. Migraia Migraia se refer la micarea speciilor cu sarcina electric într-un mediu în care exist un gradient de potenial. În sistemele electrochimice, ea reprezint mecanismul de meninere a echilibrului între sarcinile create i distruse de electronul de transfer, datorat curentului dintre cei doi electrozi. În orice caz, contribuia migraiei la viteza global a 56

transportului de mas, la generarea speciilor electrochimice, este nesemnificativ i nu prezint prea mare importan. De notat c literatura de specialitate surprinde foarte puine aspecte asupra modelrii i simulrii fenomenelor de transport i a reaciilor chimice de interfa într-un biosenzor.[63]

57

58

4. Biosenzori electrochimici

Un biosenzor electrochimic este un dispozitiv integrat, autonom, capabil s furnizeze informaii analitice cantitative sau semicantitative specifice folosind ca element de recunoatere molecular un receptor biochimic (element de identificare biologic), care se afl în contact spaial direct cu un traductor electrochimic. Datorit abilitii lor de a fi calibrai în mod repetitiv un biosenzor electrochimic se distinge de un sistem bioanalitic care necesit pai adiionali de procesare, ca de exemplu adiionarea de reactiv. Biosenzorul disponibil pentru un singur tip de msurtoare, sau incapabil s monitorizeze continu analiza concentraiei sau s nu fie regenerat rapid i reproductibil este definit a fi de ,,unic folosin". Din prezentrile anterioare s-a artat c biosenzorii sunt clasificai în funcie de specificitatea lor biologic ­ cu referire la mecanismul, sau la modul de interpretare a semnalului fizico-chimic (traductorul). Biosenzorii electrochimici se disting numai prin natura traductorului indiferent de natura componentei biologice conform cu clasificarea din tabelul 4.1 Elementul de recunoatere biologic are la baz o reacie chimic catalizat sau o reacie de echilibru cu macromolecule ce au fost izolate în prealabil sau sintetizate în mediul lor biologic original. În cazul reaciilor reversibile starea de echilibru poate fi în general atins dac nu mai exist un consum net de ctre agentul biocomplexului imobilizat i incorporat în senzor. Biosenzorii electrochimici pot fi clasificai în funcie de analizele si reaciile pe care le monitorizeaz: monitorizare direct a concentraiei analiilor sau a reaciilor productoare sau consumatoare a acestora; alternativ, o monitorizare indirect a inhibitorului sau activatorului elementului de recunoatere biologic (receptorul biochimic). O proliferare rapid a biosenzorilor electrochimici i a diversitii lor a condus la o lips de rigoare în definirea criteriilor de performan. Cu toate c fiecare biosenzor poate fi evaluat pentru o anumit aplicaie, este util s se stabileasc o serie de protocoale standard pentru stabilirea criteriilor de performan conform normelor i criteriilor IUPAC [64]. Aceste criterii includ caracteristicile de etalonare (sensibilitate, domeniul de liniaritate i operaional al concentraiei, limitele determinrii cantitative i detecia specific), selectivitate, starea de echilibru i timpul de rspuns, reproductibilitate, timp de via, stabilitatea.

4.1 Senzori chimici vs senzorii biochimici

Un senzor chimic este un dispozitiv ce transform informaia chimic într-un semnal electronic sau fotonic raportînd concentraia unui compus specific identificat la proba analizat [65, 66]. Senzorii chimici de obicei conin dou componente de baz: un receptor = un sistem de recunoatere chimic (molecular) i un traductor fizico-chimic. Senzorii biochimici (biochemosenzorii) sunt senzori chimici, în care metoda / sistemul de identificare utilizeaz un procedeu biochimic. Senzorii biochimici sau "biochemosenzorii " sunt dispozitive care introduse într-un mediu biologic, ofer la ieire semnale electrice msurabile ce caracterizeaz acest mediu. Acetia pot avea la baz o serie de senzori chimici, cum ar fi electrozii pH, electrozii ionselectivi (EIS) etc. Modelul schematic este similar cu cele prezentate in figurile 2.1, 59

2.2, 2.3. Biochemosenzorii convenionali utilizeaz un electrod electrochimic, ca element de conversie a semnalului biochimic într-un semnal electric în timp ce tipurile mai noi utilizeaz traductori cum ar fi: fibrele optice, dispozitivele piezoelectrice, tranzistorii cu efect de cîmp (FET), SAW (unde acustice de suprafata). Biochemosenzorii detecteaz, practic, specii electroactive produse sau consumate într-o reacie de orice tip. Toi biosenzorii sunt mai mult sau mai puin selectivi (non-specifici) pentru un anumit analit, unii sunt prin construcie i concepere doar specifici pe o anumit clas de analii dac folosesc clasa enzimelor (ex: biosenzori pentru detecia fenolului) sau celule (ex: în msurarea consumului biologic de oxigen). Noiunea de recunoatere este deseori folosit în biosenzori sau în sistemele biosenzoriale prin asociere cu sistemele senzoriale ale corpului uman. Simurile ca mirosul sau gustul, sunt alctuite din sisteme ce conin o celul receptoare pentru identificare cuplate cu ci neurotransmitoare de procesare prelucrare semnale. Fenomene de acest tip au loc i în biochemosenzori dar la nivel mult simplificat fa de complexitatea recunoaterii moleculare din sis-temele vii. Exemple de semnale de transfer simple sau multiple sunt prezentate în tabelul 4.1. Aceste exemple se limiteaz la principalii biochemosenzori. Pentru tipurile de receptori prezentai în tabela 4.1 se pot selecta diferii electrozi i metode de msur din tabela 4.2 pentru a forma un biosenzor electrochimic. Biosenzorii sunt clasificai dup elementul de recunoatere (tabela 4.1) sau dup modul de transducie (tabela 4.2). De reinut c toi biosenzorii indiferent de tipul de clasificare trebuiesc tratai unitar ca un microsistem, elementul de recunoatere biologic fiind în contact direct, intim, cu elementul traductor

60

Tabela 4.1 Tipuri de receptori folosii în biosenzori cuplai cu tehnici electrochimice de msurare pentru recunoaterea specific de specii. Cupluri receptori biologici- tehnica de msur electrochimic sunt indicate prin litere boldate [67] Tipul de analit Receptorul/ sistemul chimic Tehnica de msurare /biochimic de recunoatere Natura traductorului Potentiometric 1.Ioni Oxizi metalici multivalenti Cristale anorganice cu con-ducie Voltametric ionic, Ioni permselectivi Ionofori biologici Enzime Sticle schimbatoare de ioni 2. Gaze dizolvate, Strat dublu lipidic sau membrane Amperometric Amperometric i poteniometric vapori i mirosuri hidrofobe ; Amperometric, potentiometric sau de Electrod de metal inert impedan Enzime Piezoelectric, optic Anticorpi, receptori 3. Substrate Enzime Amperomrtric sau potenio-metric in serie cu 1 sau 2 metale Electrozi de carbon, Conductometric, Piezoelectric, optic,calorimetric idem Amperometric, Poteniometric Impedanmetrie, Piezoelectric, optic, Rezonana plasmonilor (SPR) Optic

4. Anticorp/ Antigen

Celulele Membrane receptor Tesuturi de animale sau de plante Antigene /anticorpi; Duplex de oligonucleotide, Aptamer

Enzime specifice indexate Indexri fluorescen, chemiluminiscen 5. Diferite Liganzi specifici Idem cu 4 proteine, substante proteine receptor cu greutate Enzime specifice moleculara mica fluorescenti *Pe lîng determinarea sub raport cantitativ a analiilor, biosenzorii sunt folosii i pentru a detecta i cuantifica micro-organisme: receptorii sunt bacterii, drojdii sau oligonucleotide cuplate cu traductori electrochimici, piezoelectrici, optici sau calorimetrici.

61

4.2 Biosenzor electrochimic

Un biosenzor electrochimic este un biosenzor cu traductor electrochimic (tabela 4.2). Este considerat a fi un electrod modificat chimic (CME), ca un conductor electric ce transmite electronii din procesul de interacie spre exterior în sistemul electronic de msurare. Electrodul poate fi metal, semiconductor sau material cu conductivitate ionic acoperit cu un film biochimic sau bioactiv [68 ,69, 70]. Biosenzorul electrochimic este un microsistem integrat receptor - traductor, capabil s dea informaii analitice selective, cantitative sau semicantitative folosind un element de identificare biologic. El poate fi folosit pentru a monitoriza atît elemente biologice cît i nebiologice. De notat c senzorii chimici care încorporeaz componente nebiologice ca receptor, dei este folosit la monitorizarea proceselor biologice (ex: pH sau senzorii de oxigen) nu sunt biosenzori. Totui ei, de exemplu electrodul Clark, sunt de o importan major în lanul biosenzorial de msur. Similar senzorii fizici utilizai în medii biologice cum ar fi cei ce msoar presiunea arterial etc, nu sunt considerai biosenzori

Tabela 4.2 Tipuri de traductori electrochimici, tipul de msurtoare i analitul corespun- ztor [62] Electrod ion-selectiv (ISE); K+, Cl-, Ca2+, FPoteniometric Electrod de sticl H+., Na+. . . .

Electrod gazos CO2, NH3 Electrod metalic Reacii redox Electrod metalic O2, Zaharuri, alcooli: Amperometric Electrod-carbon zaharuri, alcooli, fenoli, Electrozi modificati chimic (CME), oligonucleotide Electrozi tip pieptene Uree, Oligonucleotide Conductometric, Electrozi metalici Impedanmetric Tranzistor cu efect de cîmp cu selectivitate H+., Na+. . . . Tranzistori cu efect ionic (ISFET) de cîmp (FET) FET cu sensibilitate la Enzime (ENFET) * Biosenzorii utilizeaz i alte tipuri de traductori non-electrochimici.: a) biosenzori piezoelectrici b) biosenzori-SAW, traductorul msoar unde acustice de suprafa într-un circuit de rezonan (shear and surface acoustic wave); c) biosenzori calorimetrici (elementul activ este cuplat cu un termistor sau cu un termocuplu); d) biosenzori optici, utilizeaz fenomene optice cum ar fi fibra optic i fenomenele de reflexie, refracie, interferen; biosenzori cu fluorescen, chemoluminiscen, absorbia luminii e) biosenzori SPR ce folosesc interacia analit-receptor imobilizat pe un film metalic depus pe o prism optic msurînd variaia indicelui de refracie datorit modificrilor induse în sarcina electric a metalului.

4.3.Clasificare

Biosenzorii electrochimici dup terminologia stabilit în tabela 4.1 i 4.2 pot fi clasificai în funcie de specificitatea lor biologic, dup mecanism sau modul de transmitere a semnalului sau, alternativ, combinaia acestora dou. Ei pot fi: amperometrici, poteniometrici, cu efect de cîmp (FET) sau senzori conductometrici (msurarea conduciei 62

electrice) respectiv de impedan (impedanmetrici). Alternativ pot fi numii de exemplu: senzor amperometric enzimatic [71] pentru a specifica natura receptorului i a traductorului. Primii biosenzori ce au fost studiai sunt cei enzimatici i imunosenzorii.

4.4 Receptorul Element de recunoatere biocatalitic

În acest caz, biosenzorul are la baz o reacie catalizat de biomacromolecule, prezente în mediul biologic original i care sunt izolate în prealabil sau sunt obinute pe cale sintetic. Reacia este monitorizat de un detector integrat (traductorul) ce msoar strilor staionare sau de tranziie ori produsul final de reacie prin intermediul biocatalizatorului imobilizat în biosenzor. Tipuri de biocatalizatori frecvent utilizai: 1. Enzime (simple sau complexe enzimatice)- cel mai des folosite ca sisteme de recunoatere 2. Celule, microorganisme (ex: bacterii, fungi, celule eucariote sau drojdii), organele sau componente celulare (perei celulari, mitocondrii) 3. esuturi (seciuni din esuturi de plante sau animale) Biosenzorii cu elemente de recunoatere cu biocatalizatori sunt cei mai cunoscui i studiai, înc de la începutul abordrii lor de Clark i Lyons . Unul sau mai muli analii, de obicei numite substraturi S i S', reacioneaz în prezena uneia sau mai multor enzime, celule etc, obinîndu-se produii P i P' dup urmtoarea schem de reacie:

biocatalizator S + S ' P + P '

Exist patru strategii prin care traductorul asociat poate monitoriza consumul de analit S prin reacia biocatalitic: 1. Detectarea consumului co-substratului S', ex: diminuarea oxigenului prin lanul de reacii indus de oxidaze, bacterii sau drojdii. Semnalul msurat reprezint diminuarea consumului de co-substrat fa de valoarea iniial. 2. Reciclarea produsului de reacie P cum ar fi: peroxihidrogen, H+, CO2, NH3., în scheme de reducere prin oxidoreducatz, hidroliz, liaz etc. Semnalul de la traductor se va amplifica. 3. Detecia centrilor activi din biocatalizator: redox, co-factori, grupuri prostetice ce evolueaz în prezena substratului S prin folosirea unui mediator imobilizat. Acesta reacioneaz rapid cu biocatalizatorul i este uor de detectat în lanul de transducie. Diferii derivai ferocenici, tetrathia-fulvalene, tetracianochinodimetan (TTF+ TCNQ- ), sruri organice, chinone, colorani chinonici, complexe de Ru sau Os în matrici polimere pot fi folosii ca mediatori.[72 ] 4. Transfer direct de electron dintre situsul activ al reaciei redox enzimatice i traductorul electrochimic. A-3-a strategie elimin, parial sau total, dependena rspunsului senzorului de concentraia cosubstratului, S', descrete influena interferenei dintre specii. Aceasta se realizeaz printr-o vitez de reacie mai mare pentru cuplul mediator- biocatalizator imo63

bilizat pe substrat fa de reaciile cosubstrat- biocatalizator. O alt alternativ este restricionarea analitului s reacioneze localizat pe un film. În acest caz analitul difuzeaz restrictiv printr-o membran a crei permeabilitate favorizeaz transportul cosubstratului [73,74]. Utilizarea mediatorilor conduce la diminuarea concentratiei substraturilor împreun cu lanurile de reacii prin utilizarea unei membrane cores-punztoare, a crei permeabilitate s favorizeze transportul cosubstratului. Cînd enzimele sunt imobilizate în cadrul acelorai lanuri de reacie, se poate îmbunti performana i abilitile biosenzorului. Trei posibiliti sunt frecvent folosite: 1. Unele enzime faciliteaz identificarea biologic prin convertirea secvenial a produilor seriilor de reacii enzimatice într-o form final electroactiv: acest mod permite o plaj mai larg de analiz a biosenzorului [75] 2. Complexul enzimatic, aplicat în serie, poate regenera co-substratul primei enzime i amplifica semnalul de ieire al biosenzorului prin regenerarea unui alt cosubstrat al primei enzime. 3. Complexul enzimatic, aplicat în paralel, îmbuntete selectivitatea biosenzorului prin scderea concentraiei locale a substratului electrochimic de interferen: aceast secven este o alternativ a utilizrii unei membrane permselective sau a unei metode secveniale (ex: interpretarea unui semnal de ieire generat de un biosenzor i de un senzor de referin, fr a exista element de recunoatere biologic).[76 ]

Element de recunoatere pe baz de biocomplexare sau de bioafinitate

Operarea biosenzorului se bazeaz pe interacia dintre analit cu macromolecule sau cu ansamble moleculare organizate [77]. La atingerea echilibrului nu mai exist consum de analit de ctre agentul de biocomplexare imobilizat în substrat. Rspunsul la reacia analit-agent de biocomplexare este monitorizat de un detector integrator. În unele cazuri reacia de biocomplexare se automonitorizeaz printr-o reacie biocatalitic complementar. Detectorul integrator monitorizeaz strile staionare sau tranzitorii. 1. Interacia anticorp-antigen (detalii asupra interaciei Ac-Ag sunt prezentate în seciunea 3.2). Cele mai relevante exemple de biosenzori ce folosesc receptori de biocomplexare au la baz reacii imunochimice, ex: legarea unui antigen (Ag) cu anticorpul caracteristic (Ac). Complexele formate de Ac-Ag trebuie s fie detectate cu condiia ca celelalte reacii non-specifice s fie minimizate. Pentru fiecare determinare de Ag corespunde un anumit Ac ce trebuie produs izolat, purificat etc. Unele studii recente au analizt monitorizarea direct a formrii complexului Ag-Ac utilizînd tranzistori cu efect de cîmp cu selectivitate ionic (ISFETs). Creterea sensibilitii senzorilor imunologici se realizeaz prin adugarea de enzime specifice la cupluri Ag-Ac îns aceasta necesit pai adiionali de sintez. Cum tria legturii sau constanta de afinitate variaz în limite largi aceste sisteme opereaz ireversibil (biosenzor de unic folosin) sau dac sunt cuplate în sisteme analitice de injecie a fluidelor (FIA) atunci Ac se poate regenera din disocierea complexului cu ageni cum ar fi glicin-HCl la pH 2.5 64

2. Receptor:antagonist/agonist. Recent s-au folosit ca sisteme de recunoatere molecular în analiza conductometric, ISFET sau senzorii optici cu receptori cu canale ionice, membranari sau structuri proteice [78]. De exemplu, o protein transportoare, lactoz- permeaza (LP), poate fi încorporat într-un bistrat lipozomic ce permite transportul protonic de glucid cu un raport stoichiometric de 1:1. Acest mecanism a fost identificat prin fluorescen dependent de pH a unui fluorofor imobilizat în lipozomi[79]. Lipozomi cu LP au fost încorporati într-un bistrat lipidic depozitat pe un ISFET sensibil la pH. Rezultatele preliminare arat c acest ISFET modificat e capabil sa detecteze ireversibil, lactoza dintr-un sistem FIA. Biosenzorul cu receptor proteic a fost descoperit de curînd [80]. Legarea analiilor, numii aici agoniti, de proteine receptoare imobilizate este monitorizat prin schimbarea fluxului de ioni prin aceste canale. De exemplu, glutamatul, ca agonist, poate fi determinat în prezena altor agoniti ce pot interfera prin determinarea fluxurilor de Na+ sau Ca2+, utilizînd metoda conductometric sau electrozi ioni-selectivi. Datorit dependenei canalului ionic de natura legturilor aceasta produce o independen de natura enzimelor pentru a se atinge sensibilitatea dorit. Evoluia actual de integrare a biochemosenzorilor pe cipuri a fcut din metodele electrochimice un instrument puternic de determinare i detectare a legrii oligonucleotidelor i a indexrii secvenei genetice (modulele de nanoelectrochimie ce doteaz în prezent microscopia de fore atomice). S-au abordat dou metode. Prima se refer la intercalarea în duplexul de oligonucleotide, în timpul formrii structurii dublu helix a ADNului a unei molecule care este electroactiv. A doua metod este detecia direct a guaninei care este electroactiv. În concluzie, dei cercetrile au avansat rapid nu cunosc înc o dezvoltare similar cu cea a biosenzorilor bazai pe biocatalizatori unde cercetrile au produs o larg cunoatere a domeniului. Aceste tipuri avînd la baz monitorizarea reaciilor de echilibru ce au un domeniu de liniaritate restrîns nu pot monitoriza continuu concentraia analiilor. O parte din aceti biosenzori nu pot opera prin intermediul unor membrane de separare analit - element senzitiv. Stratul sensibil adeseori trebuie s fie în contact cu mediul biologic unde se afl analii.

4.5 Moduri de transducie electrochimic Amperometria

Metoda amperometric se bazeaz pe msurarea curentului electric în procesele de reducere sau oxidare a speciilor electroactive. Metoda const în meninerea unui potenial constant al electrodului de lucru (Au-,Pt-, C) în raport cu un electrod de referin, care poate servi i ca electrod auxiliar, i msurarea curentulu care este de ordinul 10-9 -10-6 A. Curentul electric este direct corelat cu concentraia speciei electroactive sau a vitezei de consum a substratului biocatalitic. Cum vitezele de reacie biocatalitice sunt ade65

sea alese pentru a fi de ordinul întîi la fel i curenii sunt de obicei proporionali cu concentraia analitului.

Poteniometria

Msurtorile poteniometrice constau în determinarea diferenei de tensiune dintre doi electrozi (fie doi electrozi de referin sau unul de lucru ­unul de referin) separai printr-o membran permselectiv. Traductorul poate fi un electrod ion-selectiv (ISE), care este un senzor electrochimic ce are la baz un film subire sau o membran permselectiv ca element de recunoatere [17, 81]. Cele mai cunoscute dispozitive poteniometrice sunt electrozii pH; îns i ali electrozi selectivi la ioni ca : F-, I-, CN- , Na+, K+, Ca2+, NH4+, sau gaze (CO2, NH3) pot fi folosii. Diferenele de potenial dintre indicator i electrodul de referin sunt proporionale cu logaritmul activitii ionice sau fugacitatea gazului (sau concentraia), descrise de ecuaia Nernst-Donnan. Acesta este doar cazul în care: · Membrana sau stratul selectiv sunt infinite i concentraia altor ioni neglijabil · Diferenele de potenial la diferite suprafee de separare a fazelor sunt fie constante, fie neglijabile, fa de potenialul principal de msur dintre membran i soluia de analizat. Pentru orice biosenzor cu substrat biocatalitic, acesta este adiacent cu detectorul poteniometric, trebuiesc luate în considerare urmtoarele etape: 1. Transportul substratului de analizat spre suprafaa biosenzorului, 2. Difuzia analitului spre stratul de reacie, 3. Reacia analitului în prezena biocatalizatorului 4. Difuzia produsului de reacie înspre suprafaa senzorului sau volumul soluiei fie spre recirculare fie spre eliminare. Rspunsul senzorului biocatalitic poteniometric descrie fie o stare cuasistaionar sau tranzitorie. Situaia este mai complex în cazul senzorilor imunoenzimatici cu toate c complexul Ac-Ag atinge o stare de echilibru prin reaciile sale, reversibile sau ireversibile, activitatea enzimelor asociate complexului este msurat prin consumul de analit în starea staionar. Un alt aspect important al biosenzorilor cu ISE, este dependena mare a rspunsului lor de pH i de tria ionic.

Detecia acumulrii de sarcin superficial ( tranzistorii cu efect de cîmp-FET)

Este un principiu de transducie care determin concentraiile ionilor prin metoda efectului de cîmp indus de o sarcin superficial, al unui tranzistor care poart aceai denumire. ISFET ­ tranzistor cu efect de cîmp ion selectiv este denumirea general a acestei metode de transducie [82]. Principiul const în controlul unui curent electric sub influena unui potenial aplicat direct pe un electrod-poart. Cînd ISFET este cuplat cu un strat biocatalitic sau cu un biocomplex ei devin biosenzori i se numesc ori cu efect de cîmp enzimatici (ENFET) sau imunologici (IMFET). Indiferent de cazul particular prin66

cipiul este acelai curentul dintre dren i surs este controlat de mrimea unui potenial electric (FET).

Conductometrie, impedanometrie

Multe reacii ale enzimelor , ca de exemplu ­ureaza, i muli recep-tori ce sunt membrane biologice pot fi monitorizate prin conductivitatea ionic sau prin variaia impedanei utilizînd microelectrozi interdigitali (pieptene intercalat) [83]. Sensibilitatea masurtorilor este dependent i de conductana altor ioni din soluia de investigat. În aceast situaie msurtorile se realizeaz în montaje fie difereniale sau în punte unde una dintre probe este senzorul cu enzim iar cealalt este de referin fr enzim.

4.6 Analii, reacii monitorizate.

Biosenzorii se pot clasifica fie în funcie de analii sau de reaciile care le monitorizeaz. Între monitorizarea indirect a inhibitorilor i monitorizarea directa a analiilor (sau a activitii biologice) exist o imens diferen. Monitorizarea direct a analiilor sau a activitii biologice cu consum sau producere de analii. Monitorizarea direct a analiilor sau, alternativ, a activitii biologice, este indiscutabil cea mai mare aplicaie a biosenzorilor. Trebuie s se in seama de faptul c acelai biosenzor poate monitoriza activitatea enzimei sau a celulei vii, consumul sau producerea unui compus dat fie continuu sau secvenial Monitorizarea indirect de inhibitor sau activator a receptorilor biochimici. Alternativ, biosenzorii au fost dezvoltai pentru monitorizarea indirect a pesticidelor organice sau a unor compui anorganici (metale grele, fluoruri, cianuri) [84, 85] substane ce inhib proprietile biocatalitice ale enzimelor folosite în construcia biosenzorilor. Oricum aceste dispozitive sunt de obicei ireversibile. De exemplu la imunosenzori activitatea biologic iniial se poate regenera doar prin tratament chimic i prin urmare nu fac parte din clasa biosenzorilor recondiionabili sau reutilizabili. Potenialul lor de aplicaie este acela de avertizare i nu de monitorizare exact a unui analit specific. Se recomand ca acetia s fie considerai de unic folosin. De exemplu, biosenzorul cu cianur ce folosete ca inhibitor citocromoxidaza care se regenereaz prin splare cu un tampon de fosfai la pH=6,3 [86].

4.7 Construirea unui biosenzor electrochimic. Imobilizarea receptorilor biologici

Înc de la inceputul cercetrilor în acest domeniu, odat cu realizarea senzorului enzimatic pentru glucoz, prima descriere apartine lui Clark si Lyons în 1962, experiment în care glucozoxidaza este imobilizat între dou membrane, a aprut o bogat literatur asupra tehnicilor de imobilizare a receptorilor biologici. Enzimele, anticorpii, celule sau esuturi cu activitate biologica mare, pot fi imobilizai într-un film subire pe suprafaa unui traductor prin variate metode[59,61, 87, 88, 89, 90, 91, 92]. Urmtoarele proceduri de imobilizare ale receptorilor biologici sunt cele mai des folosite: 67

1. Imobilizarea pe membran pe suprafa neexpus la analit: o soluie enzimatic, o suspensie de celule sau de esut se confineaz între membrana permeabil la analit i electrodul de msur (detectorul electrochimic) 2. Reinerea receptorilor biologici într-o matrice polimerica, ca de ex: poliacrilonitril, gel agar, poliuretan (PU) sau alcool polivinilic (APV), hidrogeluri redox cu centrii redox ca de exemplu [Os(bpy)2Cl]+/2+ [93] 3. Reinerea receptorilor biologici între straturi autoasamblabile (SAM) sau în membrane din stratul dublu lipidic (BLM). 4. Legarea covalent a receptorilor de suprafaa membranelor prin intermediul gruprilor bifuncionale: glutaraldehide, carbodiimide, SAMs, avidin-biotin silanizate. 5. Modificarea structurii întregului electrod (ex: pasta de carbon modificat cu enzime sau grafit în rini epoxi [94].) Receptorii sunt modificai fie singuri fie în amestec cu alte proteine, ca de exemplu albumina serica bovin (BSA), fie direct pe suprafaa traductorului fie în membrana de polimer. De curînd, membranele preactivate pot fi folosite direct pentru imobilizarea enzimelor sau anticorpilor, fr modificari chimice. Legarea covalent i reticularea sunt mult mai dificile fa de imobilizarea sau reinerea receptorilor pe membran. În cazul structurilor microsenzoriale unde membrana este direct depus pe traductor atunci legarea covalent este mai sigur i stabil.

Membrane interne i membrane externe

Pe lîng straturile de reacie sau membranele cu receptorii imobilizai muli biosenzori, în special cei destinai aplicaiilor clinice sau biologice, încorporeaz una sau mai multe membrane auxiliare de separare interne sau externe cu trei funciuni importante: 1. Barier de protecie. Membrana exterioar previne interfe-rena sau intrarea în straturile de reacie a unor molecule mari (ca de ex: proteine sau celule), în acelai timp reduce trecerea componentelor din straturile de reacie în soluia de analizat. Aceste funcii sunt foarte importante, de exemplu, pentru un senzor de glucoz implantat, eliminarea de glucoz-oxidaz care nu este de origine uman poate cauza reacii imunologice. O membran se alege pentru a conferi o permselectivitate specific care s reduc interferenele cu alte specii în rspunsul biosenzorilor. De exemplu biosenzorii pentru glucoz in vivo sau ex vivo posed o membran de acetat de celuloz încrcat negativ pentru a descrete efectele de interferen cu ascorbatul sau ureatul care sunt electrochimic detectate împreun cu apa oxigenat generat enzimatic 2. Barier exterioar de difuzie pentru substrat. În cazul enzimelor acestea au o cinetic ce urmeaz modelul Michaelis-Menten [95]. Vitezele de reacie enzimatice sunt neliniare cu concentraia. Domeniul de liniaritate dinamic poate fi larg dac rspunsul biosenzorului este controlat de difuzia substratului prin membran i nu de cinetica enzimei. Acest control se realizeaz prin implantarea unei membrane exterioare subiri peste o enzim cu acti68

vitate mare: cu cît este mai subire membrana cu atît este mai scurt în timp rspunsul biosenzorului. Mai mult, bariera de difuzie exterioar induce pentru rspunsul biosenzorului o independen fa de enzimele active i îmbuntesc stabilitatea.[67,68] 3. Suprafee biocompatibile. Biosenzorii sunt supui la dou seturi de modificri cînd sunt în contact direct cu esuturile organice fluide sau implantate in vivo, de regul în matrici biologice active, sau în medii de cultur: Modificri ale probei biologice gazd cauzate de reaciile induse de biosenzor d.p.d.v a toxicitii, imunogeneticii, carcinogeneticii, trombogeneticii, mutageneticii etc. Modificarea proprietilor de operare ale biosenzorului de ctre componentele probei biologice sau de structura ei: pasivizarea suprafeei de la electrod. Alegerea unui strat extern de protecie biocompatibil este esenial pentru stabilitatea rspunsului dup implantare pentru traductorii de recunoatere molecular care cer un contact direct dintre prob i receptorul biologic.Toate aceste tipuri de membrane i straturi protectoare depind de diametrul senzorului iar funcie de caz se pot utiliza materiale polimerice depuse prin dip- sau spincoating (acetat de celuloz, Nafion, poliuretan, colagen, policarbonat). Microbiosenzorii sunt de obicei realizai prin traparea enzimei printr-un proces de electropolimerizare. Dac implantarea biosenzorului nu afecteaz funcionarea normal a mediului gazd i invers dac mediul gazd nu influeneaz operaiile normale ale biosenzorului, atunci biosenzorul este considerat biocompatibil.

4.8 Criterii de performan

Pentru orice senzor construit pe principiul recunoaterii moleculare [75] este important de al caracteriza prin rspunsul su care este legat de parametrii de operare i de vitezele reaciilor limitative. Precizia, acurateea, sensibilitatea, reproductibilitatea sunt criterii de baz în estimarea performanelor biosenzorilor [65,75]. Aceti parametrii sunt în direct relaie cu mecanismele de reacie, fenomenele de transport i cinetica proceselor din volum respectiv la interfa. Cele mai multe criterii au fost elaborate pentru biosenzorii enzimatici, ei fiind i cei mai studiai în literatura de specialitate. În cazul imunosenzorilor elementul cheie este capacitatea de captur a suprafeei adic numrul de molecule de pe suprafa care sunt active. O metod de verificare a acestui parametru este msurarea activitii specifice adic raportul dintre numrul de molecule active la numrul de molecule imobilizate. Aceast estimare este dependent de modul de imobilizare (orientarea molecular, numrul de puncte de ataare sau situri active) iar raportul se situeaz între limite 0.150.3, foarte rar atingînd unitatea. Capacitatea de captur devine important cînd suprafaa se micoreaz ca în aplicaii de microfluidic. O alt problem întîlnit la imunosenzori este aceea a regenerrii suprafeei fr pierderea semnificativ a activitii. 69

Oricum rapida proliferarea a biosenzorilor i a diversitii lor a condus la o lips de rigurozitate în criteriile de performan. Cu toate c fiecare senzor poate fi evaluat pentru aplicaia lui particular este util s se stabileasc protocoale standard pentru evaluarea criteriilor de performan în conformitate cu standardul i definiiile IUPAC [65]. Patru seturi de parametrii sunt descrii în cele ce urmeaz ca fiind cazuri particulare a criteriilor generale prezentate în seciunea 3.1. Calibrarea sau etalonarea biosenzorilor electrochimici este realizat în general prin adugarea de soluii standard de analit i ridicarea graficului de rspuns în regim staionar, Rss (steady-state response) funcie de concentraia analitului, c, sau de logaritmul, log

Rss este corectat în raport cu zgomotul de fond Rbl (background). c0, concentraia de referin este de regul estimat în mol/l dei aceast valoare mare nu este utilizat niciodat atunci cînd domeniile de msur se raporteaz la 1-10 mmol/l iar în prezent s-au atins sensibiliti de ordinul nmol/l i pmol/l. Rspunsul în regim tranzitoriu este important pentru analiza probelor în regim dinamic i în tehnicile de eantionare îns este mai puin semnificativ în monitorizarea continu. Rspunsul tranzitoriu este estimat prin panta (dR/dt)max dup adiia de analit în celula de msur. O metod de evaluare este de a introduce senzorul într-un sistem FIA pentru analiza secvenial de probe într-un regim hidrodinamic precizat. Sensibilitatea i domeniul liniar de msur a concentraiei în regim staionar sunt determinate din reprezentare grafic:

Rss - Rbl c versus log 0 c c

c , unde c0, reprezint o concentraie de referin. Semnalul de rspuns, 0 c

sau

Rss - Rbl c versus log 0 c c log 0 c

Aceast metod este mult mai concis decît curbele de calibrare curent utilizate de plotare a rspunsului corectat la linia de baz funcie de concentraie sau logaritmul ei. În acelai mod se determin i rspunsul în regim tranzitoriu prin:

dR dR dt max sau dt max versus log c c c c0 log 0 c

În toate cazurile parametrii se estimeaz în domeniul de rspuns liniar al biosenzorului. Orice biosenzor electrochimic are o limit superioar de liniaritate a rspunsului. Aceast limit este direct legat de proprietile biocatalitice sau de biocomplexare a receptorului biochimic sau biologic. Mai mult în cazul biosenzorilor cu enzime aceast limit este semnificativ influenat de membranele i de substraturile de imobilizare unde barierele de difuzie i cinetice secundare au un rol important. 70

Concentraia local a analitului în stratul de reacie poate fi cu dou ordine de mrime mai mic decît în volumul soluiei. Cinetica enzimatic fiind descris de mecanismele Michaelis ­Menten i exprimat prin parametrii KM i VM, biosenzorii sunt adesea caracterizai prin parametrii apareni KM i (Rss-Rbl): KM reprezint concentraia analitului la valoarea lui (Rss-Rbl)max/2 din curba de rspuns, VM, viteza maxim de reacie [23,24,48,96]. Cînd valoarea aparent KM este mare raportat la activitatea enzimei în faz de soluie ( enzime solubile) atunci exist o barier de difuzie dintre prob i stratul de reacie cu enzima imobilizat sau rata de reacie a cosubstratului cu enzima este mare. De reinut c pentru cinetica enzimei în faz de soluie, KM, este uzual determinat din reprezentarea grafic de tipul Lineweaver-Burk [96]:

1 1 vs c Rss - Rbl

Pentru orice biosenzor electrochimic trebuiesc stabilite numrul de standarde utilizate i cum matricea de probe standard poate fi simulat sau duplicat, ele fiind necesare pentru a specifica procedurile pentru fiecare tip de senzor legat de aplicaia sa. Acestea sunt de importan special pentru cazul senzorilor de unic folosin ce utilizeaz imunoafinitatea sau reaciile de inhibiie. Sensibilitatea este panta curbei Rss - Rbl vs c sau log c i nu trebuie confundat cu

c0

limita de detecie (LOD) cuantificat în raport cu linia de baz sau cu semnalele de zgomot. Domeniul de concentraii de lucru este determinat de limitele de detecie inferioare respectiv superioare. Selectivitatea, sigurana în exploatare Selectivitatea i sigurana sunt determinate ca pentru orice tip de senzor amperometric sau poteniometric [97, 98]. Ele depind de alegerea receptorului i a traductorului. Cele mai multe enzime sunt specifice dar sunt i clase de enzime nonselective, cum ar fi, alcooloxidaze, grupul de zaharuri oxidaze, peroxidaze, lactaze, tirosinaze, ceruloplasmin, alcooldehidrogenaze, glucozdehidrogenaze, NADH-dehidrogenaze etc. Ele au fost folosite pentru dezvoltarea de biosenzori pentru determinarea fenolilor din mediu [99, 100] sau în monitorizarea calitii alimentelor. Bacteriile, drojdiile, culturile de celule sunt în mod natural nonspecifice. Pe de alt parte electrozii de oxigen, electrozii pH, ISFET-urile prezint o selectivitate specific pronunat la fel i electrozii metalici care sunt sensibili la numeroase substane. Selectivitatea proprie poate fi modificat cînd aceti traductori sunt asociai cu receptorii. De exemplu ENFET este pH senzitiv la soluia tampon i la protonare dar selectivitatea sa nu este modificat. Cînd traductorul interfereaz cu alte substane cunoscute ca ascorbat sau urai la senzorul de glucoz bazat pe detecia peroxidului de hidrogen aceste efecte secundare pot fi restricionate prin utilizarea de membrane permselective exterioarea sau interioare. Alternativ, se concep senzori cu i fr receptori biologici ce funcioneaz prin compensare - senzori difereniali. Tipuri de senzori difereniali sunt dezvoltai pe principiul ISFET sau ENFET. Exist diferite proceduri de determinare a selectivitii biosenzorului dar dou sunt recomandate de normele IUPAC. 71

Prima const în evaluarea rspunsului biosenzorului prin adugarea de substane ce produc posibile intereferene. În acest caz se compar curba de calibrare a analitului în condiii identice de msur. Selectivitatea se exprim ca raportul dintre semnalele pentru analit i analit cu susbstanele de interferen. A doua procedur const în adugarea de substane de interferen într-o celul dat ce conine o concentraie de analit cunoscut. Selectivitatea este exprimat ca procentul de abatere fa de curba de calibrare a analitului. Aceast metod depinde de concentraia analitului. Sigurana în exploatare a senzorului depinde de selectivitatea i reproductibilitatea i de acurateea msurtorilor.

72

4.9 Exemple de biosenzori electrochimici 4.9.1 Electrodul Clark, aplicaii în medicin

Principiul de construcie Clark a studiat electrochimic oxigenul ca un gaz reductor i platina ca un electod de metal. Platina folosit pentru detectarea oxigenului electrochimic, este recunoscut sub denumirea de " electodul Clark ". Electrodul are o membran organic care acoper stratul de electrolit i doi electrozi metalici. Oxigenul difuzeaz prin membrana i este redus electrochimic la catod. Între catod i anod se aplic o tensiune fix, pentru care reacia de reducere a oxigenului are loc.Temperatura influeneaz mult viteza de reacie i solubilitatea (figura 4.1A). Acesta este un electod polarografic utilizat pentru msurarea concentraiei oxigenului în lichidele corpului sau în gaze. Mostra sau eantionul de msurat este în contact cu o membran (polipropilen sau teflon ) prin care oxigenul diuzeaz într-o camer de msur coninînd soluie de clorur de potasiu saturat 50%. În camer sunt doi electrozi, unul este de referin, Ag/AgCl i altul este de platin, îmbrcat în sticl. Curentul electric la potenialul de polarizare de - 600 mV, este proporional cu concentraia oxigenului în soluie. Pentru polarizare invers la+600mV se pot realiza msurtori pentru hidrogen. Reaciile sunt foarte sensibile la temperatur i trebuie meninut la valori de ± 0,10C. Electrodul este calibrat utilizînd un amestec din cele dou gaze ­oxigen i hidrogen- de concentraie cunoscut. Astfel electrodul de oxigen sau electrodul Clark s-a dovedit a fi un analizor al gazelor din sînge atunci cînd efectum analize de chimie în laboratorul clinic i în general în aria îngrijirilor medicale, regim ambulatoriu sau de terapie intensiv. Clark a avut ingenioasa idee de a plasa pe suprafaa electrodului de platin o enzim care reacioneaz cu oxigenul. Enzimele sunt plasate într-o membran închis la suprafa, care poate fi recunoscut ca cel mai simplu model de biosenzor. Curba msurtorilor concentraiei de oxigen a fost proporional cu concentraia glucozei. Acesta a fost primul biosenzor construit, care a ajutat mult la progresul analizelor de laborator. Pentru scopuri medicale detaliem cteva din etapele funcionrii acestui tip de electrod. Oxigenul difuzeaz prin membran i este redus electrolitic la catod. Cu cît este mai mare presiunea parial a oxigenului, cu atît difuzeaz mai mult oxigen la un moment dat. Senzorii de temperatur ataai probei permit compensarea pentru membran a vitezei de difuzie i solubilitate. Instrumentele de msur înregistreaz: curentul catodului, temperatura probei, temperatura membranei, presiunea ba-rometric, salinitatea. Cu aceste informaii se poate calcula oxigenul coninut în prob, fie în pri per milion (ppm), sau în procente ale saturaiei în oxigen. Configuraia geome-tric a electrodului Clark, are o mare importan. În particular, grosimea stratului electrolitic dintre catod i membrana trebuie s aib o anumit limit, pentru a asigura liniaritatea i micorarea driftului de curent.

73

Figura 4.1-Electrod Clark, principiu de construcie i moduri de operare galvanic (A) respectiv polarografic (B)

Calibrarea unui sistem polarografic este de strict necesitate. În primul rînd trebuie asigurat proporionalitatea dintre curent i concentraia de oxigen, cu erori sub 1% (Pentru probele biologice rolul i parametrii aerului sunt eseniale. Aerul, privit ca un amestec de gaze ce are un procent constant de oxigen, aproximativ 20,9%, cînd intr în contact cu apa, cantitatea dizolvat depinde de mai muli factori: timpul optim pentru dizolvarea oxigenului, omogenitatea soluiei de ap, temperatura apei, presiunea aerului, srurile coninute în ap, alte substane dizolvate în ap, care sunt consumatoare de oxigen). Oxigenul coninut în ap este determinant pentru procesele biologice i chimice, de aceea msurarea oxigenului dizolvat în ap este foarte important Pentru a gsi presiunea parial a oxigenului dizolvat, el trebuie s fie saturat în ap pur la o anumit temperatur. Consideratii practice 1. Agitarea: consumarea oxigenului de ctre proba de investigat poate cauza scderea concentraiei de oxigen la stratul de grani dintre membran i prob. Aceasta necesit agitarea continu. 2. Membranele: se folosesc dou tipuri de membrane; membrane libere, neasamblate i membrane de acoperire sau capsule. Membranele libere sunt mai ieftine, dar exist dificulti de instalare i rezultatele nu sunt repro-ductibile. Grosimea membranei determin cît de gros trebuie s fie stratul de electrolit adiacent catodului, aceasta afectînd timpul de rspuns al probei. Precizia 74

fabricrii membranei d o grosime de electrolit cît mai reproductibil, accelerînd asfel timpul de msurare i elimin problemele de asamblare. 3. Electrolitul: electrolitul în orice tip de electod de oxigen Clark trebuie s fie schimbat periodic, altfel se pierde capacitatea de reducere a oxigenului. Timpul de meninere a electrolitului depinde de rata cu care oxigenul este redus. 4. Calibrarea: aer saturat cu ap. În condiii de echilibru presiunea oxigenului în apa saturat cu aer este egal cu presiunea parial a aerului saturat cu ap, adic la o umiditate relativ de 100%. Electrodul msoar valoarea maxim a presiunii pariale de oxigen. Deoarece difuzia oxigenului în ap i aer sunt diferite, se aplic un factor de corecie la calibrarea apei saturate cu aer pentru a obine o valoare corect. Cînd se msoar concentraii sczute (sub 2 ppm) este necesar un al doilea punct de calibrare, punctul pentru standard de oxigen. La concentraia de 0 oxigen (prin adugare de sulfit de sodiu) curentul prin electrodul Clark este 0, acesta constituie al doilea punct de referin. Aplicaii ale electrodului Clark sunt la msurarea oxigenului dizolvat: tratamentul apelor uzate, producerea vinului, bioreacii, monitorizarea apei din mediu

4.9.2 Electrodul enzimatic

Electrodul enzimatic (în unele referine cunoscut ca electrod enzim) este o combinaie dintre o sond electrochimic de orice tip (amperometric, poteniometric sau conductimetric) cu un strat subire (10-200 microni) de enzim imobilizat. În aceste dispozitive funcia enzimei este de a furniza selectivitatea în virtutea afinitii sale biologice pentru un substrat de molecule (figura 4.2). De exemplu o enzim este capabil de a cataliza o reacie a unui substrat dat pentru un izomer specific dintr-o mulime de substraturi cu diveri izomeri. Tipic gradul de avansare a unei reacii enzimatice ( direct legat de concentraia analitului) este monitorizat prin viteza de formare a produsului sau dispariia unui reactant. Dac produsul sau reactantul este electroactiv atunci rspunsul poate fi monitorizat direct prin amperometrie adic variaia curentului pentru un potenial aplicat dat. Metoda final de analiz folosit va depinde în cele din urm de proprietile specifice ale enzimei. Principalele consideraii sunt: 1. Conine enzima grupuri redox active ? 2. Sunt electroactivi produii reaciei biochimice ? 3. Este electroactiv unul din substraturi sau cofactorii? 4. Care este viteza i timpul de rspuns? 5. Care este aplicaia final a senzorului Rspunsul la primele trei criterii va depinde în mare parte de sistemul supus investigaiei. Rspunsul la ultimele chestiuni este dependent de cerinele aplicaiilor specifice. Dac enzima nu conine grupri redox atunci biosenzorul se rezum la a msura produii sau consumul substratului prin reacia lor la electrodul de transducie. Curentul electric este direct legat de concentraia analitului. 75

Figura 4.2- Principiul de funcionare a electrodului enzim, fr mediatori

Biosenzori bazai pe rspunsul electrochimic datorat H2O2 Cele mai multe enzime comune folosite în designul de electrozi enzim sunt acelea ce conin grupri redox ce îi schimb starea redox în timpul reaciei biochimice. Enzimele redox sunt oxidazele i dehidrogenazele, pirolochinolin-chinonele (PQQ). Ele acioneaz prin oxidarea substratului acceptînd electroni în timpul procesului iar în continuare se transform în stare redus. Aceste enzime revin în starea activ oxidat prin transferarea electronilor spre molecula de oxigen rezultînd apa oxigenat,(H2O2). Atît oxigenul cît i peroxidul fiind electrochimic activi, atunci ei continu prin reducerea la cosubstrat (oxigenul) sau oxidarea peroxidului (produs de reacie). Metoda bazat pe reducerea oxigenului la electrodul de O2 este una din cele mai simple metode dar sufer de cîteva dezavantaje i anume- rspuns lent, dificulti în miniaturizare, acuratee i reproductibilitate sczut. Msurtorile asupra oxidrii peroxidului surmonteaz dificultile de mai sus i în prezent este cea mai popular metod [101]. Sisteme cu mediatori O limitare major a sistemului de msur cu ap oxigenat descris mai sus îl constituie potenialul de operare mare (circa 0,8V fa de electrodul de referin Ag/AgCl) necesar pentru oxidarea peroxidului ceea ce conduce la creterea interferenelor. Utilizarea mediatorilor (molecule care pot transporta electroni între centrul redox al enzimei i electrod) pot minimaliza acest inconvenient (figura 4.3)

Figura 4.3- Electrod enzimatic cu mediatori. Mecanismul de intermediere a transferului de electroni de ctre mediatori de la enzim la electrod

76

Depinzînd de natura mediatorilor potenialul aplicat poate fi redus sub limita interferenelor unor specii cum ar fi ascorbat, ureat i paracetamol. Un vast numr de compui sunt capabili de a aciona ca mediatori în electrodul enzimatic. Dintre acetia cei mai populari sunt complecii metalici. Reprezentativi pentru complecii organometalici sunt ferocenii i derivaii lor deoarece au o larg plaj de poteniale redox, sunt inde-pendente de pH iar schemele sintetice sunt directe fr complicaii. O serie de ali mediatori prezentai în figura 4.4 au fost intensiv studiai în literatura de specialitate. Compilarea a o serie de articole de sintez din revistele Biosensors B, Biosensors & Bioelectronics (Elsevier 1996-2004) arat ponderea tipurilor de mediatoriutiliza în biosenzorii cu enzime ( procentele din figura 4.4 reprezint ponderea apariiei tipului de mediator pentru 135 articole consultate).

Figura 4.4- Tipuri de mediatori utilizai în electrozii enzim

Sisteme bi-enzimatice Lucrri recente s-au focalizat pe comunicarea direct a transferului de electroni dintre enzime i electrozi. Succesele în domeniu sunt limitate la enzima peroxidaz HRP(horse redish peroxidaza) care catalizeaz reducerea peroxidului de hidrogen pentru un numr de compui organici. Cînd enzima este imobilizat pe electrod, necesarul de reductor organic este prevenit de electrodul însi care furnizeaz echivalenii reductori. Cuplarea peroxidazei cu o enzim ­oxidaz permite construcia de sisteme bienzimatice prin care peroxidul produs de oxidaz este detectat de sistemul electrod-peroxidaz care opereaz la poteniale mult mai mici în raport cu un electrod simplu de platin.(figura 4.5) De aici rezult i minimalizarea interferenelor speciilor active.

77

Figura 4.5 ­ Sisteme de senzori bi-ezimatici

Meecanisme implicate în senzorul amperometric enzimatic Amperometria, ramur a electrochimiei, care se ocup de fenomenele de reducere (adiie de electroni) i oxidare (eliminare electroni), e.g fenomene redox, prin msurarea curentuli electric la poteniale constante. În teorie orice ansamblu de atomi poate fi oxidat sau redus dac se furnizeaz suficient energie. În general domeniul de energii necesar pentru procesele redox este limitat de condiiile experimentale. Moleculele ce pot fi uor oxidate sau reduse se numesc electroactive iar potenialele la care acestea au loc se numesc poteniale redox. Oxidarea sau reducerea implic un transport de sarcin deci apare un curent electric i cum totul are loc într-o celul electrochimic sub un potenal aplicat între electrodul de lucru i unul de referin,acesta se numete adeseori ,,curent Faradeic". Curentul Faradeic este direct proporional cu concentraia analitului electroactiv.Transferul de sarcin ce apare în celula electrochimic este descris de ecuaia general:

O + ne = R

4. 1

unde n este numrul de electroni (e) transferai de la oxidantul O la reductorul R. Este un proces reversibil simplu care are loc la interfaa dintre electrod (sursa de electroni) i mediul ionic conductor ce conine speciile electroactive de analit. Curentul msurat (I) în timpul electrolizei este o msur direct a ratei reaciei electrochimice ce are loc la electrod:

I = nF

dN dt

4. 2

unde dN/dt reprezint viteza de reacie la electrod ( de oxidarea sau reducere), [mol/sec], N numrul de moli , F-constanta Faraday (96,845 C/mol) Viteza reaciei la electrod este direct proporional cu fluxul de molecule spre electrod, J (mol/sm2) i aria acestuia, A: 78

dN = AJ dt

4. 3

Combinînd ecuaiile 4.2 i 4.3 se obine ecuaia fundamental a tuturor proceselor implicate într-un biosenzor amperometric:

I = nFAJ

4. 4

Fenomene de difuzie: Datorit naturii heterogene a proceselor viteza de reacie depinde atît de rata de transfer de electroni la interfa i de transportul de mas de analit la electrod din volumul soluiei. Pentru un biosenzor amperometric, dealtfel pentru orice proces electrochimic, este necesar s se cunoasc modul de transport al analitului ca specie electroactiv la suprafaa electrodului. Dou procese sunt importante: difuzia i convecia. Difuzia este fenomenul de transprt al moleculelor dintr-un spaiu cu concentraie mare spre unul cu concentraie mic. Este o consecin a micrii perpetue a moleculelor i a echilibrrii potenialelor chimice. Fenomenul de difuzie are un rol important în procesele care stau la baza funcionrii senzorului amperometric. Dac considerm relaia (4.4) observm c transportul de substan electroactiv conduce la concentrarea analitului spre electrod. Iniial concentraia de O era uniform în tot volumul soluiei. Cînd curentul trece prin soluie concentraia de O la suprafaa electrodului devine mai mic fa de volumul soluiei datorit conversiei aces-tuia într-o form redus R. În acest context apare un flux suplimentar spre electrod dinspre soluie iar acest fenomen de difuzi este descris de prima lege a lui Fick:

J ( x, t ) = DO

cO ( x, t ) x

4. 5

unde DO este coeficientul de difuzie a oxidantului iar cO concentraia acestuia în volumul soluiei, x-direcia de transport spre electrod iar t-timpul, J-densitatea de flux de substan electroactiv (O), adic numrul de moli de substan transportai în unitatea de timp pe unitatea de suprafa. Curentul care trece prin biosenzor este dependent de fluxul de material spre electrod adic prin introducerea ecuaiei 4.5 în 4.4 obinem:

I = nFAJ (0, t ) = nFADO

cO (0, t ) x

4. 6

79

Stratul de difuzie Nernst: Una dintre cele mai simple ci de a înelege efectele dependente de timp asupra curentului electric ce trece prin electrod o constituie dezvoltarea conceptului de strat de difuzie introdus de Nernst (1904). Cînd un electrod este polarizat la interfaa sa cu fluidul au loc reacii de oxidare sau reducerece care reduc la zero concentraia analitului. Pentru a compensa scderea de concentraie are loc difuzia analitului din volumul soluiei spre electrod. La echilibru dintre viteza cu care se consum speciile la electrod i difuzia acestora din volumul soluiei se stabilete un profil specific al concentraiei funcie de distana de la electrod (figura 4.6). Pe figur se observ cîteva puncte cheie. Electrodul, bara neagr, este situat în partea stîng a figurii. Axa x este orientat dinspre electrod spre volumul soluiei cu originea pe suprafaa electrodului. Pe axa y este reprezentat concentraia analitului din soluie. Observm dou regiuni distincte în evoluia concentraiei. În volumul soluiei ea este constant i repre-zentat prin linia orizontal c=cO. A doua regiune situat lîng electrod prezint o cderea concentraiei spre zero. Aceast regiune, cunoscut ca stratul de difuzie Nernst are grosimea . Grosimea exact a acestui strat depinde de natura soluiei i de cinetica reaciilor la electrod. Pentru soluii omogene care nu sunt supuse agitrii sau altor factori grosimea stratului de difuzie se situeaz între 0,01 i 0,001 mm. O important presupu-nere a acestui model este c atunci cînd analitul atinge suprafaa electrodului acesta se consum instantaneu prin oxidare sau reducere. În practic aceasta este uor realizabil prin alegerea unui potenial de polarizare convenabil. În concluzie teoria stratului de difuzie ne arat c: · Exist întotdeauna un strat subire , staionar în contact cu suprafaa elec-trodului a crui grosime este dependent de procesele implicate i de natura soluiei. · În cadrul acestui strat difuzia controleaz Figura 4.6-formarea stratului de difuzie Nernst transferul de analit spre electrod prin gradientul de concentraie . · În afara stratului limit difuzia este neglijabil iar concentraia este meninut la valoarea c0 fie prin agitaie sau convecie Din figura 4.6, pentru cazul ideal, gradientul descreterii concentraiei este liniar astfel încît putem s scriem:

dc cO - ce = dx dc cO = dx

47

Deoarece concentraia la electrod, ce=0 atunci

48

i fluxul de substan prin stratul de difuzie conform cu 4.5 este 80

J = D0

cO

49

iar curentul limit prin stratul de difuzie spre electrod devine ( 4.6):

IL =

nFAD0cO

4.10

Astfel curentul electric de limitare datorit stratului de difuzie este direct proporional cu concentraia analitului i invers proporional cu grosimea stratului. Biosenzorul în condiii de neechilibru. Ecuaia Cottrell Cazul prezentat anterior referitor la formarea stratului de difuzie a fost evaluat în condiiile în care soluia cu analii era omogen sau supus unei agitaii continui pentru omogenizare. Rezultatele au artat un profil de difuzie staionar la suprafaa electrodului ( adic gradientul de concentraie nu se schimb în timp) i de aici a rezultat un curent staionar. Se va prezenta cazul apropriat de realitate cînd analiii sunt în cantiti foarte mici într-un volum dat de soluie nesupus agitrii. Pîn la aplicarea potenialului pe electrod soluia i electrolitul (de regul analitul) pot coexista fr ca o reacie chimic s aib loc. Cînd un potenial este aplicat pe electrod cu o valoare suficient de mare pentru a se iniia electroliza componentei electroactive (la t=0) atunci concentraia la suprafaa electrodului (x=0) se reduce la zero. Din acest moment se stabilete un gradient de concentraie cu o curgere de material dinspre soluie spre electrod. Întrucît soluia este staionar (fr micare prin agitare) stratul de difuzie nu va mai fi constant în grosime. El va crete dinspre electrod spre soluie iar gradientul de concentraie se va modifica continu în timp rezultînd un curent nestaionar pe electrod. Astfel va trebui s se dezvolte un nou tip de relaii de legtur pentru acest proces de schimbare a fluxului la electrod. A doua lege a lui Fick leag evoluia concentraiei de timp i spaiu. Pentru cazul unidimensional legea a doua a lui Fick se scrie:

cO ( x, t ) 2 cO ( x, t ) = DO t x 2

4. 11

unde toate variabilele au aceai semnificaie uzual. Ecuaia diferenial 4.11 are soluii diferite pentru diferite condiii de grani. Utilizînd transformata Laplace pentru ecuaia 4.11 se obine dependena concentraiei de parametrii x i t:

x c( x, t ) = c × erf Dt

c dc = Dt dx x =0

iar curentul la electrod se calculeaza din 4.6 cu înlocuirea expresiei din 4.13:

4. 12

unde erf- reprezint funcia eroare. Considerînd derivata funciei 4.12 la interfaa cu electrodul (x=0) se obine:

4. 13

81

i = nFAD

dc(0, t ) D = nFAc0 dx t

4. 14

cunoscut ca ecuaia Cottrell pentru orice proces ce implic difuzia într-un spaiu unidimensional, semiinfinit. În acord cu aceast ecuaie produsul dintre curent i rdcina ptrat a timpului este o constant, adic nu se stabilete un curent staionar pe suprafaa electrodului. Model matematic pentru electrodul enzimatic, regimul cinetic vs regimul difuzional Comportarea i performanele unui electrod enzimatic sunt strict dependente de o serie de factori (imobilizarea pe electrod, tipul de electrod, tipul de substrat de imobilizare, natura soluiei cu analii- fluidul biologic) care în final impun cinetica i transportul, elementele ce definesc parametrii de funcionare. Cu elementele de baz prezentate anterior precum i cu descrierea cineticii enzimelor se poate elabora un model de funcionare ce ne permite s stabilim parametrii de lucru a electrodului enzimatic. Fiind un electrod cu o enzim imobilizat pe suprafaa sa cinetica reaciei este dominant la interfa iar procesele de difuzie sunt dominante dinspre volumul soluiei spre electrod. Prin urmare cele dou procese sunt spaial separate (figura 4.7).

Figura 4.7-Model matematic de funcionare a electrodului enzim pe baza a dou procese concurente-cinetic i difuzional. Modelul const din trei regiuni: convectiv (x>L) unde concentraia analitului este meninut constant la c=Svol , difuzional (0<x<L) unde au loc procese de difuzie pur, cineticunde la x=0 au loc reaciile controlate de enzim

Pentru a surprinde procesele biochimice i fizice s-au impus cîteva simplificri: coeficienii de activitate i partiia analitului sunt considerai unitari pentru cele trei domenii, furnizarea de orice tip de co-substrat este constant i independent, enzima este distribuit uniform pe toat suprafaa electrodului la x<0, semnalul dat de senzor (curentul electric) depinde numai de generarea de produi care la rîndul lor sunt dpendeni de fluxul de analit (substrat) în senzor. Condiiile de grani sunt stabilite la cele dou interfee (c=S1) i în adîncimea stratului de enzim spre interfaa cu electrodul (c=0). 82

Utilizînd S1 ca referin pentru concentraia de substrat la intrarea în zona enzimei imobilizate i considerentele de cinetic enzimatic intuitiv se poate constata pentru concentraie o descretere exponenial care se exprim:

c ( x ) = S1 exp

De

x; x<0

4. 15

unde este Vmax/ KM iar De reprezint coeficientul de difuzie a substratului în stratul cu enzima imobilizat. Rspunsul senzorului este comtrolat de cinetica de reacie a enzimei dac aceasta se efectueaz cu o vitez mic fa de procesul general de difuzie. În aceste condiii i presupunînd c numai jumtate din produii generai de enzime difuzeaz spre electrod atunci curentul (Icinetic) de electrod poate fi exprimat ca:

I cinetic = nFAL

2 ( K M + [ S ])

k2 [ E ][ S ]

4. 16

unde se observ c este direct proporional cu grosimea stratului de enzime imobilizate , concentraia de enzime [E] i cea de substrat [S]. Pentru cazul în care încrcarea enzimei este mare ( KM <<[S]) atunci se atinge un curent maxim de:

I cin max = nFAL

k2 [ E ] 2

4. 17

Combinînd ultimele dou ecuaii se obine în final;

I cinetic = I cin max

[S ] ( K M + [ S ])

4. 18

relaie ce permite determinarea experimental a parametrilor electrodului enzim în regim cinetic de funcionare. O simpl analiz a ecuaiei de mai sus pune în eviden o comportare a curentului cinetic similar cu ecuaia Michaelis-Menten ce descrie cinetica enzimei. Rezultatele nu sunt surprinztoare deoarece rspunsul este dictatat în principal de reaciile enzimatice i nu de procesele de difuzie. Singura diferen dintre ecuaiile cinetice ale enzimei i relaia 4.18 este aceea c termenul vitez de reacie este înlocuit cu expresia curentului. În consecin i forma curbelor de rspuns este identic. În cazul în care procesele din stratul enzimatic de grosime d este mai rapid decît procesele de difuzie i transport ( adic concentraia S1 este aproximativ 0) atunci rspunsul senzorului este determinat de controlul transportului de analit. Concentraia S1 fiind neglijabil atunci ea este practic zero în tot stratul unde enzima este imobilizat. Aceasta este posibil cînd parametrul adimensional 2 este supraunitar:

2 =

d2

De

=

Vmax d 2 K M De

4.19

83

Acest parametru compar viteza de reacie enzimatic (Vmax/KM) cu difuzia prin stratul cu enzima imobilizat (d2/ De). Dac 2<1 atunci regimul cinetic este predominant iar dac 2>1 rspunsul este sub controlul difuziei. Analog situaiei cinetice se poate deduce o expresie general pentru senzorul operînd în regim limitat de procesele de difuzie astfel:

Id =

2 I max De [ S ] k2 [ E ]d 2

4. 20

Comparînd cele dou cazuri limit se constat c Id este dependent atît de grosimea d i de coeficientul de difuzie în timp ce Icinetic este dependent de L i independent de coeficientul de difuzie. Întrucît S1 reprezint maximul de concentraie posibil în stratul cu enzim atunci rspunsul liniar a senzorului va fi determinat de S1 cînd S1<< KM. Este posibil s determinm o expresie pentru S1 ca funcie de Svol astfel:

S1 =

Svol L 1+ De DS

4. 21

Aceast relaie arat c S1 este dependent de coeficienii de difuzie i poate fi optimizat printr-o atent selecie a parametrilor de difuzie DS, De ( difuzia în stratul de imobilizare i în stratul limit), grosimea L. În termeni operaionali creterea grosimii stratului de difuzie sau descreterea difuzivitii pot fi limitate prin caracteristicile de timp de difuzie prin membrana (stratul) de imobilizare. Timpul caracteristic de transfer prin membran (=L2/DS) este adesea factorul ce determin performanele senzorilor în general i a electrodului enzim în particular, parametrii cinetici sunt determinani în stabilirea regimurilor de lucru ale biosenzorului electrod enzimatic.

84

4.10 Referine

1. Tothill, I.E., Newman, J.D., White, S.F. and Turner, A.P.F. Enzyme and Microbial Technol,pp296 (1996) 2. Cullen, D.C. în "4th World Congress on Biosensors", 29-31 May, Bangkok, Thailand. Elsevier Applied Science, Oxford, UK. p. 50. (1996) 3. Fisher, U., Alcock, S.J. and Turner, A.P.F. Biosensors& Bioelectronics, 23, p 10, (1995) 4. Turner, A.P.F., Newman, J.D. and Rickman, A. "Optics for Environmental and Public Safety", Munich, Germany, 19-23 June 1995, Europto Series, Berlin, Germany. 5. Newman, J.D., Marazza, G. and Turner, A.P.F. Anal. Chim. Acta vol 262, 13 (1992). 6. Saini, S. and Turner, A.P.F. Trends Anal. Chem., vol14, 304 (1995) 7. Dennison, M.J., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Anal. Chem., vol 67, 3922 (1995). 8. Alcock, S.J., White, S.F., Turner, A.P.F., Setford, S., Tothill, I.E., Dicks, J.M., Stephens, S., Hall, J.M. and Warner, P.J. British Patent Application 9416002.5, (1994) 9. Skuridin, S.G., Yevdokimov, Y.M., Efimov, V.S., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Biosensors& Bioelectronics., 11, 903 (1996). 10. Psoma, S. and Turner, A.P.F. "3rd World Congress on Biosensors", 1-3 June, New Orleans, USA. Elsevier Applied Science, Oxford, UK, (1994) 11. Dobson, D.J., Turner, A.P.F. and S Saini,. Anal. Chem.(seriile 1990-1996) 12. Loughran, M.G., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Electroanal.7, 1 (1996). 13. Newman, J.D., White, S.F., Tothill, I.E. and Turner, A.P.F. Anal. Chem., 67, 4594 (1995 14. Jaffari, S.A. and Turner, A.P.F. UK Patent GB9402591.3 (1994) . 15. Selkirk, J.Y., Turner, A.P.F. and Saini, S. "4th World Congress on Biosensors", 29-31 May, Bangkok, Thailand. Elsevier Applied Science, Oxford, UK. p. 198. (1996) 16. Albers, W.M., Lekkala, J.O., Jeuken, L., Canters, G.W. and Turner, A.P.F. Bioelectrochem. Bioenerg. (1996). 17. Chen, B. and Turner, A.P.F. in"24th Symposium European Peptide Society", Edinburgh, Scotland, September, paper No 23 (1996) 18. D'Amico A,.DiNatale C. A Sensors Journal, IEEE, vol1, no 3, pp:183 ­ 190 (2001) 19. Muller R., Kamins T., Chan M. Device electronic for integrated circuits JohnWiley & Sons, 3rd edition, (2003). 20. DiNatale C., Salimbeni D., Paolesse R, Macagnano A., D'Amico A.. Sensors and Actuators B 65 220-6. (2000) 21. D'Amico A.et al. Sensors and Actuators B 7 685-8. (1992) 22. Walker N.J. Science 296 pp. 557­559. (2002) 23. Ciucu Anton, Biochimie analitic ­ Partea I, Ed U B, pp. 144,(2000) 24. Mutihac Lucia, Fundamentals of analytical biochemistry, Ed UB, pg. 194 (2005). 85

25. Dietrich B., Viout P.and Lehn J.M.: Macrocyclic chemistry: aspects of organic and inorganic supramolecular chemistry, Ed. Weinheim, New York : VCH, (1993). 26. Cram D. J. and Cram J.M: Container molecules and their guests, (Monographs in supramolecular chemistry no. 4, Stoddart J. F. (ed.)), The RoyalSociety of Chemistry, Cambridge, (1994). 27. Zolotov Y.A., Macrocyclic compounds in analytical chemistry (Chemical analysis: vol.143, V.Y. Nagy and Y.A. Zolotov (eds.)), Wiley, New York (1997). 28. Mutihac Lucia, Hans-Jürgen Buschmann, Mutihac Radu-Cristian, and Eckhard Schollmeyer , J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem.51, 1, 1-10, (2005). 29. Diamond D., G. Svehla, E. Seward and M.A. McKervey, Anal. Chim. Acta, 204, 22331. (1988) 30. Diamond D. and K. Nolan: Calixarenes, Anal.Chem., 73, pp. 22A-29A. (2001) 31. Asfari Z., V. Bohmer, J. Harrowfield and J Vicens: Calixarenes 2001,Kluwer Academic Publishers, Netherlands, (2001). 32. Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, Blackwell Science (1997) 33. Carr, P. W. and Bowers, L. D. Immobilized Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry , Blackwell Science (2000) 34. Kubo Y, Maseda S,Tokita S, Kubo M, Nature vol 382, pp522 (1996) 35. Buck L. and R. Axel, Cell, 65,175­187, (1991) 36. Caterina E et al. Nature 389, 27-28 (1997) 37. Corey D.P et al. Nature 432, 723­730, (2004) 38. Fleig A and Penner R. The TRPM ion channel subfamily: molecular, biophysical and functional features. TIPS 25 (12), (2004) 39. Friedrich R.V. Nature 430, 760-768 (2004) 40. Hallem E.A. et al. Cell 117, 965­979, (2004) 41. Basbaum Julius D. A.I.Nature 413, 204-207(2001) 42. Lin S-Y.,Corey D P, Current Opinionin Neurobiology 15:350­357, (2005) 43. Neher E, Nature Biotechnology 19,24-36 (2001) 44. Suh G.S.B et al.. Nature Neurosci 431, 657-658(2002) 45. Sukharev S. and Anishkin A.. Mechanosensitive channels: what can we learn from `simple' model systems? TINS 27(6),( 2004) 46. Voels et al., Nature Chemical Biology 1,26-35 (2005) 47. Shinichi Komaba, et all, Sensors and Actuator B:Chemical, 52, 1-2, 78-83 (1998) 48. Dinischiotu Anca, Costache Marieta, Biochimie generala, vol I, proteine, glucide i lipide, Ed. Ars Docendi,(2004) Costache Marieta, Anca Dinischiotu Biochimie general, vol II, acizi nucleici: structur i organizare,Ed. Ars Docendi,(2004) 49. Freitas Robert A, Nanomedicine, vol 1-4, (seriile 1998, 2004), (www.foresight.org/ Nanomedicine/NanoMedTOC.html) 50. Hui Peng, et all, Biosensors & Bioelectronics, 20,1821­1828, (2005) 86

51. Barboric Andrei, Principii i sisteme de msurare a mrimilor fiziologice, Ed UB, 117p, (2000) 52. Forster R.J, Chem Soc.Rev. 23, 4, pp 289 (1994) 53. Forster R.J, in Encyclopedia of Electrochemistry, P.A Unwin and A.J. Bard (ed) Wiley, New York, (2000) 54. Buck R.P, et al, Pure and Appl.Chem, 74, 11, pp 2169-2200 (2002) 55. Umezawa Yoshio et all, Pure and Appl.Chem, 74, 11, pp 923-994, (2002) 56. Umezawa Yoshio et all, Pure and Appl.Chem, 74 11, pp 995-1099, (2002) 57. Scheller Frieder, Schubert Florian, Biosensors, Ed Elsevier, (1992) 58. Freitag R, Biosensors in Analitical Biotechnology, UK, Ac. Press (1996) 59. Buerk D.G, Biosensors Theory and Applications, Lancaster, USA, technomic Publishing Comp. Inc (1993) 60. Hall E.A.H, Biosensors, UK, Open Univ. Press (1990) 61. Cornish-Bowden, A Principles of enzyme kinetics. London: Butterworth. (1976). 62. Fersht, A. Enzyme structure and mechanism, 2nd ed, New York: W.H.Freeman & Co.Henderson, P.J.F. (1978). 63. Stamatin Ioan, Berlic C., Vaseashta A., Thin Solid Films, 495, 1-2 p 312-315, (2006) 64 . Theâvenot Daniel R, et all, Pure Appl. Chem., 71,12, p. 2333-2348, (1999). 65. Cammann K. Fresenius Z. Anal. Chem. 287, 1 (1977). 66. Turner A. P. F, I. Karube, G. S. Wilson (eds.) Biosensors, Fundamentals and Applications. Oxford University Press (1987) 67. Bergveld P, D. R. TheÂvenot. Advances in Biosensors, Supplement 1 (A. P. F. Turner, ed.), p. 31. JAI Press,London, UK (1993). 68. Durst R. A, Baumner A. J., Murray R. W., Buck R. P., Andrieux C. P.. Pure Appl. Chem. 69, 1317 (1997). 69. Kutner W, J. Wang, M. L'Her, R. P. Buck. Pure Appl. Chem. 70, 6, 1301 (1998). 70. Ciucu Anton, Biosensors for environmental monitoring. Ed Niculescu, Bucuresti, pg. 352, (2000) 71. Inczedy J, T. Lengyel, A. M. Ure (eds.). IUPAC Compendium of Analytical Nomenclature, 3rd edn. Blackwell Science, Oxford (1998). 72. Bartlett P. N, P. Tebbutt, R. G. Whitaker. Prog. React. Kinet. 16, 55 (1991). 73. Scheller F. W, D. Pfeiffer. Z. Chem. 18, 50 (1978). 74. Bindra D. S, Y. Zhang, G. S. Wilson, R. Sternberg, D. R. Theavenot, D. Moatti, G. Reasch. Anal. Chem. 63, 1692 (1991). 75.Wollenberger U, F. Schubert, F. W. Scheller. Trends Biotechnol. 11, 255 (1993). 76.Theavenot D. R, P. R. Coulet, R. Sternberg, J. Laurent, D. C. Gautheron. Anal. Chem. 51, 96 (1979). 77. Aizawa M. Anal. Chim. Acta 250, 249 (1991). 78.Sugawara M, H. Sato, T. Ozawa, Y. Umezawa. In Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects (F. W.Scheller, F. Schubert, J. Fedrowitz, eds), pp. 121-131. BirkhaÈuser Verlag, Basel (1997). 87

79. Kiefer H., B. Klee, E. John, Y. D. Stierhof, F. Jaehnig. Biosens& Bioelectron. 6, 233 (1991) 80. Sugawara M., . Hirano A, Rehak M., Nakanishi J., Kawai K., Sato H., Umezawa Y. Biosens &Bioelectron. 12,5,425 (1997). 81. Ciucu Anton, Aplicaiile Analitice ale Biosenzorilor în Controlul Polurii Mediului, Ed Ars Docendi, Bucureti, pg 175, (2000) 82. Covington A. K. Pure Appl. Chem. 66, 565 (1994); Buck R. P, E. Lindner. Pure Appl. Chem. 66, 2527 (1994). 83. Cullen D. C, R. S. Sethi, C. R. Lowe. Anal. Chim. Acta 231, 33 (1990). 84. Ciucu A, C. Negulescu, R.P. Baldwin, Biosens& Bioelectron.,18,2-3, 293-300, (2003) 85 Noguer T., Gradinaru A., Ciucu A., J.L. Marty, Anal. Lett., 32, 1723-1738. (1999) 86 Amine A., M. Alafandy, J. M. Kauffmann. Anal. Chem. 67, 2822 (1995). 87.Guilbault G. G. Handbook of Immobilized Enzymes. Marcel Dekker, New York (1984). 88. Mosbach K (ed.). Methods in Enzymology, vol. 137. Acad Press, N Y (1988). 89. Cass A. E. G (ed.). Biosensors, A Practical Approach. IRL Press, Oxford (1990). 90. Go Èpel W, T. A. Jones, M. Kleitz, I. LundstroÈm, T. Seiyama (eds). Chemical and biochemical sensors. In Sensors, A Comprehensive Survey (W. GoÈpel, H. Hesse, J. N. Zemel, eds), vols 2 & 3. VCH, New York (1991). 91. Blum L. J, P. R. Coulet (eds). Biosensor Principles and Applications. Marcel Dekker, New York (1991). 92. Kas J., M. Marek, M. Stastny, R. Volf. In Experimental Techniques in Bioelectrochemistry (V. Brabec, D. Valz, G. Milazzo, eds), Chapter 6, pp. 361-447. Birkaeuser Verlag, Basel (1996) 93. Rajagopalan R, A. Aoki, A. Heller. J. Phys. Chem. 100, 3719 (1996). 94. Gorton L. Electroanalysis 7, 23 (1995). 95. See J. E. and E. T. Bell, Proteins and Enzymes, Marcel Dekker (1988). 96. Laidler K. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Claredon Press, London, (1958) 97. McNaught A. D, A. Wilkinson. Compendium of Chemical Terminology, 2nd edn. Blackwell Science, Oxford (1997). 98. Umezawa Y., K. Umezawa, H. Sato. Pure Appl. Chem. 67, 507 (1995). 99. Nistor C., J. Emneus, L. Gorton, A. Ciucu, Anal. Chim. Acta, 387, 309-326 (1999) 100. Lindgren A., Stoica L., Ruzgas T., Ciucu A., Lo Gorton, The Analyst, 124, 527532,(1999) 101. Ciucu A., Nica A.G., Gorton L, Rom. J. Biochem., 39 (1-2), 55-62. (2002)

88

5. Biosenzori microbieni

Exist dou clase de biosenzori microbieni ce folosesc acelai principiu: msurarea activitii metabolismului în prezena analitului. Prima clas utilizeaz microorganime imobilizate de la care se msoar produii rezultai din metabolism. Aceast clas a devenit comun definit ca biosenzori microbieni. A doua clas msoar activitatea electric a metabolismului microorganismelor atunci cînd consum un ,,biocombustibil", de exemplu glucoza. Aceast clas este cunoscut sub denumirea generic de celule bioelectrochimice sau celule de biocombustie. Fiind dezvoltat ca un domeniu separat al celulelor electrochimice generatoare de energie electric, pe baza consumului de biocombustibili, s-a neglijat aspectul capacitii acestora de a fi adevri biosenzori. Vom trata aceste dou clase separat punîndu-le în eviden performanele i capacitile lor din punct de vedere al cerinelor de a fi biosenzori. Biosenzorii microbieni conin microorganisme imobilizate i un lan de transducie mult mai diversificat (figura 5.1). În general sunt utilizai pentru un singur proces biochimic [1]. Senzorii microbieni prezint urmatoarele avantaje: · Sensibilitate mai mic la inhibare sau impurificarea analitului; · Au o toleran mai mare în ceea ce privete valoarea pH-ului i a temperaturii; · Au un timp de via mai lung decît electrozii enzimatici; · Sunt mai ieftini fa de electrozii enzimatici; · Variabilitate mare pentru c se adapteaz uor la condiii specifice de mediu; · Independen la cofactori; · Rspuns fiziologic la produii toxici; · Preparare uoar deoarece cultivarea microorganismelor este simpl; Dezavantajele acestor dispozitive sunt urmtoarele: · Au un timp de rspuns mai mare decît electrozii enzimatici; · Reutilizarea lor într-o nou msuratoare necesit un timp mai mare; În principiu schema unui senzor microbian este identic cu cea a unui biosenzor enzimatic. Schema const în imobilizarea celulelor intacte în contact intim cu un traductor specific care convertete produii sau efectele metabolismului într-un semnal biochimic (figura 5.1). Senzorii microbieni i-au gsit o serie de aplicaii industriale în procesele biochimice i microbiologice în domenii precum producerea medicamentelor, industria alimentar, tratamentul apelor reziduale i producerea de energie.unde reaciile de fermentaie i transfer de electroni au un rol important. În domeniul laboratoarelor clinice ­microbiologie, parazitologie-unde intensiv se utilizeaz medii de cultur senzorii microbieni pre89

zint un potenial important pentru implementare. Cele mai multe materiale din mediile de cultur nu pot fi determinate prin metode spectrofotometrice fiind optic inactive sau netransparente. O combinaie mediu de cultur-substraturi de imobilizare cu o cupla-re adecvat spre un traductor ca în figura 5.1 este fezabil cu avantaje asupra reducerii timpilor de investigare i rspuns la un diganostic specific. Monitorizarea continu, rapid, sensibil i controlul factorilor variabili deja menionai permit evaluarea substraturilor i produilor de metabolizare, a numrului de celule viabile prezente în culturi, a tipurilor de microorganisme.

O2 Analit NH3 H2S H+ Fotoni Microorganisme imobilizate Cldur

Electrod amperometri Electrod potentiometric

Oxigen

pH? Optrode Termistor

PPProcesare semnal

Figura 5.1 Schema de principiu a senzorului microbian

5.1 Principiu de funcionare 5.1.1 Biosenzori microbieni electrochimici

Biosenzorii microbieni conin microorganisme imobilizate într-o membran i un dispozitiv electrochimic. Clasificarea lor se realizeaz dup tipul activitii respiratorii msurate sau dup tipul activitii electrochimice, metabolice, optice etc. În cazul modificrii activitii respiratorii a microorganismelor, imobilizate într-un substrat, aceasta este detectat de un electrod de oxigen (fig.5.2 a). Prin msurarea activiti respratorii sau a consumului de oxigen se estimeaz concentraia substratului. În cazul msurrilor de produi de metabolizare se folosesc alte metode electrochimice (figura 5.2.b). Senzorul microbian electrochimic prezint importante diferene fa de senzorul enzimatic. El este alctuit din componente vii ce produce un rspuns fiziologic, în timp ce senzorul enzimatic include alterarea analitului. Microorganismele utilizate în acest caz sunt aerobe. 90

Senzorul se introduce într-o soluie tampon saturat cu oxigen. Dup adiia la substrat, activitatea respiratorie a microorganismelor crete, producînd scderea concentraiei oxigenului în apropierea membranei. Folosind electodul de oxigen, concentraia substratului poate fi msurat prin detectarea scderii concentraiei oxigenului. Un alt tip de biosenzor microbian detecteaz activitatea metabolic,electrochimic, cum ar fi: hidrogenul, dioxidul de carbon, amoniacul i acizii organici, care sunt secretai de microorganisme (figura 5.2b). Se pot utiliza atît microorganisme aerobe cît i anaerobe.

curent Anod plumb

Substrat

A

H2--------- Celula de combustie CO2--------- electrod gazos Substrat NH3--------- electrod gazos H+--------- electrod

B

Figura 5.2- Principiul de funcionare a senzorului microbian electrochimic a) Msurarea activitii respiratorii, catod Pt b) Biosenzor microbian ce msoar ali metabolii

Cei mai muli biosenzori microbieni se bazeaz pe msurarea activitaii respiratorii i folosesc activitatea microorganismelor aerobe. Traductorul acestui tip de biosenzor poate fi: electrochimic (poteniometric, amperometric), fotodetector, termistor, ISFET.

5.1.2 Biosenzori fotomicrobieni

Se bazeaz pe fenomenele optice ce le pot avea microorganismele în procesele metabolice: fotoluminiscen, electroluminiscen, chemoluminiscen, activitate optic specific (polarizare dependent de chiralitate, indice de refracie, absorban, etc). De exemplu intensitatea luminescenei fotobacteriilor (luminobacterii) este dependent de activitatea metabolic. Este astfel posibil de a construi biosenzori microbieni puternic senzitivi prin combinarea acestor fotobacterii cu un fotodetector. Luminescena in vivo a fotobacteriilor se produce prin urmtoarele reacii enzimatice:

NAD ( P ) - FMN NAD( P ) H + H + + FMN NAD( P) + FMNH 2 oxidoreductaza

E (luciferaza) + FMNH 2 E - FMNH 2 E - FMNH 2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H 2O + h

91

unde RCHO=aldehid alifatic i RCOOH=acid gras, FMN (flavin mononucleotid). Luminescena este puternic afectat de modificrile condiiilor externe pentru bacterii care pot conduce ulterior la acumularea accidental a concentraiilor intracelulare de NAD(P)H, FMN, H2, ATP i aldehide (sinteza enzimatic a aldehidelor necesit cofactor ATP). Utilizînd acest principiu pot fi detectate hrana acestor microorganisme (ex. glucoz i aminoacizi) i inhibitorii lor (ex. toxine i metale grele). Intensitatea luminescenei în general este un parametru mai sensibil pentru activitatea metabolic decît pentru activitatea de generare a cldurii. Mai mult chiar, rspunsul metabolic al celulelor poate cauza luminiscena la fotobacterii.

5.1.3 Termistor microbian

Biosenzorii microbieni pot fi construii prin plasarea microorganismelor imobilizate în imediata vecintate a unui termistor care msoar cldura metabolic absorbit sau cedat produs de acetia (Fig. 5.3). Acest tip de senzor se bazeaz pe principiul general al msurrii schimbului de entalpie. Deoarece multe reacii metabolice sunt însoite de o evoluie considerabil a cldurii, calorimetria se poate aplica pentru a msura o larg varietate de analii. Lipsa specificitii datorate principiului de detecie în general este compensat adecvat prin utilizarea biocatalizatorilor specifici, imobilizai. Oricum, partea cea mai mare a cldurii eliberat în reaciile metabolice poate fi pierdut în soluie fr a fi detectat de termistor i limiteaz sensibilitatea acestei tehnici. Tipuri de msurtori: entalpia reaciilor metabolice, clduri specifice, latente.Termistorii, elementul de transducie, sunt cei mai utilizai ei fiind realizai de obicei din materiale semiconductoare (în majoritate materiale oxidice i au în general un coeficient de temperatur negativ). Dei au fost raportate foarte multe cazuri de aplicaii ale calorimetriei în analizele biochimice, ea nu poate fi folosit ca o analiz de rutin datorit costurilor ridicate ale instrumentelor sensibile i complexe ce trebuiesc folosite pentru acest tip de msurtori. Ca exemplu, gelul de drojdie de bere este introdus în coloana separatoare de sticl care constituie ieirea termistorului. Soluia ce trebuie analizat este pompat printr-un schimbtor de caldur ce se afl în baia de ap, controlat termostatic i apoi prin coloana de sticl. Prin acest procedeu se poate msura glucoza , fructoza i caseina. Recent microminiaturizarea i introducerea elementelor de microfluidic a condus la o nou generaie de termistori microbieni care pot senza efecte termice de la un numr relativ mic de microorganisme. Un microtermistor microbian cons din asamblarea tuturor componentelor direct pe suprafaa semiconductoare a oxidului respectiv (figura 5.3b).

92

b a

Figura 5.3 Tipuri de termistori microbieni, a) cu reactor termostatat b) Cu microreactor construit pe termistor

5.2 Rspunsul fiziologic al senzorului microbian

Acesta include o serie de factori: · Substratul este absorbit prin membrana celular; · Respiraia; · Luminiscena i electrochimismul metabolismului bacteriilor; · Secreia sau separarea produilor metabolici de cei nemetabolici; · Modificrile sau degradrile intracelulare ale substratului prin secvene metabolice sau enzime ce nu particip la proces;

Figura5.4 Rspunsul fiziologic al senzorului microbian

93

Comportamentul microorganismelor este dat de starea fiziologic a lor i aceasta este dat de limitarea extrem a nutrienilor. Metabolismul este o condiie ce asigur supravieuirea celulelor [1]. Prima condiie critic pentru formarea unui semnal la senzorul microbian este utilizarea substratului (figura 5.4). Solutul poate intra în celule prin sistemul de translocaie specific, înti prin transport activ sau prin difuzie forat. Transportul pasiv realizat numai prin difuzie datorit gradienilor de concentraie de oxigen i nutrieni este de mic importan. Transportul activ asigur acumularea substanelor nutritive în substrat în sensul gradientului de concentraie. Aceasta face ca în substrat s se acumuleze proteine cu o înalt specificitate care se consum în metabolismul energetic. De asemenea cuplajul celulelor cu sistemul de transducie a fenomenelor energetice, în special în lanul respirator este un important aspect al transportului activ, fiind crucial pentru formarea semnalului în senzorul microbian, de exemplu folosirea glucozei, sucrozei, i a altor oligopeptide. Dup utilizarea substratului el este degradat specific de secvenele enzimatice prezente i care imobilizeaz celulele. Potrivit condiiilor aerobice, se consum oxigenul. Astfel acizii organici cum ar fi lactic i piruvaii , dioxidul de carbon, ionii de amoniu i hidrogenul sulfurat, sunt secretai i se acumuleaz în produi ai metabolismului celular. Este bine de amintit importana fierului în biologia bacteriilor, în general i mai ales la cele Gram pozitiv, în special. Multiplicarea eficient a bacteriilor patogene în esuturile organismului gazd este condiionat de prezena obligatorie a fierului feric, într-o form accesibil metabolismului lor. Fierul este necesar pentru anumite reacii enzimatice eseniale pentru cretere dar este i un component cheie al catenei de transport al electronilor în membrana celu-lar respiraie celular[2]. Prin urmare microorganismele cultivate pentru prepararea unui biosenzor microbian trebuie s provin din culturi pe medii echilibrate metabolic în ceea ce privete fierul feric, care s asigure o buna respiraie celular microorganismelor i o bun funcionare a electrodului Clark. Se pot folosi i alte tipuri de electrozi, în biosenzorii microbieni, combinaie cu electrozi pentru H2, CO2, NH3. Ei au o plaj mai mare de msurare, rspund la alte contaminri i au limite de detecie i sensibilitate mult mai mari fa de electrodul Clark. La o temperatur i presiune constant, standard, proporia de oxigen din aer, în volume, este de 20.9%. În soluie apoas i în echilibru cu aerul atmosferic, proporia de oxigen este tot de 20.9%, din totalul gazelor dizolvate. În amîndou cazurile în aer i în soluie, balana azotului este mai mare decît balana dioxidului de carbon.Concentraia gazelor dizolvate în soluie variaz cu temperatura, i poate fi afectat de solut sau ali solveni prezeni în soluie. De exemplu, o soluie cald reine mai puin oxigen decît o soluie rece. Prezena etanolului mrete semnificativ capacitatea unei soluii apoase de a reine oxigen. În studiile de specialitate se arat c micile diferene de temperatur pot afecta echilibrul mediului cu aerul din camer, la fel i unii reactivi pe care îi adugm în celula de lucru (de exemplu etanol). Selecia dispozitivului de transducie este dat de fiziologia celulelor pe care le utilizm în structura senzorului (respiraia, fotoluminiscena, gravimetria). Cel mai utilizat este tipul amperometric sau poteniometric, electrodul Clark i electrozii ion selectivi 94

de tipul ISFET. Se mai poate utiliza microbalana cu cristal piezoelectric, detector optoelectronic, termistori, sau ISFET dar electrodul de oxigen predomin în senzorii microbieni. Produii metabolici ca lactatul sau piruvatul, dioxidul de carbon , ionii de amoniu i de hidrogen sulfurat sunt determinai poteniometric cu electozi ion selectiv (ISE). Combinaia direct a microorganismelor cu un tranzistor cu efect de cîmp (FET) a fost dezvoltat pentru estimarea glucozei a alcoolului cu Acetobacter i a xilozei bazat pe celule de Gluconobacter oxidans. S-a constatat c o serie de mediatori solubili cu potenial redox, cum ar fi etosulfatul de fenazina, fericianida sau fericianida în combinaie cu benzochinona, au posibilitatea msurrii directe a electronilor urmrind activitatea metabolic a celulelor. Recent au fost utilizai mediatori insolubili cum sunt ferocenii, tetrahiafulvalenele i tetracianochinodimetanul, care au fost incorporate în paste de carbon în contact cu Paracoccus denitrificans .(figura 5.5).

Figura 5.5- Schema de functionare a biosenzorului microbian cu mediatori

O alt tehnic interesant de biosenzor microbian a fost creat prin luminiscena fotobacteriilor conectate cu un detector optic. Astfel a fost creat i descris un senzor microbian pentru determinarea ionilor de metal i a ionilor aromatici. Prin inginerie genetic genele ce rspund de emiterea luminii de la fotobacteria Vibri au fost transferate în structura genetic a bacteriilor Escherichia coli sau Seratia marscescens. Viitorul traductorilor în biosenzorii microbieni îl dein îns cristalele piezoelectrice, microbalanele cu cuar cu unul din electrozi funcionalizai. Prin combinarea microorganismelor cu enzime este posibil s creasc selectivitatea senzorului microbian. Aceste combinaii sunt capa-bile s determine biopolimeri, cum ar fi amidonul, proteinele i lipidele, ce nu pot fi apreciai cu ajutorul microorganismelor. Pentru aceasta microorganismele au fost combinate cu hidrolaze. A rezultat astfel un senzor hibrid, amperometric, pentru determinarea NAD+, ce are la baz celule de E. coli i NADase. Ureea i creatinina s-a determinat utilizînd o combinaie de bacterii nitrificatoare i ureaz sau creatinaz. Din experimente cu senzorul BOD s-a ajuns la concluzia c se pot combina mai multe specii de microorganisme i se pot utliza mai multe substraturi în acelai experiment. Un alt exemplu tipic de biosenzor coninînd populaii mixte din specii diferite de microorganisme avînd capaciti metabolice specifice îl reprezint biosenzorul cu bacterii nitrificatoare. Acest senzor care a fost dezvoltat în special 95

pentru investigarea apelor uzate conine culturi mixte din specii de Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp. În acest caz s-a folosit un sistem amperometric de msurare pentru determinarea amoniacului. Controlul oxigenului prin senzorul de oxigen este necesar pentru msurarea concentraiei de amoniac în eantionul de msurat. Pentru c biosenzorul reacioneaz i cu ali nitrii sau uree, de obicei se însumeaz cantitile de substane nitrificatoare. Principalul impediment este surplusul de substrat (amoniac sau uree). Acest procedeu, al combinrii diferitelor specii de microorganisme, este folosit cu succes i în domeniul toxicologiei. De obicei se poate folosi un inhibitor atunci cînd concentraia substratului este prea mare. O posibilitate este folosirea membranelor de dializ, atunci cînd substratul este în exces. Senzor electrochimic ­ microbian: detector de gaze. Acest tip de senzori este uor de fabricat i utilizat, deoarece obinerea unui semnal electro- chimic este cea mai rspîndit metod de obinere a semnalului de rspuns. Dispozitivele poteniometrice msoar densitatea de sarcin acumulat la suprafaa unui electrod. Un exemplu de senzor care utilizeaz voltametria ciclic este senzorul cu gaz. Senzorul CO2 folosete bacterii autotrofe. Este cel mai rspîndit din punct de vedere comercial, dar prezint dezavantajul c diverii acizi ionici i acizi organici sau anorganici volatili afecteaz potenialul din interiorul celulei, pH-ul i membrana gaz permeabil ce acoper electrodul. Bacteria autotrof, Pseudomonas S-17, care se poate dezvolta numai în prezena carbonailor, este sursa de obinere a carbonatului. Ea este incubat în condiii aerobe la 300C, timp de o lun i este imobilizat pe vîrful electrodului de oxigen. Pentru mrirea domeniului de selectivitate celula se acoper cu o membrana semipermeabil de PTFE. Sensibilitatea msu-rtorilor se obine folosind o soluie tampon, saturat în oxigen cu pH=6,5, coninînd ioni metalici i 20 moli de glucoz. Timpul de via al senzorului este mai mare de o lun. Fiind un senzor micro-bian, se utilizeaz la testarea alimentelor. Aplicatii ale biosenzorilor microbieni S-au construit multe tipuri de biosenzori microbieni ce sunt utilizai în monitorizarea virusurilor i în industria alimentar [3]. În tabela 5.1 sunt prezentate cîteva din multitudinea aplicatiilor biosenzorilor microbieni.

96

Tabela 5.1- Aplicaiile biosenzorilor microbieni SENZOR Microorganismul Dispozitiv imobilizat Zahar asimilat Brevibacterium Electrod O2 lactofermentum Glucoza Pseudomonas Electrod O2 fluorescens Acid acetic Trichosporon Electrod O2 brassicae Etanol Trichosporon Electrod O2 brassicae Metanol Unidentified bacteria Electrod O2 Acid formic Citrobacter freunca Celula combustie Metan Methylomonas Electrod O2 flagellata Acid glutamic Escherichia coli Electrod O2 Cepholosorin Citobacter freunda Electrod pH BOD Trichosporon Electrod O2 cutaneum Lisina Escherichia coli Electrod O2 Amoniu Nitrilying Electrod O2 bacteria Dioxid de azot Nitrilying Electrod O2 bacteria Nistatin Saccharomices Electrod O2 cerevisiae Acid nicotinic Lactobacillus Electrod pH araboesis Vitamina B1 Lactobacillus Celula fermenti combustie comumitate -----Celula microorganisme combustie mutageni Bacillus subtilis ree Electrod O2 Nota: a-mmol; b-p.p.m ; c- unit/cm3; d-numr/cm3

Timp de Domeniu raspuns De masura min mgxdm-3 10 10-200 10 10 10 10 30 2 5 10 15 5 10 3 1h 1h 6h 15 1h 2-2510 3-60 3-25 5-2510 10-103 0-6,6a 8-800 100-55*102 3-60 10-107 0,05-1 0,51-255b 0,5-0,54c 10-5-5 103-107 108-109 d 1,6-2,85*103

97

5.3 Referine

De Anthony P. F. Turner, Ursula Bilitewski, Biosensors for Environmental Monitoring, pp421, Ed Taylor &Francic, (2000) 2 Veronica Lazar, Microbiologie medical, Ed. Univ. Bucureti, (2001) 3 Y. Lei et al., Analytica Chimica Acta 568 200­210, (2006)

1

98

6. Senzori pe structuri semiconductoare FET

6.1 Tranzistori FET, ISFET, CHEMFET, REFET

Tranzistorul cu efect de cîmp (FET) este adesea folosit ca traductor pentru senzorii i biosenzorii electrochimici. FET este un traductor ce poate converti o informaie chimic într-un semnal electric. FET are un rspuns rapid i selectiv pentru analit, un timp de via de ordinul lunilor i permite un înalt nivel de integrare i miniaturizare. Din principiul de funcionare FET-urile sunt capabile s msoare conductana unui semiconductor funcie de un cîmp electric perpendicular pe suprafata oxidului de la poart. În cea mai simpl versiune (ex.: MOSFET ­ metal ­oxid-semiconductor FET) el este alctuit dintrun substrat de siliciu dopat tip p ce conine dou regiuni de difuzie de tip n (sursa i drena). Dac substratul este dopat n atunci poarta i drena sunt dopate cu acceptori p. Structura este acoperit cu un strat dielectric de bioxid de siliciu pe care este depus un electrod de metal ( figura 6.1). Cînd un potenial este aplicat la electrodul poart purttorii minoritari din substrat sunt atrai la suprafaa semiconductorului. Astfel, conducia electric dintre surs i dren este modificat funcie de potenialul aplicat dintre poart i substrat [1-5]. În cazul ISFET (ion-selective field effect transistor), electrodul de metal de la poart al MOSFET-ului este înlocuit de o soluie de electrolit care este în contact cu electrodul de referin i cu bioxidul depus pe poart. SiO2 (figura 6.1b). Electrodului de referin poate fi considerat ca poart pentruMOSFET.

Figura 6.1 Schema reprezentativ a structurilor a) MOSFET, b) ISFET

În ISFET, curentul electric Id, curge de la surs la dren printr-un canal. Ca în MOSFET, rezistena canalului depinde de cîmpul electric perpendicular pe direcia curentului. Deasemenea, depinde de diferena de potential de la poart oxid-electrolit. În consecin conducia electric a canalului nu este direct influenat de tensiunea aplicat pe 99

poart datorit acumulrilor de sarcin la interfaa oxid-electrolit. Cînd SiO2 este utilizat ca dielectric, natura chimic a oxidului de la interfa este reflectat în mrimea curentului surs ­ dren. Suprafaa oxidului de la poart conine grupe funcionale ­OH, care se afl în echilibru electrochimic cu ionii din soluia probei (H+ i HO-). Grupele hidroxil de la suprafaa oxidului de la poart pot accepta sau ceda protoni iar o schimbare de pH va modifica potenialul de la suprafaa SiO2. Cinetica disocierii locale descrie traducerea semnalului în funcie de starea de ionizare a grupelor SiOH de la suprafaa amfoteric. Valorile standard ale sensibilitii pH msurate cu ISFET_SiO2 sunt 37 ­ 40 mV/unitate pH. Selectivitatea i sensibilitatea ISFET sunt controlate complet de proprietile la interfaa electrolit/dielectric. Alte materiale anorganice de poart pentru senzorii pH ca Al2O3, Si3N4, Ta2O5 au proprieti mai bune decît SiO2 la rspuns în pH, histerezis sau drift mai mic.ISFET-urile au fost alese ca elemente traductoare pentru c suprafaa de SiO2 conine grupe reactive SiOH care pot fi folosite pentru atari covalente ale moleculelor organice i polimerilor [6-10]. MEMFET, SURFET ISFET-ul poate fi modificat cu o membran sensibil, ce conine ionofori. Dac oxidul este acoperit cu o membran sensibil la ioni, acest lucru este cunoscut sub denumirea de MEMFET. În acest caz, stratul este penetrabil pentru ionii specifici iar potenialul membranei se modific fiind detectat de structura FET. Un FET sensibil la ionii de potasiu K+ a fost obinut prin acoperire din solveni cu o membran PVC plastifiat coninînd valomicina la suprafaa oxidului de la poarta. SURFET este un ISFET cu un strat ce blocheaz anumite specii de ioni, sensibili la pH ul dielectricului porii. La suprafaa acestui strat, potenialul de suprafa este stabilit de asocierea selectiv a ionilor. Un exemplu de SURFET este ISFET-ul cu poart de perilen cu molecule benzo 18crown-6 ionofore ce selecioneaza ionii de potasiu. În contrast cu MEMFET, unde coeficientul de asociere al ionoforilor cu ionii recunoscui de membran determina selectivitatea, în SURFET este acelai proces dar faza apoas (electrolitul) controleaz selectivitatea.[7-12,18,21] CHEMFET ISFET-urile modificate cu membrane plastifiante PVC sunt lipsite de o interfa bine definit. Studiile au artat c schimbri în concentraiile de dioxid de carbon influeneaz puternic msurtorile. Acest lucru a fost atribuit difuziei dioxidului de carbon prin membran cu formarea acidului carbonic la interfaa dintre membran i oxidul de la poart. Consecutiv, concentraia protonilor, care determina potenialul la interfaa membran-dielectric, prezint variaii mari. Acest fenomen se explic prin existena unei cantiti mari de ap în PVC în consecin i o concentraie apreciabil de H+. Rolul de interpunere a CO2, duce la necesitatea unei mari cantiti de ap din interiorul matricei membranei, în consecin un nou tip de membran se impune. Dup mai multe încercri descrise în literatura de specialitate, s-a gsit soluia de a modifica direct suprafaa oxidului prin ataarea de grupe funcionale sau de membrane funcionalizate cu 3­(trimetoxi-silil) propil metacrilat. Noile tipuri de senzori se numesc CHEMFET (chemically modified 100

FET) care pare s rezolve în mare masur problemele. Suprafaa modificat cu metacrilat poate mai departe reaciona cu monomerii vinil, metacril sau prepolimeri. Utilizarea monomerilor fotopolimerizabili hidroxietil metacrilat (HEMA) este avantajos din punct de vedere al produciei a CHEMFET-urilor, care este în general bazat pe fotolitografie. Introducerea unui asemenea strat de hidro-gel, în care o soluie apoas tampon de sruri poate fi absorbita, între oxidul de la poart i membran elimin interferarea CO2 la rspunsul CHEMFET. Mai mult, acesta stabilizeaz potenialul dezvoltat în membrana senzitiv (figura 6.2). Rspunsul pentru diferite valori de pH respectiv pentru diferite poteniale de referin sunt prezentate în figura 6.3.

a b

Figura 6.2 ­ a) Model de senzor CHEMFET, cu electrodul de referin (RE) în soluie tampon b) Reprezentarea schematic a dispunerii în CHEMFET a straturilor de polimer modificat pe poarta de SiO2,.Rolul hidrogelului HEMA i a membranei modificate chimic de selectare ioni i transfer de ioni

Figura 6.3 - a) Caracteristici ale sistemului CHEMFET ­electrod de referin Ag/AgCl- înregistrate pentru o soluie tampon cu pH=4, b) Curentul de dren , Ids, în diferite soluii tampon (pH=4, pH=7, pH=10) pentru acelai potenial Vref= -2V

Problemele interfeei membran/poart, au fost rezolvate prin funcionalizare HEMA cu funciuni hidroxietil astfel asigurîndu-se atari chimice a gelului poli (2 hidroxietil metacrilat) (poliHEMA) între membrana hidrofob i stratul de oxid de la poarta. 101

Aceasta nou arhitectur a FET-urilor ne permite s facem noi senzori chimici cu membrane polimerice ce conin receptori moleculari. Au fost dezvoltai cîiva tranzistori CHEMFET selectivi la K+, Na+, Ag+, cationi a metalelor tranziionale (Pb2+, Cd2+) i la anioni (NO3-). Senzorii prezint un timp de via limitat din cauza extragerii prin dizolvare a componenilor electroactivi, adic liganzii i locurile ionice. Componenii electroactivi cu lipofilie crescut pot fi aplicai pentru a crete durabilitatea senzorului, dar o metod mai eficient este bazat pe ancorarea covalent a acestor componeni la matricea membranei. Utilizarea membranelor ce conin legturi covalente ionofore i locuri ionice dispuse la legturi covalente îmbuntesc semnificativ durabilitatea CHEMFET-urilor [816] REFET Utilizarea electrozilor convenionali de referin limiteaz în mare masur aplicaiile ISFET-urilor în domeniile unde se cer dimensiuni reduse ale acestora. Dezvoltarea unui electrod de referin miniaturizat (REFET ­ reference field effect transistor) este de mare interes pentru aceti senzori. Una dintre incercrile de a rezolva problema este fabricarea electrozilor prin ink-jet sau screen printing (serigrafie) din Ag/AgCl ce includ o cavitate umplut cu gel i un tampon poros de siliciu. Toate construciile au dezavantajul unei caviti interioare umplute cu lichid, ceea ce înseamn un timp de via limitat din cauza lipsei soluiei de referin. O mai bun rezolvare a problemei electrodului de referin poate fi utilizarea a dou ISFET-uri chimice diferite, ce opereaz diferenial cu un electrod de cuasi-referin (QRE) comun (ex.: metal conductor, Pt) care poate fi integrat cu uurin pe un cip. Acest dispozitiv are avantajul adiional c poate reduce perturbrile externe ce influeneaz ambele ISFET-uri (ex: lumina i temperatura). Suprafaa oxidului de la poart are sensibilitate la pH datorit prezenei grupelor hidroxil care se pot disocia i pot accepta protoni. S-a gasit c eliminarea total a grupelor sensibile la pH nu poate fi realizat prin modificarea chimic a monostratului. Sensi-bilitatea la pH poate fi diminuat ataînd la suprafaa porii un strat polimer hidrofob blocator de ioni. În aceast modificare polimerul este chimic legat la suprafaa porii, ceea ce se traduce printr-un timp de via îndelungat. Pentru straturile blocatoare de ioni, o ataare stabil a fost realizat prin depunere în plasm. Oricum, au fost observate variaiile potenialului cu compoziia electroliilor pentru REFET-uri modificate. Depunerea de straturi polimerice foarte subiri este limitat din cauza diminurii sensibilitii electrice (transconductana cete cu grosimea dielectricului). În contrast cu polimerii blocatori de ioni, modificarea REFET-ului cu polimeri neblocatori de ioni (conductivi) au avantajul unei trans-conductane echivalente a REFETului cu ISFET-ul. Asemenea membrane hidrofobe neblocatoare de ioni dau senzorului un timp de via mai scurt dac nu sunt ancorate chimic la suprafa. Dou tipuri de structuri REFET pot fi distinse ce rezolv problema penetrrii ionilor în stratul polimer rezultînd din dou mecanisme diferite de operare. Într-o structur REFET neblocatoare de ioni exist schimb de ioni între soluie i polimer iar la echilibru termodinamic dintre ionii din soluie i cei din polimer conduce la potential electric al membranei. Într-o structur blo102

catoare de ioni REFET, schimbul de ioni este neglijabil i în acest caz potenialul electric msurat este potenialul suprafeei rezultate din reaciile reversibile ion-compleci de la interfaa polimerului [8-20].

103

6.2 Referine

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Bergveld P., IEEE Trans. Biomed. Eng., BME-17, 70 (1970). Sze, S. M., Physics of Semicondutor Devices, Wiley, New York 431, (1981) Dolocan V., Fizica electronica a starii solide, Ed. Academiei 1(984) Munteanu I., Fizica solidului, Ed Credis, (2005) Bousse L., and Bergveld P., Sens. Actuators, 6, 65 (1984). Van den Berg A., Bergveld P., Reinhoudt D.N., and Sudholter E.J.R., Sens. Actuators, 8, 129 (1985). 7. Bousse L., de Rooij N.F., and Bergveld P., IEEE Trans. Electron. Devices, ED- 30, 1263 (1983). 8. Sibbald A., IEE Proc., 130, 233 (1983). 9. Blackburn G.F., and Janata J., J. Electrochem. Soc., 129, 2580 (1982). 10. Van der Wal P., Skowroñska-Ptasiñska M., van den Berg A., Bergveld P., Sudholter E.J.R., and Reinhoudt D.N., Anal. Chim. Acta, 231, 41 (1990). 11. Sudholter E.J.R., van der Wal P., Skowroñska-Ptasiñska M., van den Berg A., Bergveld P., and Reinhoudt D.N., Anal. Chim. Acta, 230, 59 (1990). 12. Fiedler U., and Ruzicka J., Anal. Chim. Acta, 67, 179 (1973). 13. Mascini M., and Palozzi F., Anal. Chim. Acta, 73, 375 (1974). 14. Brzózka Z., Holterman H.A.J., Honig G.W.N., Verkerk U.H., van den Vlekkert H.H., Engbersen J.F.J., and Reinhoudt D.N., Sens. Actuators, 18-19, 38 (1994). 15. Reinhoudt D.N., Engbersen J.F.J., Brzózka Z., van den Vlekkert H.H., Honig G.W.N., Holterman H.A.J., and Verkerk U.H., Anal. Chem., 66, 3618 (1994). 16. Van der Wal P.D., Sudholter E.J.R., and Reinhoudt D.N., Anal. Chim. Acta, 245, 159 (1991). 17. Cobben P.L.H.M., Egberink R.J.M., Bomer J.G., Bergveld P., Verboom W., and Reinhoudt D.N., J. Am. Chem. Soc., 114, 10573 (1992). 18. Cobben P.L.H.M., Egberink R.J.M., Bomer J.G., Haak J.R., Bergveld P., and Reinhoudt D.N., Sens. Actuators, 6, 304 (1992). 19. Dumschat C., Fromer R., Rautschek H., Muller H., and Timpe H.-J., Anal. Chim. Acta, 243, 179 (1991). 20. Smith R.L., and Scott D.C., Proc. of the Symposium on Biosensors, IEEE 84, CH2068-5, 61 (1984). 21. Smith R.L., and Scott D.C., IEEE Trans. Biomed. Eng., BME 33, 83 (1986). 22. Kuisl M., and Klein M., Messtechnik, 36, 48 (1983). 23. Bergveld P., van den Berg A., van der Wal P.D., Skowroñska-Ptasiñska M., Suholter E.J.R., and Reinhoudt D.N., Sens. Actuators, 18, 307 (1989). 24. van den Berg A., van der Wal P., Ptasiñski D., Sudholter E.J.R., Reinhoudt D.N., and Bergveld P., Proc. of the 2nd International Meeting on Chemical Sensors, Bordeaux, , 419. (1986)

104

7. Biosenzori cu fibr optic

Biosenzorii optici coreleaz variaia concentraiei masei, cu modificarea unor parametri caracteristici luminii: lungimea de und, indicii de refracie, polarizarea, absorbana, extincia, fluorescena, chemiluminiscena, rezonana plasmonilor de suprafa (SPR) Exist cîteva configuraii tipice de biosenzori pe fibr optic, ele fiind sistematizate în figura 7.1

1 3 4 A B R 2 R a R b c Led C

FD

Figura 7.1 ­ Trei tipuri de biosenzori cu fibr optic. Principii de funcionare

Senzori optici: A- principiu de functionare: 1-fibra optica incidenta 2-radiatia reflectata, 3-fereastra, 4- reactiv -R B- tipuri de senzori: a-cu fibra optica bifurcata, b- monofibra cu separare radiatie incidenta/reflectata c- transmisie C- senzor otic pentru determinarea albuminei O-film albumina, ///-membrana bromcrezol,verde FD- fotodioda

Ei încorporeaz una sau dou fibre optice. Dac este folosit doar o fibr optic, este necesar ca cele dou radiaii luminoase: cea incident i cea de referin, s se modifice în timp i de asemenea s îi modifice lungimea de und.Lumina incident trebuie s fie în limitele unghiului de reflexie total, deci forma geometric a suprafeei senzorului are o importan esenial (figura 7.1 A). Cel mai important domeniu de aplicaie al unui asemenea tip de senzor este determinarea fluorescenei celulei, care depinde de raportul NADH/NAD intracelular, obinînd asfel o msurare precis a strii celulei. Senzorii optici prezint urmtoarele avantaje: · Nu sunt perturbai de cîmpul electric, · Pot fi utilizai în msurtori repetate în msurtori repetate, · În timpul msurtorilor proba rmîne neschimbat, din punct de vedere chimic i fizic · Se folosete cu protecie la întuneric; lumina diurn influeneaz procesele de msurare. Pe lîng fibra optic, aceti senzori mai conin o surs de lumin i un traductor de semnal. Principiul de funcionare se bazeaz pe dependena dintre concentraia substratu105

lui i absorbia luminii sau variaia oricrui tip de proprietate optic. Membrana sau suportul senzorului, acoperit cu coninut de oxigen sau cu ali indicatori de pH, markeri fluoresceni, prezint reacii de cuplaj cu diferite enzime cum ar fi conversia glucozei, lactozei, etanolului si complexului antigen ­ anticorp. Senzori optici cu oxidani imobilizai pentru determinarea glucozei, acidului uric i penicilinei au fost obtinui de Kobayashi [1]. În acest caz msurarea semnalului se face prin chemiluminiscen care depinde de conversia peroxidului de hidrogen la luminol. Semnalul de rspuns al suprafeei respective la lumina transmis de fibr, sub aciunea peroxizilor permite msurarea peroxidului de hidrogen, ATP-ului i NADH-ului [2].În figura. 7.1.C este prezentat senzorul optic pentru determinarea albuminei serului uman. Schimbarea culorii bromcrezolului verde este folosit pentru msurarea semnalului. Shimbarea polarizrii luminii sau a grosimii substratului ne dau informaii asupra cuplajului molecular cînd nu intervin reacii auxiliare. Prin aceast metod, formarea complexului de molecule mari antigen- anticorp absorbit de o suprafa reflectant de siliciu poate fi sesizat direct ( figura 7.2)

Cuva 1 2 3

V(mV) gelatina IgG T(min) Imunosenzor reflectometric 1-radiatie laser incidenta, 2- radiatia reflectata 3- fotodioda Dependenta semnalului masurat functie de grosimea stratului data de reactia dintre G(IgG) si anti IgG; gelatina este adaugata prin absorbtie nespecifica oe suprafata substratului de siliciu Anti IgG

Figura 7.2- Principiul de funcionare a imunosenzorilor reflectometrici

Figura7.3 ­ Experimentul Tyndall

7.1 Fibre optice, caracteristici generale

În 1870 Tyndall (figura 7.3) a demonstrat c lumina se poate propaga într-un jet de ap curbat. Acesta poate fi considerat ca primul pas spre comunicaii prin medii optice · Spre sfîritul secolului, Alexander Graham Bell a fost primul care a încercat s transmit informaii în sensul modern, folosind lumina. Dispozitivul su se numea fototelefon i era folosit pentru a transmite voce cu ajutorul luminii solare pîn la distana de 200 m. Lumina solar era modulat de emitor cu ajutorul unei diafragme acionat de microfon. Receptorul capta lumina emis de emitor i o concentra pe o rezisten de seleniu prin care trecea un curent, proporional cu fluxul luminos care cdea pe rezisten · În anul 1934, americanul Morman French a patentat un dispozitiv numit telefon optic, dispozitiv care unea ideile lui Bell si Tyndall. Patentul descria un aparat care transmitea vocea cu ajutorul luminii, ca mediu de comunicaie fiind folosit un cablu optic 106

· În anul 1964, Premiul Nobel a fost atribuit inventatorilor laserului într-un articol publicat în anul 1966 în Anglia Charles Kao si George Hockham susineau c fibra optic putea fi folosit pentru a transmite informaii; totui, exista o problem: pentru a putea face posibil transferul prin fibra optic, aceasta trebuia s aib o atenuare mai mic de 20 dB/km, comparat cu 1000 dB/km obinui în acel moment. · În anul 1970 compania Corning Glass Works din Statele Unite a reuit s obin o atenuare mai mic de 20 db/km cu fibr optic multimod step index la 633 nm · În anul 1972 se fabricau fibre optice multimod cu index gradient ce aveau o atenuare de 4 dB/km. · În prezent, atenuarea unei fibre optice monomod cu index treapt este mai mic de 0,20 dB/km la lungimea de und de 1550nm. Fibra optica este un mediu de comunicaie folosit pentru a transmite semnalele luminoase. În termeni tiinifici, fibra optic este un ghid de unda pentru radiaiile electromagnetice. Avantaje ale fibrei optice asupra tehnologiilor convenionale: · Distane mari între repetoare (peste 120 km comparat cu 2 km la sistemele bazate pe pulsuri electrice mare importan pentru comunicaiile de date i pentru aplicaiile industriale o are faptul c transmisiile prin fibra optic sunt imune la interferene exterioare · Distanele mari între repetoare la fibr optic sunt posibile datorit atenurii mici a semnalului; fibrele optice singlemode au o atenuare mai mic de 0,20 dB/km, ceea ce înseamn c dup 40 de km parcuri în fibr, 10% din semnal rmîne Tehnicile de msurare optic au aparut de mai mult de un secol, dar actualul reviriment în domeniul deteciilor cu fibra optic a început în deceniul 7, odat cu dezvoltarea conecticii pe baza de fibra optica pentru industria de telecomunicaii. Anterior, cu citeva mici excepii, msuratorile precise cu ajutorul fibrelor optice erau efectuate în laboratoarele metrologice. La sfîritul anilor 1970, a devenit tot mai evident c fibrele optice ar putea fi utilizate pentru a conecta sursa optica i aparatura electronica de detecie pentru msurtori, permiînd chiar folosirea celor mai sensibile tehnici interferometrice în medii ostile precum tuneluri de vînt i în mediul submarin. Cercetrile iniiale s-au axat pe folosirea senzorilor cu fibr optic pentru monitorizarea parametrilor fizici precum temperatura i presiunea, dar in deceniul 8 s-a constatat ca exista un potential real in domeniul chimic si medical. Un fapt important a intervenit în anul 1989 cînd s-a inventat o tehnic simpl de producere a fibrelor optice cu reele Bragg. Figura 7.4 arat construcia unei fibre optice tipice din silice (bioxid de siliciu). Un miez cilindric din sticl este înconjurat de ctre un înveli construit dintr-o sticl cu un indice de refracie mai mic.

107

Figura7.5- Elementele constructive ale fibrei optice

Pentru protecie sunt adugate mantale de plastic. Fibrele optice pot fi într-o varietate de mrimi, dar un invelis obinuit are un diametru de 125 micrometri, în timp ce miezul variaz de la cîiva micrometri pîn la 50 micrometri. Proprietile de baz privind propagarea luminii pot fi inelese din punct de vedere conceptual prin principiul reflexiei interne totale [3], care se refer la incidena unei unde de lumin la contactul dintre dou materiale cu indici de refracie diferii. Cînd fasciculul de lumin trece dintr-un mediu cu indice de refracie mare într-un mediu cu un indice de refracie mai mic, acesta apare la un unghi r mai mare decat unghiul de incidenta i (Figura 7.5a). Aceasta înseamn c, în cazul creterii unghiului i, se va ajunge ca unghiul r sa fie de 900, cunoscut ca unghi critic (ic) (Figura 7.5b). Dac unghiul de inciden este mai mare de ic, atunci radiaia luminoas este reflectat, înveliul exterior comportîndu-se ca o oglinda (Figura 7.5c). În cazul unei fibre optice, atît timp cît fasciculul este incident pe suprafaa de contact dintre înveli i miez, la un unghi mai mare decît cel critic, acesta va fi reflectat si deci confinat în miez.

Figura7.5- Ilustrare a propagrii luminii dintr-un mediu cu indicede refracie n1 într-un mediu de refracie cu n2 (n1>n2) i a fenomenului de reflexie total, principiu de baz a propagrii luminii într-o fibr optic.

Recent, au inceput sa fie produse fibre optice avînd în componena lor goluri de aer dispuse axial, de diferite forme. Prima categorie se compune din fibre în care zona conductoare este format dintr-un defect constînd dintr-un gol de aer într-o structur omogen (Figura 7.6b,c). 108

Figura 7.6- Tipuri de fibr optic de ultim generaie

În figura 7.6 b fibra este format prin adugarea goluri suplimentare în structura fibrei. În acest caz, miezul este cel care are un indice de reflexie mai redus prin comparaie cu materialul ce-l înconjoar astfel, propagarea nu poate surveni prin aplicarea principiului reflexiei interne totale. În schimb, în partea alcatuit din goluri axiale propagarea este oprit pentru o anumit lungime de und. În figura 7.6 c defectul are un indice de refracie mai mare fa de miezul fibrei: propagarea luminii se realizeaz prin acelai proces ca i la fibrele convenionale, defectul formînd un miez cu un indice de reflexie ridicat în timp ce structura încojurtoare defectului se comport ca un înveli cu un indice de reflexie mai sczut decît cel al miezului, determinat de forma i proporiile relative ale aerului i sticlei;

7.2 Fibre optice cu reele Bragg induse

Reele de tip Bragg sunt o modificare local în structura intern a fibrei prin reflectarea unui fascicul de lumin de o anumit lungime de und, în timp ce le permite celorlalte s treac. Lungimea de und pentru care un fascicul de lumin este reflectat de-pinde de presiunea sau temperatura aplicat în zona reelei Bragg; astfel, prin activarea unei surse de lumin cu un spectru larg de lungimi de und în fibra optic i prin monitorizarea lungimii de und a razei reflectate, cu ajutorul unui spectrometru, se poate msura temperatura sau presiunea aplicat. Reelele Bragg prezint un interes special pentru c acestea se formeaz în interiorul fibrei. Senzorul astfel format este extrem de compact si poate fi înglobat cu uurin în alte materiale compozite. În plus, cîteva reele Bragg pe aceeai fibr permite funcionarea lor în sistem multiplex, permiînd astfel msurtoro în multiple zone. Printre senzori de un considerabil interes actual se afl fibrele optice cu reele Bragg [4]. Acesta este un sensor intrinsec cruia i-a fost impus o modulare periodic spaiala a indicelui de refracie a miezului unei fibre monomod. Modulaia este produs în mod normal de expunerea fibrei la dou unde de lumin ultraviolet; interferena lor produce o distribuie în variatia intensitatii axiale (Figura 7.7). Modificarea indicelui de refracie este continu. Sensibilizarea la lumina ultraviolet se produce în mod obinuit datorit dopantilor folosii pentru controlarea indicelui de refracie a miezului. Soluia alternativ const în sensibilizarea fibrei prin expunerea la hidrogen, prin expunere la presiune mare [5]. 109

Efectul în fibrele optice cu reele Bragg const în reflectarea undelor de lumin ce satisfac condiia Bragg B= 2n unde n este indicele de refracie, iar este distana dintre maximele modulaiei indicelui de refracie. Ambele depind de presiunea i temperatura la care este supus fibra optic cu reele Bragg. Astfel, prin iluminarea fibrelor optice pe reele Bragg cu o sursa de lumin cu un spectru larg de lungimi de und i monitorizarea lungimii de und a fasciculului reflectat se poate msura temperatura i presiunea.

Figura 7.7- Principiul senzorului cu retea Bragg de interferen: B=2n, n-indice de refracie, distana dintre dou maxime consecutive, Blungimea de und a radiaiei reflectate

7.3 FOBS în medicin

Fibra optic ca senzor poate fi plasat în pielea pacientului sau în interiorul corpului lui pentru a msura direct parametri biomedicali. Senzorul cu fibr optic este propus a se folosi în multe i rapide determinri medicale, iar aplicaiile lui se extind continuu. Indubitabil, proliferarea acestor tipuri de aplicaii pentru senzorul cu fibr optic conduce la un numr mare de aplicaii i combinaii ale acestora care în viitor vor conduce la microminiaturizare, versatilitate, funcionalitate. El poate fi ataat în interiorul unui cateter i introdus în esutul hipodermic, realizînd o minim monitorizare acolo unde este nevoie. Senzorul cu fibr optic este netoxic, inert chimic, i se poate folosi cu succes în interiorul organismului. El se poate asocia cu echipamente pentru monitorizarea pacientului. Este simplu de manipulat cu greutate neglijabil. Evoluia senzorului medical cu fibr optic se bazeaz pe multiplele performane i biocompatibilitate. Biocompatibilitatea este primul pas în confortul pacientului, biosenzorul nu trebuie s afecteze parametrii fiziologici a organismului dar nici funcionalitatea lui nu trebuie compromis de produii de dezasimilaie a pacientului. Senzorii cu fibr optic pot fi clasificai ca extrinseci, fibra acioneaz ca o cale pentru semnal i intrinseci, interaciile survin în fibra însi. Se disting trei tipuri de FOBS: 110

· Senzori noninvazivi care sunt în contact cu pielea; · Senzori minimal invazivi, care sunt introdui în cavitile organismului; · Senzorii invazivi, care sunt introdui în organele interne sau in vasele de sînge

Aplicaii în medicin

În ultimul deceniu fibr optic este un produs foarte folosit în toate domeniile de vîrf ale tiinei i tehnologiilor avansate. Era de ateptat ca i tiintele medicale s beneficieze de aceste avantaje pe care le ofer fibra optic, atat în ceea ce privete costurile dar i competenele acestui material nou. Avînd în vedere uurina cu care se poate manipula, posibiliti nelimitate de sterilizare, costuri reduse, se poate estima c acest produs va cuceri tot mai mult piaa medical. Pîn în prezent se cunosc urmtoarele domenii medicale care au recurs la folosirea de biosenzori cu fibr optic: · În medicina de urgen i în cardiologie: analiza elementelor sîngelui, saturaia în oxigen a hematiilor, analiza gazelor sîngelui, pH ul sîngelui. · În monitorizarea respiraiei · În angiologie:,monitorizarea perfuziilor microvasculare. · În aprecierea refluxului biliar prin absorbia direct a bilei de ctre pigmentul biliar, bilirubin. · Determinarea facil a pH-ului stomacului; se introduce un microabsorbant indicator si modulator de pH, acid ­alcalin. · În oncologie se urmrete monitorizarea temperaturii în timpul curelor de terapie citostatic, sau se diagnosticheaz tumorile de dimensiuni mici i foarte mici, greu abordabile. · În oftalmologie, se poate depista o cataract la debutul ei. · În dermatologie se poate testa calitatea i integritatea straturilor pielii, se pot depista tumori de dimensiuni mici, se poate folosi în cosmetic pentru refacerea esuturilor prin stimulare, sau în eritema. In ceea ce privete diagnosticul unor piodermite se poate folosi un biosenzor cu fibr optic, care se bazeaz pe consumul de oxigen (BOD ). · În stomatologie se pot diagnostica cariile de dimensiuni foarte mici care sunt inaparente, sau cele de sub alte lucrri dentare. De asemeni se poate aprecia culoarea dinilor sau integritatea nervului dintelui.[6]. Principalele tipuri de aplicaii ale senzorilor în scopuri biomedicale sunt prezentate în tabelul 7.1:

111

Tabela 7.1 ­ FOBS- aplicaii medicale, clasificare Cardiovascular, terapie intensiva 1. 2. 3. Saturarea cu oxigen a sîngelui PH-ul sîngelui Continutul de gaze din sînge PCO2 (presiunea parial) Reflectana direct a elementelor din componenta sîngelui. Fluorofori legati covalent pe o matrice de celuloz ataat pe captul FO 3. Determinarea pH cu fluorofori în contact cu o soluie tampon de bicarbonat. Concentraia de CO2 ­ msurat prin pH ca o variatie a presiunii partiale 4. Fluorofori fixate in matrice polimera la capatul fibrei optice; atenuarea fluorescentei cu concentraia de oxigen Rata respiratiei: fibra optica în conductul nazo-faringian; Modificarea reflexiei cauzata de umiditatea aerului in timpul respiratiei Msurarea debitelor prin efect Doppler a radiaiei laser; retroimpratierea radiaiei laser; analiz spectral. Microdeformarile fibrei optice sub aciunea presiunii sîngelui . Fibra optic se dispune între plci rigide Controlul Bilirubinei pH- controlat de variatii alcalin-acide din tractul digestive; Microsfere: Metacresol purpuriu ­ albastru bromophenol fixat in poliacrilamide situate in capatul fibrei optice, care la randul lui este imersat in tubul de dializa Atenuarea fluorescenei Recunoaterea naturii tumorii prin tehnici de autofluorescenta: excitare cu laser He-Ne a unui tesut si analiza fluorescentei prin fibre optice Interferometrie Fabry­Pérot Imprastierea dinamica a luminii 1. 2.

Monitorizarea respiratiei

Angiologie 1. 2. 3. 4. Perfuzie microvasculara Fluidica sîngelui Fluxuri biliare pH - stomacului

Oncologie 1. Monitorizarea temperaturii în timpul terapiei 2. Diagnoza tumoral 3. Presiune Oftalmologie Analiza evolutiei cataractei Dermatologie Controlul dermatologic pielii Stomatologie 1. Culoarea dentara 2. Starea pulpei dentare al

Umiditatea pielii Spectroscopie de reflexie de banda larga Saturarea cu oxigen a pulpei dentare

Monitorizarea sîngelui , oximetria

Ca rspuns la cererile medicilor, senzorii cu fibr optic pot monitoriza acum electroliii din sînge precum potasiu, sodiu i calciu, in plus fata de coninutul de gaze în sînge. Aici miniaturizarea fibreilor optice este din plin folosit. În figura 7.8 este prezentat un cateter din fibre optice (0,5 mm diametru) ce poate fi introdus în aorta descendent capabil prin cele trei tipuri de fibre s msoare concentraia de gaze i pH ul sîngelui: msu112

rarea saturatiei oxigenului, care reprezinta cantitatea de oxigen transportata de hemoglobina din hematii în funcie de capacitatea sa maxim. Materialele din care sunt alctuii traductorii chimici sunt ionofori care se pot fixa reversibil de electrolit un separator molecular (spacer) i respectiv fluoroforul. Gradul de fluorescen, prin excitaie cu diode electroluminiscente în violet, este modulat de ionofori proporional cu concentraia de analit.Senzorul este utilizat fie extracorporal în circuitul extern de analiz a gazelor din sînge fie intracorporal pentru monitorizarea continu a gazelor sanguine în cazul situaiilor critice ale bolilor copiilor nou nscui.

Figura 7.8 ­ FOBS-oximetru, pentru monitorizarea gazelor din sânge Senzorul este introdus prin cateter în circuitul aortei nou nscutului

Accidentul cerebrovascular este cauzat de reducerea cantitii de sînge ctre creier. Dac durata lipsei de alimentare cu sînge a creierului este prea mare, celulele creieruului vor suferi schimbri ireversibile. Din acest motiv monitorizarea strii celulelor este de o mare importana. ocurile hemoragice sunt datorate rupturii vaselor sanguine sau cele ischemice datorate ocluzrii vaselor (prin depuneri sau arteroscleroza). Parametrul chimic capabil s monitorizeze starea celulei este pH deoarece acidul lactic, format cînd esutul celulei moare produce o descretere în pH. Orice scdere a pH ului sîngelui de la 7,4 indic prezena moriicelulei. Cele mai recente realizri în domeniu sunt senzorii de pH invazivi ce determin starea celulei. Senzorul este format din colorant fluorescent încapsulat într-o matrice de gel (poliacrilamid) ataat la captul fibrei optice. Colorantul, seminaftorodamina-L-carboxilat este caracterizat prin emisia formei acide centrat pe 580 nm i a formei alkaline centrat pe 680 nm. Cele dou forme sunt sensibile la pH. Excitaia apare la 533nm pentru ambele forme. Separarea emisiei se realizeaz direct prin filtre optice iar sensibilitatea este 0.05 uniti pH mult sub limita standardelor clinice admise (0.1 pH).

Monitorizarea streptococilor mutans din saliva uman i oraganul cutanat

Caria dentar este o afeciune multifactorial, o afeciune bacterian, care este caracterizat de o demineralizare a poriunii anorganice a dintelui i de o distrucie orga113

nic a substanei dintelui. Numeroase expe-rimente efectuate pe animale de laborator au scos în eviden c fiecare carie dentar are ca agent etiologic o specie de streptococci mutans. Adevrata cantitate de ageni patogeni din interiorul cariei este dat de dimensiunea cariei. O investigaie pe un numr de 235 de copii, cu vîrste între 11-12 ani cu nici o carie dentar sau cu mici modificri ale structurilor dinilor, sugereaz c acest test salivar poate aduce reale informaii despre riscul cariei dentare în special în cazurile în care medicul stomatolog nu poate evalua acest risc prin tehnicile obinuite. Studiu în acest sens a artat cu usurin c aciditatea bacteriilor din genul Streptococcus mutans i Lactobacilli, ce formeaz colonii de 105 per mililitru sunt predictibile pentru riscul de carii dentare [7, 8]. Coninutul salivei umane în ceea ce privete încrctura bacterian este de aproximativ 109 per mililitru de saliva. De aceea saliva poate fi considerat un mediu selectiv pentru creterea bacteriilor [9] A fost demonstrat o corelaie semnificativ între numrul streptococcilor mutans în saliv i prevalena lor în problemele dentiiei [10]. O metod simpl a fost adaptat pentru detecia i numrarea streptococcilor mutans, numit Dentocult SM, în anul 1998[11]. Dentocult SM este un dispozitiv produs de Orion Diagnostica, Espoo, Finlanda, ce const dintr-un suport special fabricat cu un mediu de cultur cu agar salivar ce contine 20% sucroz. Acesta este inoculat cu saliv i densitatea creterii streptococcilor umani este apreciat dup o incubare de 48 de ore la 37 de grade C. Identificarea este morfologic a coloniilor distincte pe agar selectiv i neselectiv, pe forma distinct a celulelor, vizibil în lumina microscopului. Aceast tehnic are i unele mici dezavantaje, acelea c are nevoie de timp mai mult pentru creterea bacterian i totodat necesit laboratoare adiionale, situate pe lîng cabinetele stomatologice. Pentru a monitoriza activitatea streptococcilor în saliva uman a fost creat un biosenzor cu fibr optic (FOBS) care monitorizeaz reaciile cu sucroza mediate de Streptococci mutans printr- un indicator fotosenzitiv imobilizat intr-un învelis de sticl poroas. Suprafaa miezului fibrei optice este tratat sau îmbracat într-un film de sticl poroas utilizînd tehnica sol-gel [12]. Analiza spectroscopic a artat c exist dou faze distincte în absorbia luminii la 597 nm pe o durat de 120min: una între 0-60 minute, i alta de la 60-120 minute. Aceast investigaie arat potenialul enorm pe care îl au biosenzorii în monitorizarea activitii microorganismelor în organismul uman. Tehnica sol-gel este utilizat pentru imobilizarea indicatorului fotosenzitiv, este simpl în vreme ce principiul mediului selectiv bacterian este folosit ca transfer specific pentru streptococii mutans necesit timp i este laborioas. De aceea FOBS se dovedete a fi un test rapid de msurare cantitativ a activitii streptococcilor mutans în Saliv.Totodat acest test se poate adapta i la alte domenii medicale unde activitatea bacterian este implicat în distrucie celular, sau tisular. În figura 7.9 este descris metoda de formare a unui biosenzor dintr-o fibr optic pentru observarea i detecia S. Mutans. Experimentele acestui studiu au urmrit faza de 114

recunoatere biochimic a semnalului i faza analizei spectroscopice. Criteriile care au stat la baza conceperii unui montaj experimental [13, 14]: 1. Streptococcii mutans sunt parial anaerobi avînd o cretere optim la 370C, 2. Glucoziltransferazele i fructoziltransferazele din streptococcii mutans, catalizeaz sinteza glucanului insolubil în ap i a polimerilor de fructan, în sucroz, formînd acid lactic ce se regsete în saliva acid 3. Streptococcii mutans din saliva uman, sintetizeaz atît polizaharide extracelulare cît i intracelulare, din sucroz 4. Polizaharidele extracelulare ajut adiia bacteriilor la suprafaa dintelui, în timp ce polizaharidele intracelulare sunt stocate pentru energia bacteriilor. 5. Aceste polizaharide, intracelulare, ajut bacteria s continue fermentaia chiar i atunci cînd nu exist o form exogen de hran 6. Tolerana acid a streptococilor face ca activitatea lor s continue chiar i la un pH sczut. 7. Un pH indicator, fotosenzitiv, produce o culoare caracteristic, conform unui gradient de culoare, în funcie de pH ­ul salivei i este folosit la construcia FOBS. Pe baza acestor considerente s-a conceput i realizat un montaj experimental cu un spectrometru UV-viz cu fascicul dublu în care în locul unei cuve s-a introdus fibra optic. În cuva de referin s-a utilizat soluia tampon cu albastru de bromfenol pentru diferite valori de pH, de la 4 la 7. Un experiment iniial a ajutat la determinarea lungimii de und i a picului caracteristic pentru indicatorul din soluia tampon i pentru diferite valori de pH din saliv, induse de activitatea bacterian.

Figura 7.9- Senzor cu fibr optic pentru investigarea microorganismelor din saliv i organul cutanat

Analiza spectroscopic în UV-viz. la un pH de 4 i 7 al soluiei cu albastru de bromfenol a artat un pic proeminent la 590 nm lungime de und. Intensitatea picului descrete de la pH 7 spre 4. Compararea cu datele din literatur au artat o concordan 115

bun observîndu-se c în mediu cu saliv, sucroz i albastru de bromfenol absorbia a fost stabil la 590 nm lungime de und pentru un interval de timp de 15 min, 30min, 1h i 24 de ore [15].De notat c pentru fiecare set de fibre corodate i procesate ca în figura 7.9 necesit calibrare independent datorit neomogenitilor rezultate din etapele de pregtire a fibrei optice ( de origine OceanOptics- fibre pentru spectrometrul HR-2000)

7.4 Referine

1 Kawachi M. Kobayashi M., Opt. Lett. 9, 183- (1984) 2 Mrs Bulletin, Review in optical sensors May ( 2002) 3 Hecht E. Zajac A., Optics ,Addison-Wesley, Reading, MA, p. 81 (1974). 4 Rao Y.-J., Meas. Sci. Technol. 8 p. 355,(1997) 5 Bennion I., Williams J.A.R., Zhang L., Sugden K., Doran N.J., Opt. Quantum Electron. 28 p. 93, (1996) 6 Baldini F. Mignani A. G., Bulletin Materials Research Society, vol. 27, no. 5, (2002) 7 Kneist S, et all, Journal of Dental Research 75, 1251-1259 (1998) 8 Emilson C. G, Bratthall D, Journal of Clinical Microbiology 4, 95-98. (1976) 9 W. H. Bowen. Salivary influences on the oral micro flora. în: Saliva and oral health, second ed. Brithish Dental Journal, London,(1996) 10 Gronroos L., Quantitative and qualitative characterization of mutans Streptococcus in saliva and in dentition, Academic dissertation, University of Helsinki, Finland. (2000) 11 Alaluusua S, M.Nystrom, Gronroos L, Peck L, Caries research 23, 49-54 (1989) 12 Brinker C. J, Scherer G. W,. Sol-Gel Science: the Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing. Academic Press, New York (1990) 13 Collins C. H,. Patricia M. L., Grange J. M, Microbiological Methods, 7th ed. Butterworth-Heinemann Ltd, Great Brritain (1995) 14 Lazar Veronica, Microbiologie medical, Ed. Univ. Bucuresti. (2001) 15 Kischen A. et all. Biosensors and Bioelectronics 18, 1371- 1378, (2003)

116

8. Celule de biocombustie

O major provocare pentru dezvoltarea aparatelor medicale implantabile este gsirea surselor de curent potrivite. Acestea trebuie s fie capabile s genereze energie electric pentru perioade lungi de timp. Celulele sau pilele de biocombustie (BFC) promit mult în acest sens prin funcionarea lor pe baza reaciilor pereche oxidarea glucozei ­ reducerea oxigenului molecular la ap. În condiii ideale, produsele secundare ale BFC ar fi dioxidul de carbon i apa. Glucoza i oxigenul sunt amîndou prezente în celulele i esuturile tuturor organismelor eucariote, inclusiv ale oamenilor. Este posibil, dealtfel, introducerea lor între resursele organismului, chiar i a proprietilor metabolice ale celulelor noastre pentru a genera suficient energie pentru alimentarea aparatelor clinice cum ar fi sisteme de transport al medicamentelor, aparate de diagnosticare i dispozitive de cretere uman.

8.1 Necesitatea implementrii surselor alternative de energie

O problem foarte complex, creia tiina i tehnica contemporan trebuie s-i gseasc soluie, este ritmul mereu crescînd al nevoilor energetice, provocat de dezvoltarea continu a industriei i de creterea numrului de consumatori în toate sectoarele vieii sociale. În prezent se studiaz o întreag gam de metode pentru generarea i stocarea energiei. Termeni ca economia hidrogenului, biocombustibili, combustibili regenerabili, celule fotovoltaice, pile de combustie sunt alternative la noi surse de energie ce trebuie s înlocuiasc cile clasice. Un argument indiscutabil în favoarea cutrii altor ci de conversie a energiei, îl reprezint faptul c rezervele de combustibili fosili fiind în scdere (petrol: 40 ani, crbuni: 224 ani, gaze naturale: 62 ani), costul lor va deveni curînd inacceptabil. Dioxidul de carbon, cel mai insiduos poluant este produs de vehicule i industrie în cantitate mai mare decît cea pe care plantele verzi o pot converti înapoi, la oxigen, prin procesul de fotosintez i concentraia acestuia în atmosfer crete în timp. CO2 absoarbe radiaia IR, Pmîntul înclzit de Soare reradiaza ca un corp negru la cca 300K i aceast energie reradiat înclzete atmosfera; astfel, o parte din gheaa polar se va topi conducînd la o cretere a nivelului apelor mrilor i oceanelor. În consecin, trebuie rezolvat problema folosirii energiei "curate" i trebuie gsit o cale convenabil de stocare a energiei electrice (indiferent cum ar fi obinut ea), care s permit folosirea ei dup necesiti i în locaii cît mai diversificate. Lumea pare a fi în pragul unei noi ere, a tehnologiei avansate i a noilor combustibili. Atenia cercettorilor este îndreptat ctre surse neconvenionale de energie, ca de exemplu: eoliene, solare, hidraulice, geotermale, mareice, nucleare. Aceste tipuri de energie nu sunt disponibile în orice moment, fiind variabile, imprevizibile i, în general, netransportabile de la locul de producere ctre cel de utilizare. Dar alte surse neconven117

ionale de energie, precum pilele de combustie, reprezint o alternativ posibil pentru viitor deoarece pot conduce la randamente superioare fa de cele obinute în prezent. Sistemele bazate pe motoare termice funcioneaz cu randamente de pîn la 50%, în timp ce teste tehnice au indicat pentru pilele de combustie randamente electrice de 70% Rolul celulelor de combustie în viitor depinde de viteza cu care se vor epuiza combustibilii fosili i de viteza cu care vor deveni disponibile noile surse de energie. Dar, chiar dac energia solar va fi disponibil din abunden, pare probabil c va fi folosit pentru a obine H2 prin electroliza apei, care va fi stocat i trimis prin conducte (sub form gazoas) sau în rezervoare (sub form lichid) la locurile de trebuin, unde va fi folosit pentru a produce energie electric cu ajutorul unor celule de combustie H2/O2 (din aer). Printre cile cele mai noi de generare a energiei electrice, celulele de combustie au o utilizare tot mai divers i eficient o dat cu dezvoltarea i implementarea materialelor nanostructurate în elementele lor pasive i active. Transformarea energiei chimice în energie electric, prin intermediul pilelor de combustie, deschide un larg domeniu de aplicaii i prefaeaz noi descoperiri în domeniul mijloacelor de conversie direct a energiei chimice sau nucleare în energie util

8.2 Celule de biocombustie-celule bioelectrochimice

Celulele sau pilele de combustie sunt dispozitive care transform energia chimic a combustibililor (hidrogen, gaz natural, gazolin, etc.) i a oxidantului (oxigen sau aer) în energie electric. Prile componente ale unei celule combustibile sunt: electrozii (locul de producere a reaciilor electrochimice), electrolitul (asigur transferul ionilor de la anod la catod) i conductorii electrici (asigur transferul electronilor prin circuitul exterior). Sub influena catalizatorilor, de obicei metale platinice sau aliaje ale acestora, la anod se produce oxidarea hidrogenului, iar la catod reducerea oxigenului cu formarea i eliminarea produilor finali (ap, electricitate i cldur). Principiile care guverneaz performana pilelor de combustie sunt cele termodinamice i cinetica proceselor de electrod pentru reaciile care au loc la interfeele electrod ­ electrolit. Celulele de combustie se clasific în principal dup dou criterii. Unul ia în considerare temperatura de funcionare iar cellalt electrolitul pe care-l utilizeaz. Clasificarea se poate face inînd seama i de natura combustibilului (gazos sau lichid) sau de faptul c pila este alimentat direct cu combustibil sau cu produsul obinut dup o prealabil reformare a acestuia. Dup natura electrolitului utilizat se deosebesc urmtoarele tipuri de pile de combustie[1]: · Celule de combustie cu electrolit alcalin (AFC) · Celule de combustie cu membrane schimbtoare de protoni (PEMFC) · Celule de combustie cu electrolit acid fosforic (PAFC) · Celule de combustie pe baz de metanol (DMFC) · Celule de combustie cu electrolit de tip carbonat topit (MCFC) · Celule de combustie cu electrolit de tip oxid solid (SOFC) · Celule de combustie regenerative (RFC) 118

· Celule de combustie pe baz de zinc i aer (ZAFC) · Celule de combustie cu acizi solizi respectiv superacizi (SAFC) · Celule de biocombustie = Celule bioelectrochimice (BFC)

8.3 Mecanisme în celulele bioelectrochimice

Celulele bioelectrochimice numite celule de biocombustie microbiene (MFC) sunt dispozitive ce extrag electroni din metabolismul microorganismelor prin cuplarea oxidrii glucozei cu reducerea oxigenului molecular la ap. Electronii care apare în plasma membranei bacteriene sunt extrai din lanul metabolic i canalizai ctre electrozi unde se descarc pe o sarcin electric din circuitul exterior. Pentru creterea efcienei transferului de electroni din plasma membranei ctre electrozi au fost folosii mediatori electronici (electronofori). Aceste molecule au proprieti speciale de intermediere a transportului de electroni de la memebrana celulei microorganismelor la electrozi. Mediatorii intr în lanul de transport electronic, fiind redui în proces, dup care se reoxideaz transferînd electroni anodului celulei.

Figura 8.1. Reprezentarea schematic a principiului de funcionare a unei celule de combustieMicrobiene. Rolul mediatorului (dreapta) solubul care poate fi transportat în bacterie pentru reducere sau reducerea poate aprea la suprafaa membranei. Mediatorul are rol de extraacie electroni din procesul de metabolizare a materiei organice de ctre bacterie i transportul acestuia ctre anod

Principiul de funcionare a MFC ce utilizeaz combustibil glucoza i un mediator de transfer de electroni este descris în figura 8.1. Oxidarea complet a unui mol de glucoz în dioxid de carbon va elibera 24 moli de electroni. Astfel, este disponibil o sarcin total de 2.32x106 C per mol de glucoz. Curentul generat de acest proces oxidativ va depinde de viteza metabolismului i de eficiena transferului electronic ctre electrod. Celulele de biocombustie microbiene sunt compuse din dou compartimente separate de o membran permeabil pentru protoni (PEM). Un compartiment este pentru anod iar cellalt pentru catod. Principiul funcionrii acestor celule de biocombustie este strîns legat de procesele biochimice care apar în organismele microbiene, anume glicoliza, ciclul acidului citric i lanul de transport electronic. 119

Electronoforii intervin în timpul procesului de transport electronic, transportînd electroni din plasma membranei bacteriene ctre anod. Protonii pompai din bacterie în mediul anodic traverseaz PEM spre compartimentul catodic. Mediatorul (cel mai cunoscut fiind fericianura) este oxidat din nou în fericianid, în timp ce ionii de hidrogen se combin cu oxigenul formînd ap. Pentru fericianur mecanismul de oxidare-reducere este bine cunoscut:

Pe baza cunotinelor actuale despre funcionarea celulelor de biocombustie se fac eforturi pentru maximizarea curentului i puterii prin: · compararea i folosirea de combinaii diferite de bacterii i electronofori [2, 3, 4] · folosirea de culturi mixte de bacterii [5],6,7 · folosirea mediului anaerob la anod [2,3, 6,7,8 , 9, 10] · creterea vitezei de alimentare (cu zaharuri) i ali biocombustibili [7] · modificarea electrozilor cum ar fi imobilizarea electro-noforilor [2, 4, 7, 11] i folosirea polimerilor conductori [11], materiale carbonice nanostructurate · barbotarea de oxigen în compartimentul catodic [2,10]. Pentru celulele de biocombustie microbiene au fost raportate densiti de curent în jur de 1.5mAcm-2 [7,11], puteri de pîn la 3.6 Wm-2 [7]. Rabaey et al [7] au folosit în experimentele lor o cultur amestecat de bacterii investigînd influena vitezei de alimentare cu glucoz asupra puterii. S-au folosit electrozi de grafit obinuit. S-a observat o recuperare a electronilor de 89% pentru viteze de hrnire de 0.5 g L-1 pe zi. În studiul lui Schroeder et al [11], a fost folosit un anod de polimer activ modificat catalitic (polianilin). A fost folosit o cultur bacterian de Escherichia Coli K12. Cel mai clar dezavantaj al întregului proces a fost costul de producere al electrozilor. Au fost obinute densiti de curent comparabile cu cele ale echipei Rabaey et al [7]. Valorile pentru cureni din literatur în celule de biocombustie microbiene s-au situat între 1 Acm-2 i 30 Acm-2. Unele articole au asigurat o atmosfer anaerob la anod [2,6, 8-9] i oxigen barbotat în compartimentul catodic [2, 10]. Aceti factori au contribuit împreun pentru producerea de cureni mari. De obicei atmosfera anaerob se obine prin trecerea de azot i dioxid de carbon prin compartimentul anodic. Eliminarea oxigenului conduce la creterea transferului de electroni de la bacterie la electrod mai mult decît prezena lui. Aerarea compartimentului catodic îmbuntete reacia de reducere a oxigenului la ap. Ca rezultat, viteza de oxigenare a catodului s-a dovedit a fi un parametru ce poate fi manipulat pentru optimizarea sistemului generator de curent.În cadrul acestui tip de celule combustibile, una sau mai multe reacii de electrod sunt catalizate de procese biologice. Cercetrile în acest domeniu sunt încurajate de urmtoarele dou considerente: existena imensei cantiti de materie vegetal disponibil în natur i posibilitatea elimi120

nrii deeurilor de natur organic în mediul ambiant prin transformarea lor în fertilizatori organici. Procesele biochimice pot genera energie prin degradarea cu randament ridicat a materiei organice la temperaturi moderate, în soluii neutre sau aproape neutre [12, 13]. Celulele de biocombustie folosesc biocatalizatori pentru conversia energiei chimice în energie electric [14 a-h]. Aa cum cele mai multe substraturi organice sufer o ardere cu eliberare de energie termic, oxidarea în prezena biocatalizatorilor a substanelor organice de ctre oxigen sau ali oxidani la interfeele a doi electrozi furnizeaz mijloace pentru conversia energiei chimice în energie electric. Materiale organice abundente cum ar fi metanolul, acizii organici sau glucoza pot fi folosite ca substraturi pentru procesele de oxidare i oxigenul molecular ori H2O2 se pot comporta ca substraturi, fiind reduse. Puterea disponibil a celulelor de combustie (Pcel) este:

Pcel = d ( Ecel I cel )

8.1

unde Ecel este tensiunea electromotoare a celulei i curentul acesteia, Icel dac este aplicat o sarcin electric. Tensiunea ideal a celulei este afectat de diferena dintre potenialele convenionale ale oxidanilor i compuilor combustibili (Eox - E.comb), pierderi ireversibile în tensiune ca rezultat al limitrilor cinetice ale proceselor transferului de electroni la nivelul electrozilor, rezistenei ohmice interne i gradienilor de concentraie, care duc la descreterea valorilor. Curentul celulei este controlat prin dimensiunile electrozilor, perme-abilitatea ionic i viteza de transfer prin membrana ce separ compartimentele anodului i catodului biocelulei. Celulele de biocombustie folosesc biocatalizatori, enzime i chiar organisme celulare întregi într-unul sau dou moduri. Fiecare (i) biocatalizator poate genera substrat combustibil pentru celul prin transformri biocatalitice sau procese metabolice, ori (ii) biocatalizatorii pot participa la transferul în lan al electronilor între substratul combustibil i suprafeele electrozilor. Îns cele mai multe enzime redox nu particip la transferul direct de electroni cu electrozii, i astfel o varietate de mediatori electronici sunt folosii pentru contactul electric dintre biocatalizator i electrozi [15]. Recent, au fost dezvoltate noi abordri cu privire la rolul suprafeelor electrozilor cu monostrat i multistrat constînd în enzime redox, electrocatalizatori i bioelectrocatalizatori care stimuleaz transformrile electrochimice la nivelul electrozilor [16].

8.4 Clasificare

Celulele de combustie se clasific în dou mari categorii [17]: · INDIRECTE ­ un anumit compus, folosit la alimentarea unor bacterii, este convertit într-un produs ce poate servi apoi drept combustibil în pila de combustie. Ca exemplu se pot meniona: producerea hidrogenului din hidrai de carbon, cu ajutorul bacteriei Clostridium cellobioparum, hidrogen din acid formic cu Escherichia Coli; amoniac din uree cu Bacillus Pasteurii, etanol din hidrai de carbon, cu Saccharomyces (drojdie). Alturi de producerea de biocombustibil, procesele biochimce pot fi adaptate i pentru generarea de 121

oxidant. Ca exemplu poate servi procesul de fotosintez din plante, în care oxigenul este produs din dioxid de carbon. · DIRECTE - au la baza acelai proces ca i pilele indirecte, cu deosebirea c microorganismul poate funciona în dou feluri. El poate servi ca generator continuu de enzime necesare procesului electrochimic, în care organismul însui nu beneficiaz de pe urma procesului i astfel dispare treptat. De aceea, o parte din microorganisme se alimenteaz pentru cultur, consumînd o parte din combustibil. Alternativ, microorganismele se pot cultiva pe electrod sau în imediata vecintate a acestuia, iar produii de metabolism sunt utilizai direct la producerea de energie electric. Acest tip de pile prezint o mare dificultate: condiiile favorabile pentru dezvoltarea microorgansmelor vii (soluii neutre sau aproape neutre i temperatur apropiat sau egal cu cea ambiant) sunt net defavorabile pentru producerea eficient a energiei electrice în pilele de combustie. Luînd drept criteriu de clasificare natura microorganismelor utilizate pentru funcionarea celulelor bioelectrochimice se disting: · CELULE ENZIMATICE de COMBUSTIE ­ se utilizeaz catalizatori biologici de tip enzimatici pentru oxidarea combustibilului la anod, respectiv pentru reducerea oxigenului la catod. · CELULE MICROBIENE de COMBUSTIE ­ sunt utilizate microorganisme precum bacterii pentru conversia combustibililor i acioneaz ca surs de producere a energiei. În cadrul acestui tip de celule se disting dou subclase: o CELULE MICROBIENE de COMBUSTIE cu mediator ­ a cror funcionare necesit adugarea unui mediator electronic artificial: acid 2,6antrachnon disulfonic, tionin, 2-hidroxi-1,4-naftochinona, albastru de metilen, Fe(III)EDTA, puncte cuantice solubile în ap[18a-g] o CELULE MICROBIENE de COMBUSTIE fr mediator ­ a cror funcionare nu necesit adugarea unui mediator electronic artificial, pentru c se utilizeaz bacterii care pot transporta direct electronii prin circuitul exterior [19,20] Recent s-a artat c bacteria metalreductoare din familia Geobacteraceae, poate transfera electroni direct ctre electrozi folosind enzime redox active electrochimic cum ar fi citocromii pe membrana lor extern [16-18]. Acestea sunt celule de biocombustie microbiene fr mediatori fiind considerate a avea un potenial mare de aplicaii comerciale decît celulele de biocombustie cu mediatori deoarece mediatorii folosii sunt scumpi i toxici pentru microorganisme [19].

8.5 Celule de biocombustie microbiene (MFC)

Folosirea unor microorganisme ca microreactoare în celulele de combustie elimin necesitatea de izolare a enzimelor individuale i permite biomaterialelor active s funcioneze în condiii apropiate de mediul lor natural, rezultînd de aici o înalt eficien. 122

Microorganismele sunt dificil de manipulat sau, în orice caz, au nevoie de condiii speciale pentru a fi active iar contactul lor electrochimic direct cu electrozii este virtual imposibil. În MFC fr mediatori exist posibilitatea de a funcionaliza anodul cu materiale biocompatibile cu microorganismele din compartimentul anodic. În acest caz microorganismele vor forma biofilme pe suprafaa anodului iar transferul de electroni se realizeaz prin interfaa membrana celular- suprafaa anodului. În figura 8.2 este prezentat o celul de biocombustie microbian pe care s-au realizat diferite studii i cercetri cu diferite microorganisme. Celula MFC (figura 8.2) const din dou compartimente un anod i un catod separate printr-o membran schimbtoare de protoni (PEM) din polimer perfluorosulfona (Nafion, DuPont). Electrozii sunt din hîrtie carbonic care pot fi funcionalizai cu diferite materiale biocompatibile. În compartimentul catodic se afl o soluie tampon de pH neutru.

Figura 8.2-Celul de biocombustie microbian, montaj experimental

În compartimentul anodic s-a preparat o soluie de glucoz de 200g/l în care s-a introdus diferite microorganisme. O sarcin de 1 Kohm a fost meninut pe tot parcursul experimentelor. În figura 8.3 este prezentat rspunsul a trei specii de microorganisme, E. Coli, Klebsiela i S. Aureus. Cele trei tipuri de microorganisme rspund diferit ceea ce face ca MFC s devin un biosenzor de identificare i analiz a comportrii acestora.[21, 22,23]. Au fost folosite bacteriile prezente în apa menajer în MFC. Aa cum s-a artat, bacteriile apei menajere se dovedesc a fi biocatalizatori potrivii pentru producerea de electricitate [24,25].

123

Apa menajer a avut un pH între 7,3 i 7,6 i un coninut chimic de oxigen (COD) de 200-300 mg/L. a fost deasemenea folosit un mediu de glucoz (170-1200 mg/L) cu urmtorul coninut (per litru): NH4Cl, 310 mg; KCl, 130 mg; NaH2PO4,H2O, 4,97 g; Na2HPO4,H2O, 2,75 g; mine-rale (12,5mL) i vitamine (12,5mL) [26]. Microorganismele au abilitatea de a produce substane active electrochimic, substane ce pot fi intermediari metabolici sau produi finali ai respiraiei anaerobe. În scopul generrii de energie, aceste substane combustibile pot fi produse într-un loc i transportate la celulele de biocombustie pentru a fi folosite drept combustibil. În acest caz, reactorul microbian biocatalitic produce biocombustibil iar partea biologic a aparatului nu are contact direct cu partea electrochimic. Aceast schem permite prii electrochimice s opereze în condiii care nu sunt compatibile cu partea biologic a aparatului. Aceste dou pri pot fi chiar separate în timp, funcionînd complet Figura 8.3-Rspunsul a trei tipuri de microorganisme în MFC (putere funcie de timp, individual. Cel mai folosit combustibil în min) aceast schem este hidrogenul gazos, ce permite buna dezvoltare i eficien marea celulelor de combustie H2/O2 în operarea alturi de bioreactoare. În Figura 8.4 se arat cum (A): Cu un bioreactor microbian separat de restul celulei se furnizeaz combustibilul în compartimentul anodic i cum (B). Cu un bioreactor microbian se furnizeaz combustibilul direct în compartimentul anodic al celulei combustibile. Potrivit unei alte abordri, procesul de fermentare micro-biologic continu direct în compartimentul anodic al unei celule de combustie, alimentînd anodul cu produse de fermentaie generate in situ. În acest caz, condiiile de operare din compartimentul anodic sunt dictate de sistemul biologic, aa c exist o diferen semnificativ între acestea i celulele de combustie convenionale. Exist o diferen între o adevrat celul de biocombustie i o simpl combinaie a unui bioreactor cu o celul de combustibie convenional. Aceast ultima configuraie se bazeaz de asemenea în mod frecvent pe producerea biologic a hidrogenului, dar oxidarea electrochimic a H2 se face în prezena compuilor biologici în condiii blînde. În acest tip de sistem sunt deasemenea folosite i alte produse metabolice (alcooli, H2S).

124

Celule bioelectrochimice pe baz de electrozi enzimatici O metodologie în plus pentru dezvoltarea celulelor bioelectrochimice implic aplicarea enzimelor redox pentru oxidarea i reducerea substraturilor specifice de combus-tibili i oxidani la electrozi i generarea de energie electric. În consecin este esenial proiectarea de electrozi enzimatici integrai care cresc contactul electric. Caracterizarea detaliat a vitezelor de transfer electronic la interfa- Figura 8.4 Reprezentarea schematica a unei microbiocelule combustibile , vitezele biocatalitice i rezisten- A-furnizare indirect B-furnizare de biohidrogen ele electrice interne este esenial pentru construcia de celule de biocombustie. Modificarea chimic a enzimelor redox cu uniti sintetice care îmbuntesc contactele electrice cu electrozii furnizeaz mijloace generale pentru sporirea energiei electrice a celulelor de biocombustie. Modificarea sitului specific al enzimelor redox i funcionalizarea electrozilor reprezint mijloace noi i atractive. Conectarea electric efectiv a proteinelor cu electrozii sugereaz c eforturile viitoare pot fi direcionate ctre dezvoltarea mutanilor structurali a proteinelor redox. Nanoingineria suprafeelor electrozilor cu uniti biocatalizatoare co-factori de transfer ale sintezelor organice permite controlul transferului electronic în cascade. Prin reglarea potenialelor redox duce la sporirea generrilor de putere ale celulelor de biocombustie. Configuraiile celulelor de biocombustie discutate mai sus pot fi extinse teoretic i altor enzime redox i substraturi combustibile, permiînd numeroase aplicaii tehnologice. Un potenial important al celulelor de biocombustie este folosirea lor în ansambluri i locaii din fluidele corpului uman, de exemplu sîngele. Puterea electric obinut poate fi folosit în alimentarea cu energie electric a aparatelor implantate ca stimulatoarele cardiace, pompele, senzorii i protezele.

8.6 Elemente de electrochimia MFC

Similar ca orice celul galvanic în care au loc reacii chimice de generare de energie util respectiv cldur i MFC se supune acelorai legi ale termodinamicii îns mecanismele sunt diferite. Pentru simplificare ne vom limita la o analiz termodinamic a celulei luînd în considerare reaciile reversibile. Puterea electric a celulei (8.1) are dou componente corespunztor celor dou regimuri de funcionare. Primul regim se refer la generarea de electricitate prin acumulare 125

de sarcin pîn se atinge o tensiune maxim Ecel. Se presupune c aceasta este constant pentru al doilea regim de lucru prin conectarea ei la un consumator rezisitiv. Dac curentul este constant atunci 8.1 devine Pcel= EcelI. Tensiunea electromotoare produs de sistemul electrochimic poate fi evaluat termodinamic din bilanul energiei libere Gibbs aplicat asupra reaciilor chimice din sistem [17]: Gr = Gr0 + RT ln 8.2 0 unde Gr este energia liber Gibbs, Gr - energia liber Gibbs a produilor i reactanilor în condiii standard, R- constanta universal a gazelor, T- temperatura iar este raportul dintre produsul activitilor chimice ale produilor de reacie respectiv a reactanilor. Lucrul mecanic maxim efectuat de sistem este: Wmax = -Gr = Etem × Q = Etem × ( znF ) 8.3 unde Etem este tensiunea electromotoare a celulei, Q- sarcina electric, z- numrul de electroni transportai per mol, n-numrul de moil, F-constanta Faraday. Rearanjînd relaia 8.3 se obine,

Etem = -

Gr Gr0 0 ; Etem = - znF znF

8.4

ce reprezint tensiunile electromotoare generate în condiii de lucru respectiv în condiii standard. Înlocuind 8.4 în 8.2 rezult ecuaia general pentru tensiunea electromotoare generat de o celul electrochimic pentru un cuplu de reacii date:

0 Etem = Etem -

RT ln znF

8.5

În condiii specifice tensiunea electromotoare este dat de diferenele de tensiuni electromotoare a reaciilor ce au loc la catod, EC, respectiv la anod, EA adic: Etem = EC - E A 8.6 În MFC, teoretic, randamentul poate fi evaluat ca lucrul mecanic consumat pentru a transporta znF sarcini în circuitul exterior la diferena de potenial msurat (Ecel= Vmsurat) raportat la lucrul mecanic maxim efectuat de celul datorat reaciilor de la catod i anod (Etem znF):

MFC =

Wmasurat Vmasurat znF Vmasurat = = Wmax Etem znF Etem

8.7

În realitate datorit rezistenelor interne, Re, (de volum respectiv de interfa) a celulei potenialul generat va fi:

Ecel = EC - E A - IRe

8.8

126

În experimente, msurarea potenialelor de electrod pentru determinarea potenialelor la anod, EA, i catod, EC, se raporteaz la un electrod de referin situat în vecintatea acestora. În consecin valorile experimentale nu coincid cu Etem respectiv cu Etem0 din relaia 8.5. În practic pentru o celul ideal cu un cuplu de reacii reversibile se consider o tensiune electromotoare msurat Ee i o tensiune electromotoare standard de echilibru Ee0 iar expresia 8.5 se modific corespunztor. Considerînd o concentraie de oxidani, cO respectiv de produi redui, cR atunci relaia 8.5 ia forma:

Ee = Ee0 +

RT c ln o znF cR

8.9

care pentru echilibru ar valorile msurate în circuit deschis trebuie s fie apropiate de Ee. Excesul de energie liber în sistem indus de suplimentarea de oxidani i de combustibil raportat la valorile de echilibru va conduce la un suprapotenial Ecel mai mare de Ee. Pentru a maximiza performanele celulei i a obine o tensiune optim este necesar a maximiza (EC-EA) i de a reduce valorile rezistenelor interne. Densitatea de putere a celulei de combustie se raporteaz la aria electrozilor sau la aria echivalent de catalizatori.

127

8.7 Referine

1 Keith Scott , Ioan Stamatin, JOAM, 9, 6, 1597 - 1605, (2007) 2 R.M. Allen, H.P. Bennetto, Applied Biochemistry and Biotechnology, 39/40, pp. 2740, (1993). 3 D. Park, J. Zeikus, Applied and Environmental Microbiology 66,4, 1292-1297, (2000). 4 S.D. Roller, H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Madison, J.L. Stirling, C.F. Thurston, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 34B, pp. 3-12, (1984). 5 D.R. Bond, D.E. Holmes, L.M. Tender, D.R. Lovley, Science 295, 483-485, (2002). 6 D. Park, J. Zeikus, Biotechnology and Bioengineering, 81, 3, 348- 355,(2003). 7 K. Rabaey, et all, Biotechnology Letters, 25,1531-1535, (2003) 8 D.R. Bond, D.R. Lovley, Appl. and Environmental Microbiology 69,1548-1555, (2003). 9 M. Chiao, K.B. Lam, L. Lin, "Micromachined Microbial Fuel Cells," IEEE The Sixteenth Annual International Conference, pp. 383-386, (2003) 10 D. Park, S. Kim, I. Shin, Y Jeong, Biotechnology Letters. 22, 1301-1304, (2000). 11 U. Schroeder, J. Niessen, F. Scholz, "A Generation of Microbial Fuel Cells with Current Outputs Boosted by More than One Order of Magnitude." Angewandte Chemie International Edition, vol. 42, pp. 2880-2883, (2003). 12 N. Mano, F. Mao, W. Shin, T. Chen and A. Heller, `A miniature biofuel cell operating at 0.78 V', Chem. Commun., 518-519 (2003). 13 M. Chiao, K.B. Lam and L. Lin, `Micromachined microbial fuel cells', 16th IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference, Kyoto, Japan, January 19 ­ 23, 2003 14 a.C. Van Dijik, C. LaaneiC. Veeger, Recl. Trav. Chim.Pays-Bas., 104, 245 (1985). b. W. J. AstoniA. P. F. Turner, Biotechnol. Gen. Eng. Rev.,1, 89 (1984). c. L. B. Wingard Jr, C. H. ShawiJ. F. Castner, Enzyme Microb. Technol., 4, 137 (1982). d. A. P. F. Turner, W. J. Aston, I. J. Higgins, G. Davis andH. A. O. Hill, `Applied Aspects of Bioelectrochemistry: FuelCells, Sensors, and Bioorganic Synthesis', Presented at the Fourth Symposium on Biotechnology în Energy Productionand Conservation, C. D. Scott (Ed), Interscience, New York,12, 401 (1982). e. G. T. R. Palmore i G. M. Whitesides, `Microbial andEnzymatic Celule de biocombustie', în "Enzymatic Conversion ofBiomass for Fuels Production", M. E. Himmel, J. O. Bakerand R. P. Overend (Eds), ACS Symposium Series No. 566,American Chemical Society, Washington, DC, pp. 271­290(1994). f. A. T. Yahiro, S. M. LeeiD. O. Kimble, Biochim. Biophys.Acta, 88, 375 (1964). g. F. D. Sisler, `Biochemical Fuel Cells', în "Progress în IndustrialMicrobiology", D. J. D. Hockenhull (Ed), J. & A. Churchill,London, Vol. 9, pp. 1­11 (1971). h.S. Wilkinson, Autonomous Robots, 9, 99 (2000). 15. P. N. Bartlett, P. TebbuttiR. C. Whitaker, Prog. ReactionKinetics, 16, 55 (1991). 128

16 I. WillneriE. Katz, Angew. Chem. Int. Ed., 39, 1180 (2000). 17 Liviu Oniciu, Pile de combustie, Ed. Stiintifica, Bucuresti, pp.127, (1971) 18 a.Siebel, D.; Bennetto, H. P.; Delaney, G. M.; Mason, J. R.; Stirling, J. L.; Thurston, C. F. Electron-transfer coupling in microbial fuel cells: (1) Comparison of redoxmediator reduction rates and respiratory rates of bacteria, J. Chem. Technol. Biotechnol., , 34B, 3-12 (1984) b.Delaney, G. M.; Bennetto, H. P.; Mason, J. R.; Roller, S. D.; Stirling, J. L.; Thurston, C. F. Electron-transfer coupling in microbial fuel cells. II. Performance of fuel cells containing selected microorganism-mediator combinations, J. Chem. Technol Biotechnol.,34B, 13-27 (1984) c. Lithgow, A. M.; Romero, L.; Sanchez, I. C.; Souto, F. A.; Vega, C. A. Interception of electron-transport chain in bacteria with hydrophilic redox mediators, J. Chem. Res.,5, 178-179. (1986) d. Emde, R.,Swain, A.; Schink, B., Anaerobic oxidation of glycerol by Escherichia coli in an amperometric poised-potential culture system, Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 170-175 (1989). e. Park, D. H.; Zeikus, J. G. Electricity generation in microbial fuel cells using neutral red as an electronophore, Appl. Environ. Microbial.,66(4), 12921297 (2000) f.Ioan Stamatin, Adina Morozan, Luminita Stamatin, Anca Dumitru, Prospective Investigations of Biofuel Cells as Source for Applications in Nanobiotechnology, NATO Science Series Volume: Nanostructured and Advanced Materials for Applications in Sensor, Optoelectronic and Photovoltaic Technology, Ed. A. Vaseashta, D. Dimova-Malinovska and J. M. Marshall, (2005). g. Kim, B. H.; Park, D. H.; Shin, P. K.; Chang, I. S.; Kim, H. J. Mediatorless biofuel cell, U.S. Patent 5976719, 1999. 19 Chaudhuri, S. K.; Lovley, D. R., Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells, Nat.Biotechnol 21, 1229-1232. (2003) 20 Liu, H.; Ramnarayanan, R.; Logan, B. E., Production of electricity during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell, Environ. Sci. Technol., , 38, 2281-2285, (2003) 21 Luminita Stamatin, I. Stamatin, Nanobiocomposites based on nanocarbon for cell culture media, in Nanoengineered Nanofibrous Materials, Ed. Y. Gogotsi, S. Kacac, Kluwer, pp289-298 (2004) 22 A. Morozan, I. Stamatin, L. Stamatin, A. Dumitru, K. Scott, Carbon Electrodes for microbial fuel cells, JOAM, 9,1, 221-224, (2007) 23 Adina Morozan, L. Stamatin, F. Nastase, A. Dumitru, S. Vulpe, C. Nastase, Ioan Stamatin, Keith Scott The biocompatibility microorganisms-carbon nanostructures for applications in microbial fuel cells , Phys. Stat. Sol. a 204, 6, 1797­1803 (2007) 129

24 Liu, H.; Ramnarayanan, R.; Logan, B. E. Production of electricity during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell. Environ. Sci. Technol., 38, 2281-2285. (2003) 25 Park, D. H.; Zeikus J. G. Improved fuel cell and electrode designs for producing electricity from microbial degradation. Biotechnol. Bioeng., 81(3), 348-355 (2003) 26 Lovley, D. R.; Phillips, E. J. P. Novel mode of microbial energy metabolism: Organism carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron and manganese. Appl. Environ. Microbiol., 54(6), 1472-1480 (1988)

130

9. Nanoparticule în medicin

Am putea spune c acest domeniu s-a nscut o dat cu experimentele lui Albert Einstein, care într-un capitol al lucrrii sale de doctorat, a calculat mrimea unei singure molecule de zahr într- un experiment de difuzie a zahrului în ap. Experimentul su a artat c fiecare molecul msoar aproximativ un nanometru în diametru. Domeniul este relativ nou i a evoluat o dat cu creterea necesitii de a gsi noi materiale cu biocompatibilitate cît mai mare pentru reducerea intoleranei organismelor vii. Începînd cu protezele i aliajele dentare, componente artificiale pentru înlocuirea de pri ale organelor sau chiar integral ( rinichi, ficat, piele, componente ale inimii, esofag, plmîni,ochi etc) au fost dezvoltate noi materiale cu proprieti din cele mai sofisticate. Aria sintezei nanomaterialelor a permis o nou abordare. Binecunoscute din tiina coloizilor nanomaterialele au surmontat principalul inconvenient- pot fi stabile fr a fi necesar stabilizri în diferite micelii. Nanomaterialele nu sunt altceva dect tot ce cunoatem ca materiale la scal macroscopic dar reduse la nivel nanometric ele prezint ori noi proprieti ori cele clasice sunt amplificate. Nanomaterialele nu sunt produse prin tehnicile ,,up-down" adic formarea lor prin reducere dimensional ci invers"bottom-up" împrumutînd mult din tehnicile chimiei supramoleculare, coloizilor, sol-gel, inginerie genetic, biologie/ biochimie molecular. Peste acestea s-au suprapus noile metode de manipularea i sinteza cu microscopia de fore atomice, metode de autoasamblare (SAM), manipularea cu fascicule laser (tweezer), inscripionarea direct prin ink-jet etc. Dimensiunile lor fiind sub sau comparabile cu cele ale virusurilor (figura 9.1); activitatea lor este adeseori amplificat datorit mesostructurii i forelor superficiale total diferite de ce se întîmpl la dimensiuni normale. Interesul în poteniale aplicaii biomedicale ale nanomaterialelor i ale materialelor nanostructurate, provine din percepia c ele sunt capabile s interacioneze cu biomolecule individuale, celule i prile lor individuale i alte structuri biologice. Pe o scal a mririlor pentru inspecia microscopic (figura 9.1) se observ c domeniul dimensional al nanoparticulelor acoper o vast arie dimensional în scala nanometrilor compatibil cu microorganismele i virusurile.Vor fi abordate cîteva din aspectele impactului nanoparticulelor în medicin unele din ele fiind elaborate i dezvoltate în aceast lucrare. 1. Nanofibrile, Nanoparticule de carbon ­ existente în mediul înconjurtor, datorit emanaiilor de gaze incomplet arse- pot fi inhalate i ajung localizate în diferite organe dar cel mai adesea în circuitul sanguin unde cu glucoza, hemul i ali mediatori împreun cu microorganisme patogene pot forma adevrate celule miniaturizate bioelectrochimice ce pot produce electricitate iar ca produi pot varia de la cei inofensivi ( ex CO2) la gaze combustibile, uneori accelereaz formarea toxinelor.Astzi exist largi studii de a crea miniroboi ce folosesc substanele din circuitul metabolic ce produc electricitate i energia necesar pentru a transporta medicamentele la o int pre131

cizat. Ansamblul gastrobot medicament învelit în filme inteligente cu recunoatere molecular a celulelor bolnave- unitate de transport format din cili biomimetic- este intens studiat ca domeniu specific de ,,drug delivey"transport inteligent de medicamente. Structura i activitatea specific a nanoparticulelor de carbon rezultate din sinteza prin piroliz laser , a artat c în anumite situaii pot accelera transportul de oxigen spre microorganismele aerobe jucînd rol de ,,pompe de oxigen"

Figura 9.1 ­ Comapraie dintr dimensiunile microorganismel i nanoparticule pe o scal a mririlor acoperind microscopia optic i de fore atomice

2. Nanocompozite/nanobiocompozite- ca definiie acceptat orice compozit care conine cel puin un material nanometric într-o matrice dat se numete nanocompozit. Dac matricea conine materiale biologice sau biocompatibile ele capt denumirea generic de nanobiocompozite. Nu vom intra în detalii asupra diferitelor metode de formare a nanocompozitelor. De reinut c orice tip de matrice de la gel pîn la polimeri sau alte solide care conin materiale nanometrice dispersate, funcionalizate, legate chimic, etc formeaz clasa nanocompozitelor ( dispersiile lichide, coloizii sunt clase distincte). În aceast lucrare s-a studiat dezvoltara de medii de cultur ce pot induce creterea accelerat a unor tipuri de microorganisme reducîndu-se astfel timpii de incubare la jumtate în scopul unui diagnostic mai rapid. Ulterior s-a constatat c o combinaie de creteri pemedii de cultur pe baz de nanocarboni i transferul acestora într-o celul de biocombustie cu electrozi pe baz de nanotuburi de carbon se pot identifica tipule de microorganisme datorit specificitii lor în mecanismele de transfer de electroni. 132

3. Puncte cuantice(Q-dots)-Nanocristale ce au proprietatea de luminofori sau de colorani luminisceni sub aciunea radiaiei de la albastru spre ultraviolet. Diferenele sunt majore fa de luminoforii i coloranii clasici biotinilai sau nu. Q-doturile au o emisie specific pe o anumitlungime de und cu persisten îndelungat. Biotinilate devin biocompatibile, se pot ataa pe diferite structuri biologice avînd capacitatea de indexare i identificare respectiv secveniere. Lucrarea abordeaz un singur aspect ­ utilizarea lor în investigarea unor tipuri de preparate biologice intind spre analiza elementelor componente ale sîngelui i a naturii paraziilor. De notat c aceast metod este pentru prima dat introdus la nivel naional. În continuare vor fi prezentate aspecte specifice pentru cele dou clase de nanoparticule i acolo unde este posibil comentarii încercînd surprinderea aspectelor comune din biologia microrganismelor cu proprietile nanoparticulelor

9.1 Nanofbrile, Nanocarboni, rolul lor în microbiologia clinic Nanofibrile

De curînd nanofibrilele (NF) au fost menionate ca o conexiune între lumea nanometric i macrometric, pentru c în teorie, avînd diametru unei fraciuni de micron, nanofibrila poate fi infinit de lung. Ele sunt considerate ca o conexiune de la nanobiecte spre macroobiecte.[1]. Producerea nanofibrelor prin electrospining (etirare în cîmp electric a unei soluii lichide de material prin canale capilare) sau centrifugare capilar, este de mare actualitate, i o varietate de nanofibrile continui sau poroase au fost realizate cu aceast metod. Ele includ: polilactide, (PL) poliglicolide (PG), polietilentereftalai, poliacrilonitril, polivinilcarbazol, policarbonat, polistiren, polimetil-metacrilat, polivinilpirolidon, polimetacrilat, polioximetilene [2]. Co-electrospining de soluii coloidale cum ar fi hidroxiapatita într-o soluie polimer a condus la nanofibrile ce pot încorpora nanoparticule. Un alt exemplu cu un impact considerabil pentru medicina reparatorie de esutuei este obinerea de nanofibrile de polioxietilene cu nanotuburi i de aici nanocompozite fibrilare cu o reziten mecanic foarte mare [3]. Similar, dac se înglobeaz în soluii de polimeri biodegradabili diferite medicamente atunci nanofibrilele pot deschide arii largi de aplicaii pentru industria medicamentelor [4]. Nanofibrile cu polimeri biodegradabili cum sunt polilactidele poliglicolidele sunt de interes pentru ingineria esuturilor de susinere deoarece ei se dizolv complet dup implantare, nu se comport ca materiale strine în corp [5]. Utilizînd tehnici de electrospining au fost obinute fibre de colagen de 100 nm în diametru i care au aceleai configuraii cu ale nanofibrilelor de colagen natural. Au fost obinute, prin aceast tehnic din soluii de colagen cu nanotuburi, nanofibre care au abilitatea de a facilita creterea celulelor i formarea esuturilor de susinere [6]. Aplicaiile nanofibrilelor în lumea medical sunt multiple: pentru filtrarea mediilor biologice, pentru a transforma sau anihila substanele patogene sau microorganismele. De exemplu filtrele din nanofibrile au suprafee specifice de ordinul sute de metri patrai per 133

gram care în comparaie cu microfibrilele cu zeci de metri patrai. Filtrele din nanofibrile sunt foarte utile în procesul de purificare a apelor, procese de dializ dar i în prevenirea i combatere a bioterorismului. Recent a fost raportat obinerea unor filtre ce sunt capabile s rein metalele grele, viruii i bacteriile din ap i s separe proteinele.Aceste filtre au fost fabricate din nanofibrile de alumin (Al2O3) de Aragonide Sanfort [7]. Alumina nanofibrilar atinge dimensiuni impresionabile de 2 nm în diametru i o suprafa de contact de 500-650 m2/gram. Un exemplu interesant despre cum se asambleaz peptidele pe nanofibrile a fost descris recent în [8]. Autorii studiaz sinteza moleculelor de peptide ­molecule amfifile care se autoasambleaz reversibil cu nanofibrile rezultînd un gel apos. Aceste structuri sunt în continuare polimerizate pentru a îmbunti stabilitatea lor. Nanofibrilele sunt utilizate ca abloane pentru producerea de nanotuburi prin acoperirea acestora cu un alt material care dup procesare se poate elimina miezul format din polimer Nanomaterialele i nanfibrilele nu sînt invenia genial a unui creier uman, ele sunt larg rspîndite în natur. Diferite materiale naturale cum ar fi: lemnul, mtasea, prul, conexiunile celulare, oasele, pielea i celulele vaselor de sînge, toate aceste formaiuni sunt produse prin repetarea regulat a aranjamentului nanofibrilelor alctuite din proteine i polizaharide. Moleculele de ADN, sunt un exemplu de nanofibrile de 2 nm în diametru i de 100 nm lungime. Un exemplu interesant de material nanostructurat utilizat sau produs în natur, este cel al culorii albastre a penajului la psri. Aceast culoare nu este dat de un pigment albastru al penajului ci de un sofisticat aranjanjament nanostructurat. Culoarea albastr a penajului la psri este dat de lumina ce este împrtiat coerent pe aranjamentul de fibrile de keratin i bulele de aer ce alctuiesc fulgul penei.[9, 10].Un alt exemplu interesant ce conine nanofibrile naturale este cel al polimerizarii fibrinogenului i formrii cheagului de sînge. Este un exemplu magistral de aranjament nanostructurat de macromolecule i este rezultatul stadiului final al coagularii în cascad. Ansamblu coagulrii const dintr-o succesiune de etape distincte care influeneaz rata asamblrii fibrelor de fibrin i aranjamentul final al fibrilelor în procesul coagulrii. Primul pas în procesul de clivare proteolitic a proteinei plasmatice fibrinogen (factorul 1. în sistemul coagulrii celulare ), este îndeplinit de enzima numit trombin.Trombina cliveaz peptidele moleculare, mici, cunoscute cu denumirea de fibrinopeptide A i fibrinopeptide B ale moleculei de fibrinogen. Oligomerele cresc i dau protofibrile, care la rîndul lor formeaz fibrilele finale în procesul de coagulare. Dup atingerea unei mase critice protofibrilele formeaz fibrile i în final o reea sub form de cheag.[11,12]. In vivo, fibrina monomeric în mod spontan formeaz un polimer solid care se leag covalent de celulele sîngelui printr-o enzim plasmatic transglutaminaza i se transform într-un polimer insolubil. In vitro, polimerul de fibrin trebuie s polimerizeze reversibil i apoi s repolimerizeze în structura mai sus amintit. Este posibil s se formeze o fibrin lucrtoare, cu un larg spectru, cu fibrile de grosimi diferite, realizînd în final un polimer de porozitate diferit, cu pori distribuii diferit. 134

Numeroi factori contribuie la determinarea final a diametrului fibrilelor i la funcionarea sistemului[13,14]: tria ionic, pH, raportul fibrinogen / trombin, prezena altor proteine plasmatice. Autoasamblarea fibrinei apare în special via legturile necovalente A- i B- dintre siturile localizate de polimerizare din domeniile E centrale i domeniile D periferice ale fibrinei. Natura fizico- chimic a legturilor covalente depinde de interaciunile electrostatice i legtura de hidrogen ce însoete resturile de aminoacizi în cursul procesului de asamblare a fibrilelor de fibrin. Este semnificativ observaia c efectul triei ionicei ce însoete procesul de polimerizare, influenaz rata de polimerizare. Deasemeni interaciile hidrofobe particip la polimerizarea fibrinei. Studiul asupra nanostucturilor de fibrin este de mare interes pentru lumea academic i medical, atît în ceea ce privete noua viziune asupra conceptului de boal a coagulrii cît i în ceea ce privete noile perspective ce se deschid, fibrina are un potenial important în industria medicamentelor i în cea a esuturilor de susinere.

Nanofibrile carbonice

ACF- fibrele de carbon activate, sunt materiale fibroase nanostructurate, ce au mare potenial în medicina aplicat. Diametru acestor fibrile este de ordinul micrometrilor, au mari suprafee interne i sunt clasificate în funcie de dimensiunea porilor în trei categorii: · micro, au porii mai mici de 2nm, · mezo, au porii între 2-50 nm, · macro, cu porii mai mari de 50nm. Aceast clasificare se bazeaz pe diferena în mecanismul de adsorbie a gazelor, clasificare realizat la recomandrile IUPAC. Toate cele trei tipurile de pori contribuie la nanostructurarea ACF. GAC- fibre de carbon gaz adsorbante, sunt utilizate cu succes în purificarea sîngelui extracorporal, hemoperfuzii. Rezultate preliminarii comparative între cele dou nanostructuri, ACF i GAC au condus la idea c au un potenial deosebit în aplicaiile medicale. Aplicaii medicale ale ACF i GAC Bactericid puternic, dovedit prin impregnarea fibrilelor de carbon activ cu cupru i amestecarea lor cu un mediu nutritiv pentru culturi de: Pseudomonas mirabilis, E. coli, Stafiloccocus aureus sau Pseudomonas aeruginosa. În toate cazurile din aceste culturi nu s-a observat dezvoltarea coloniilor de microorganisme. Importante rezultate pozitive i încurajatoare sunt în tratarea tumorilor, prin reducerea dimensiunilor acestora sau dispariia lor. Experimentele s-au efectuat pe animale de laborator dar i pe voluntari umani. Imobilizarea endotoxinei bacteriene de la Stafilococul auriu, cu ACF (SAC-ACF) sau de la E.coli (BET-ACF), se poat folosi pentru experimente de tratare a cancerului la animalele de laborator. În aceste cazuri durata de supravetuire a fost mrita de la 52 zile la 76 zile, prin hemoperfuzii. Rezultatele sumarizate din literaturt arat marile posibiliti ce se ofer aplicaiilor medicale prin folosirea nanomaterialelor cum ar fi nanofibrin i ACF sau GAC. 135

În cazul fibrelor naturale de fibrin, proprietile lor pot fi semnificativ înbuntite sau modificate în sensul dorit. În cazul ACF sau GAC, un simplu calcul estimeaz c suprafaa nanoporozitii nano-fibrilelor este de 200-2000 metri ptrati per gram. O suprafaa specific mare, ca aceea din ACF dar care nu necesit o etap de activare va reduce semnificativ rezistena mecanic a materialelor carbonice, aceasta este un mare avantaj. Suprafaa extern care nu are limitri în difuzia intraporoas ar putea reduce rata de adsorbie prin carbonul poros. În ciuda faptului c nanofibrilele de carbon nu sunt produse pe scar larg, recente descoperiri în domeniu au fcut posibil descoperirea de nanofibrile din polimeri, care au condus la producerea unor fibrile de carbon prin piroliz ce va deschide în viitor oportuniti pentru aplicaii medicale a acestor materiale.[15]

9.2 Nanocarboni

Particule carbonice de dimensiuni (sub)micronice sunt rspîndite prin intermediul curenilor de aer pe toata suprafaa Terrei dar sunt cu precdere concentrate în marile aglomerri urbane, fiind un factor important în fenomenul polurii. Ele au o provenien foarte divers, de la emisiile motoarelor (îndeosebi cele Diesel), termocentralelor i pîn la incendii. Aciunea lor asupra sntii oamenilor este atît direct, prin afectarea sntii oamenilor, în spe a sistemului respirator i a altor sisteme [16, 17], dar poate fi i indirect, prin creterea incidenei diferitelor infecii bacteriene ca urmare a interaciei acestor microorganisme patogene cu particule aflate în suspensie. Microorganismele coexist cu oamenii de foarte mult timp i unele au dezvoltat relaii simbiotice cu acesta, pe cînd altele atac organismul uman, putînd fi foarte virulente. Poarta de intrare a acestora din urm poate fi atît pielea, cît i sistemul respirator sau cel digestiv. Bacteriile simbionte sunt importante prin faptul c produc o serie de vitamine din grupa B cît i prin faptul c împiedic dezvoltarea celor patogene. În cadrul procesului de studiere a interaciilor de tip organism unicelular ­ particule de dimensiuni submicronice, un factor fundamental îl constituie cunoaterea proprietilor de suprafa ale celor dou sisteme ce interacioneaz: · Pe de o parte a înveliului microorganismelor, care este constituit în cazul bacteriilor de complexul membran­perete bacterian; · Pe de alt parte, suprafaa nanoparticulelor, în particular cele carbonice. Membrana bacterian (ca i membranele tuturor celulelor vii) este alcatuit în principal dintr-un dublu strat lipidic, cu proprieti de cristal lichid, adic moleculele lipidice sunt ordonate, dar sistemul are o anumita fluiditate. Ea nu este doar o simpl barier fizic dintre citoplasm i mediul extern, avînd i o serie de funcii ce depind în mod critic de proteinele ce se gsesc încorporate în stratul lipidic. Cîteva din aceste funcii sunt: · Asigurarea legturilor structurale dintre citoscheleton ( reeaua de proteine fibrilare din citoplasma celulei) i matricea extracelular; · Transportul selectiv al unor molecule i ioni specifici în interiorul i în afara celulei; · Cataliza a multor reacii chimice, de cele mai multe ori existînd un sistem de enzime, fiecare catalizînd o secven dintr-un lan de reacii metabolice. 136

Peretele bacterian are o compoziie i structur complex. Exist dou tipuri principale de structuri ale acestuia care determin clasificarea bacteriilor în dou clase: Gram pozitiv i Gram negativ. Aceast denumire provine de la metoda Gram de identificare a bacteriilor ce folosete violetul de genian (un colorant bazic trifenil-metanic) i o soluie apoas de iod i iodur de potasiu. Dup splare cu alcool, bacteria fie va reine coloraia puternic violet a violetului de genian, fie va fi complet decolorat. Uneori se aplic i o colorare suplimentar cu fucsin sau eozin pentru a da bacterilor decolorate o culoare roiatic i a le face mai vizibile. Bacteriile ce rein culoarea violet sunt cele Gram pozitiv, iar în caz contrar sunt Gram negativ [18]. Toate bacteriile, cu excepia micoplasmelor, posed un perete bacterian iar principala component a acestuia este mureina, un peptidoglican, care contribuie la rigiditatea mecanic a acestuia. Toate bacteriile Gram negativ conin un strat adiional în structura peretelui celular, o membran extern, care este localizat deasupra stratului peptidoglicanic, astfel c la o seciune prin înveliul bacteriilor de acest tip vazut la microscopul electronic apare o structur trilaminar [19]. O alt deosebire dintre cele dou grupuri const în grosimea stratului peptidoglicanic, care este mult mai mare la cele Gram pozitiv.

Figura 9.2-Fragment de peptidoglican

Figura 9.3 ­Legarea catenelor i reticularea în peptidoglican (encarta-2005)

Peptidoglicanul este un polimer insolubil, tridimensional, compus din catene în care se gsesc alternativ resturi de N-acetilglucozamina i acid N-acetilmuramic ( figura. 9.2). Legtura dintre catene se face între resturile de acid N-acetil muramic prin intermediul a cîte dou lanuri scurte polipeptidice. A doua polipeptid (de obicei pentaglicina) se leag în punte (poziiile 2 i 4) între douî peptide paralele, identice, legate fiecare la rîndul lor de cîte un rest de acid N-acetil muramic din doua catene adiacente ( figura 9.3). Rigiditatea acestui ansamblu este dat atît de legturile covalente, cît i de cele de hidrogen dintre resturile de aminoacizi C=O.....H-N. Tot legturi de hidrogen pot forma i 137

grupele hidroxil prezente sub forma de ­CH2OH din catenele principale. De asemenea, datorit spaiilor relativ mari dintre catene, polimerul peptidoglicanic este îmbibat cu molecule de ap, care sunt i ele reinute prin legturi de hidrogen, ceea ce d natere unei faze de gel în care sunt dispersate o varietate de alte molecule mici. Polimerul peptidoglicanic nu este lipit direct de membrana intern lipidic, între acestea existînd un spaiu în care se afl apa, numit periplasma. Unii autori consider c la bacteriile Gram negative i peptidoglicanul este o component a acestei periplasme. O alt caracteristic a bacteriilor Gram negative o constitiue prezena în membrana extern a unor lipopolizaharide precun i a unor pori, cu deschidere de circa 1-2 nm, indui de proteine specifice, numite porine. Cele Gram pozitive prezint la exterior polizaharide specifice ancorate în perete, precum i polimeri filiformi de tip acid teichoic (ancorat tot în perete) si lipoteichoic (ancorat in membrana de baza), acizi cu compozitie complexa de tip poliesteri fosforici ai glicerinei cu resturi de alanina, zaharuri cu/far lipide. De asemenea, bacteriile posed pentru locomoie mai muli flageli care încastrai în peretele celular ce asigura deplasarea acestora spre sursele de nutrieni i oxigen. Alte structuri filiforme prezente pe peretele bacterian sunt pilii. Ei sunt formai din proteine tubulare cu rolul de a ajuta bacteria s adere la celula gazda , folosind de asemenea la transferul informatiei genetice de la o celula bacterian la alta prin mecanismul de conjugare, Multe bacterii prezint pe exteriorul peretelui bacterian un strat mucoid, foarte puternic imbibat cu ap, numit capsul, ce are o grosime apreciabil. El are în compoziie, spre exemplu la bacilul de antrax, un polimer al acidului glutamic, iar la alte bacterii conine polizaharide. Rolul su pare a fi de protecie a bacteriei împotriva mecanismelor de aprare a gazdelor infectate. În afara de proteinele din membrana de baz, se mai gsesc, lipoproteine, i multe alte tipuri de proteine cu diverse roluri ( de transport, catalitice, "antene" pentru diverse semnale, de adeziune etc) [20]. Un alt fapt ce trebuie menionat esta c o mare parte din antibiotice acioneaz prin blocarea biosintezei peretelui bacterian, în spe deregleaz sinteza peptidoglicanului. În absena unui perete funcional, materialul bacterian din interiorul celulei este expulzat afar i bacteria moare [4]. Tabloul zugrvit succinct relev marea complexitate i varietate, dar i importana înveliului bacterian. Proprietile acestuia îl fac apt s interacioneze în multiple moduri cu suprafaa nanoparticulelor în particular cele carbonice, determinînd o schimbare profund a comportamentului bacteriilor.

Tipuri de nanocarboni

Interacia dintre microorganisme i materialele carbonice a fost studiat din mai multe puncte de vedere, în special din cel al depolurii apelor folosind carbon activ, care se tie c are o suprafa specific foarte mare, comparabil cu cea a nanoparticulelor carbonice. Spre exemplu, bacteria Escherichia coli s-a dovedit a crete adsorbtia srurilor de Pb(II) i de Cd(II) i de a o scdea pe aceea a Cr(VI) din soluii apoase de ctre carbonul activat [21]. Aceste rezultate se pot explica prin schimbrile de densitate de sarcin 138

superficial a carbonului cînd bacteria este adsorbit i prin considerarea caracteristicilor structurale i chimice ale peretelui bacterian. De asemenea, se constat un proces competitiv dintre cationii divaleni de Pb(II) i Cd(II) pe de o parte i cationii electrolitici pe de alt parte ce sunt atrai spre gruprile funcionale încrcate negativ ale substanelor polimerice extracelulare. O alt direcie a fost aceea a determinrii activitii antimicrobiene a argintului (0,05% masic) depus pe fibre de carbon activate [22]. Concluzia a fost c efectul antimicrobian nu pare a fi legat exclusiv de prezena argintului i depinde i de concentraia oxigenului dizolvat. Nanoparticulele carbonice au dou caracteristici foarte importante care le fac indicate pentru studiul interaciei lor cu microorganismele: au o suprafa specific foarte mare i o reactivitate foarte ridicat, care le fac apte pentru a influena dezvoltarea bacteriilor cu care vin în contact. Nanoparticulele de carbon au o foarte mare activitate chimic pe de o parte datorit legturilor nesatisfacute ( aa numitele «dangling bonds»), adic electroni necuplai, iar pe de alt parte datorit gruprilor chimice ce apar la marginile planelor grafenice prin expunerea acestor nanoparticule la oxigenul din aer. Aceste grupri pot fi atît acide: carboxil, hidroxil fenolic, hidroxil lactolic i chiar lactona, dar s-a emis ipoteza c i alte structuri oxigenate cum sunt resturi de cromen, cetone si pirone pot prezenta proprietati bazice [23], aa cum se arat în figura 9.4. Sursa bazicitii carbonului o reprezint electronii delocalizai din planele bazale [8].

Figura 9.4- Moedelul structural a nanoparticulelor de carbon [24]

Faptul c suprafaa nanoparticulelor carbonice prezint proprieti acido-bazice , ceea ce înseamn donoare si acceptoare de protoni este un alt argument în favoarea unei interacii puternice cu celulele bacteriene, tiut fiind faptul c acestea prezint sisteme proteice cu funcii de «pompe» de protoni. O alta propritate a suprafeei nanoparticulelor carbonice o constituie cea redox, adic proprietatea de cedare-acceptare de electroni. Un grup de cercetatori americani a studiat aceasta proprietate prin metode de spectrofotometrie UV-Vis si poteniometrice expunand particulele de negru de fum de furnal, unor diversi ageni redox cum sunt Cr(VI), Mn(VII), Fe(III) si SO3²-. Abilitatea suprafeei acestor particule carbonice de a participa la reacii redox cu aceti reactivi a fost corelat cu atribute morfologice cum 139

sunt dimensiunea cristalitelor i aria suprafeei. Datele au artat c abilitatea acestui tip de carbon de a accepta/dona electroni este funcie de densitatea de defecte pe suprafaa negrului de fum [25]. Transferul de electroni este esenial în multe procese celulare, cum ar fi de exemplu cele de fotosintez i de respiraie. Se poate presupune asftel i posibiltatea existenei unui schimb electronic la contactul bacteriilor cu nanoparticulele carbonice, prin intermediul proteinelor existente în peretele bacterian. Dei suprafaa carbonulului este de obicei hidrofob, structura chimic se poate modifica pentru a crete hidrofilicitatea [26]. S-a amintit mai sus c oxigenul reacioneaz cu suprafaa carbonic cconducînd la diverse grupri, polare, cu caracter puternic hidrofil. Aceste grupri pot atrage nu doar moleculele de ap dar i alte grupe polare ce se gsesc din abunden pe suprafaa peretelui bacterian, astfel ele pot adera foarte strîns la nanoparticulele de carbon. Trebuie reinut c grupele carboxil si hidroxil fenolic de la suprafaa carbonului pot ioniza cu formare de ioni de tip Ar-COO¯ i Ar-O¯, unde Ar reprezint restul carbonic cu caracter aromatic. De asemenea, aceste grupe pot interaciona cu structurile ce prezint molecule ionizate pozitiv de la suprafaa peretelui celular, cu formare de legturi ionice puternice. Suprafaa specific foarte mare ca i porozitatea acestor nanoparticule permit adsorbia prin legturi slabe a oxigenului din aer dar i a unor nutrienti din mediul de cultur. Aceste substane adsorbite vor fi eliberate ctre bacteriile care aderente la nanoparticule, fenomen ce poate constitui o explicaie pertinent pentru dezvoltarea foarte rapid a coloniilor de microorganisme. În concluzie, suprafaa carbonului conine o proportie variabila de situsuri active, constituite de catre valentele nesaturate de la marginea straturilor grafenice formate de atomii de carbon, proportie ce creste desigur cu cresterea porozitatii si a dimensiunii suprafeei; pe de alt parte, prezena unor heteroatomi cum sunt în principal oxigenul, hidrogenul si azotul de asemenea introduce situsuri active la suprafaa carbonului, si deci aceasta suprafaa nu e deloc inert cum ar parea [10]. Un alt aspect demn de a fi luat in cosideraie este acela al Hidrocarburilor Aromatice Polinucleare (PAH-uri), care sunt prezente întotdeauna adsorbite la suprafaa particulelor nanometrice de carbon, stiindu-se faptul ca aceste PAH-uri apar ca intermediari in procesele pirolitice ce au ca precursori hidrocarburi in stare de gaz sau vapori. Aceste molecule ar putea interaciona cu bacteriile în dou moduri: pe de o parte ar putea fi oxidate de aparatul enzimatic al acestora i s aib loc astfel un fenomen de biodegradare [27], iar pe de alta parte aceste PAH-uri ar putea strabate barierele membranare si odata ajunse in interiorul celulei sa interfere cu mecanismul de multiplicate al acizilor nucleici bacterieni, provocînd mutaii genetice cu diverse consecinte [28].

Medii de cultura specifice bionanocompozite cu nanomateriale carbonice

Interacia nanoparticulelor cu structurile vii este studiat la ora actual atît din punctul de vedere al nanotehnologiei dedicate aplicaiilor în biologie i medicin, cît i din perspectiva contaminrii mediului ambiant i implicit al organismelor cu aceste nano140

particule. Dou proprieti caracteristice ale nanoparticulelor sunt de mare importan în cadrul acestei interacii: o suprafa specific foarte mare i o mare reactivitate chimic. Datorit compatibilitii in dimensiune a nanostructurilor de carbon cu microorganismele interaciunea lor este urmatat de o multitudine de efecte pozitive sau negative. Combinînd dimensiunea nanometric cu reactivitatea nanoparticulelor sub diferite aspecte biochimice, efectele asupra materiei vii pot fi extrem de benefice dar i dezastruoase. Bionanocompozitele cu matrici de medii de cultur ce înglobeaz nanoparticule de carbon de diferite forme, dimensiuni i compoziii pot fi utilizate în dezvoltarea de noi tehnici bioanalitice. În cele ce urmeaz se descrie realizarea primelor medii de cultur bionanocompozite cu pulberi obinute prin piroliza laser , plasmochimice i respectiv uzuale tipice din tehnologia negrului de fum i a pigmenilor. Interesul în potenialele aplicaii biomedicale ale nanomaterialelor i biocompozitelor provine din percepia c acestea sunt capabile s interacioneze cu biomoleculele individuale, celule sau organite celulare de mrimi micro sau nanometrice. Toate materialele biocompozite au în structura lor nanofibrile sau nanoparticule cu activiti specifice iar în particular pentru acest caz de studiu nanoparticulele de carbon. Diversitatea nanoicroparticulelor existente în mediul ambient sub form de aerosoli influeneaz dezvoltarea microorganismelor i a bolilor infecioase ale pielii. Micropartidulele din aerosoli rezultate din activitatea industrial induc largi clase de îmbolnviri cum ar fi: în mine, silicozele; în industria tipografic ­ boala plumbului; în industria diamantelor, nanoparticulele de diamant induc suferine pulmonare prin eroziunea esutului pulmonar etc. Deasemeni nanoparticulele pot modifica rata de cretere, dezvoltare a microorganismelor, influenînd prin prezena lor pe tegumente dezvoltarea de stafilococii i streptococii cutanate sau a unor parazii cutanai. În particular nanocarbonii pot accelera dezvoltarea de microorganisme atunci cînd sunt imersate în medii de cultur observate în primele stadii de cercetare. Aceste observaii conduce la necesitatea de a dezvolta noi tipuri de medii de cultur care s accelereze creterea coloniilor reducînd astfel timpul de de incubare. În acest scop s-a conceput i realizat o serie de bionanocompozite care sa devin mult mai eficiente ca medii de cultur. Bionanocompozitele concepute cu nanoparticule funcionalizate i asamblate în medii de cultur sunt cocepute pentru creterea rateide dezvoltare a microorganismelor. Statisticile au artat c atunci cînd atmosfera are un grad semnificativ de încrcare cu particule carbonice rezultate de la couri de ardere sau evi de eapament, i procentul de noxe de tip NOx i SOx este crescut, frecventa îmbolnvirilor cu aceste microorganisme fiind mai mare. Nanopulberi carbonice de diferite morfologii au fost înserate în dou medii de cultur prin metode adecvate cu scopul de a estima rata de dezvoltare i virulena diferitelor clase de microorganisme Materiale i metode 141

Nanocarbonii folosii provin din piroliz laser sau din descompunere în plasm (sursa Institutul Naional Fizica Laserilor Plasm i Radiaii). Ca referin s-au studiat i specimene de negru de fum. Caracteristicile materialelor sunt prezentate în tabela 9.1. Structura lor este prezentat în figura 9.5. Se observ c fiecare tip de nanocarbon are o topografie sppecific cu o structur turbostratic difereniate prin natura compoziiei lor i a gruprilor funcionale induse din procesele de sintez.

Tabela 9.1 -Nanocarboni compatibili cu aerosolii din mediu folosii în BNC Tipul Sursa/metoda Caracteristici principale Componeni Impuriti: oxigen, hidrogen, CB ­R Ardere Aria specific: sulf. Negru de incompleta a 10-150 m2/g msurat prin Oxigenul i hidrogenul sunt fum de canal acetilenei absoria de azot (metoda covalent legai de carbonul BET) Diametrul: min20- max 300 de pe supraa particulei Raportul O/H depinde de nm. Distribuie aleatorie condiiile arderii incomplete. In cazul negrului de fum de canal, coninutul de oxigen Pigment-negru cu arie Ardere Pigment este de 2-5% iar cel de specific: 300-500 m2/g. incomplet în negru hidrogen este de 0.5%; furnal cu CB- P În negrul de fum de furnal ciclonizare (negru de coninutul de oxigen este fum de dependent de debitul de furnal) alimentare a hidrocarburilor NC-LP1 Precursori etilen, Structur trubostratic, Hidrogen adsorbit pe NC- CVD1 butadien suprafa NC- LP2 Acetilena cu Structur trubostratic Sulf i fluor sunt prezente în sensibilizator SF6 cantiti apreciabile NC-LP3 Benzene Fragmente fullerenice în Multiple structuri policantiti mici, aromatice (PAH) NC-CVD2 Benzene, toluene,

142

A. a Sferule de CB a) B-R, scala 100nm b) model pen CB, m; ntru distr ribuie aleatoare a planelor grafe enice (BSU) în sf ferula de CB c) CB tratat t termic la 3000K alinierea BS K, SU- este circu umferenial d) dispunerea gr rafenelor în CB e) CBB pari corodat în pl ial lasm-deschider canalelor cu formare rea de n nanopori [11,14, 16]

B) B) NC-LP1-precursor etilen/acetilenre, structur turbostratic tip N pic a) scala 10 00nm b) 10 nm c) Detalii morf fologice d) HRT TEM- contrast de faz- se disting grafenele dispu circumferen e g use ial

C) LP-NC3 din prec L cursor de benzen structur cu f n, fullerene mult tistrat i mari can niti de PAH D) N NC-CVD2, din precursor toluen sferule de nan p n, nocarbon mult tistratificate D) Figu 9.5-Structur de nanocarboni utilizai la fo ura ri formarea de medii bionanocom mpozite (BNC) c matrice cu biologic pe baz de medii de cultur Chapm i AABTL e man

Mat tricea biologi ic: Pentru mic croorganisme Gram pozi ele itiv, respectiv culturi de St v taphylococcu aureus, us s-a ales un mediu Chapman cu adaos de m u u manitol. 143

Pentru microorganismele Gram negativ, respectiv culturi de Escherichia coli, s-a ales un mediu de cultur uzual AABTL. Prepararea mediilor de cultur bionanocompozite În vederea obinerii de colonii microbiene pe mediul de cultur, acesta se topete la o temperatura de 900C, dup care se toarn pe o plac Petri 3ml de mediu de cultur. Pe acesta plac ,dup ce mediul de cultur se solidific prin rcire, se însmîneaz folosind o ans, tulpinile microbiene. Acesta este procedeul normal de însmînare pe mediul de cultur al coloniilor microbiene. Dispersia de nanocarboni în aceste medii este dificil datorit diferenelor mari de densitate i proprietilor de autoaglomerare rapid, de adsorbie pe suprafa de componeni nedorii ce conduce la atenuarea activitii acestora. Din acest motiv metoda de preparare este laborioas i necesit o serie de etape dup cum urmeaz: 1. Se dozeaz pulberea pentru concentraii de 0.01, 0,1 i 1% (grame nanocarbon la 100 grame mediu de cultur). Se usuc fiecare cantitate prin desicare sub vid de argon 2. Transferarea pulberii în 10ml ser fiziologic (cel mai bun rezultat se obine cu serul fiziologic prepart din ap mili-Q, ultrapur,) ulrasonat sub vid pentru o ct mai bun dezoxigenare. 3. Ultrasonarea eprubetei cu ser fiziologic i nanocarboni timp de 20 min la o putere de minim 60W. Din observaiile experimentale se constat c cea mai bun soluie este ca i ultrasonarea s se realizeze în condiii de vidarea sau atmosfer inert. 4. Se toarn mediul topit pe plcile Petri aezate în baia de ultrasonare simultan cu serul fiziologic ce conine nanocarboni cu agitare manual viguroas în cîmpul ultrasonor al bii. Operaia de agitare continu pîn la punctul de gelifiere dup care se las la agitaie ultrasonic timp de 20-30 min pîn la solidificare complet. Se recomand pentru studii i cercetri de mare acuratee ca serul fiziologic cu nanocarboni s fie trecut prin etape de micro/nanofiltrare astfel încît s se selecteze fracii de nanocarboni cu dimensiuni într-o plaj cît mai îngust. Inspecia vizual i optic arat un mediu omogen fr particule aglomerate sau fenomene de coalescen. Funcie de natura experimentului se poate utiliza în locul serului fiziologic elueni cum ar fi: alcoolul etilic, acetat de etil, toluen, cu precauiile necesare asupra scopului experimentului i nivelului de sterilizare. Pe aceste medii de cultur se fac însmînri din culturi proaspete de o zi prin procedee normale care demonstreaz c fa de mediile normale pe bionanocompozite acestea cresc într-un timp mult mai scurt i sunt mult mai viguroase. Au fost efectuate experimente pe mai multe loturi de probe: · De la fiecare pacient recoltat s-au fcut însmînri pe cele trei tipuri de concentraii ale aceluiai tip bionanocompozit cu, 0,01%; 0,1%; 1%, coninut de nanocarboni, i o însmînare pe mediul de control, simplu. 144

· S-au testat totodat tipurile de nanocarbon conform cu tabela 9.1 (nanocarboni din ardere incomplet, carbon turbostratic cu alchene i carbon aromatic (benzen, toluen), care are un coninut ridicat de hidrocarburi poliaromatice i fragmente de fulerene. În figura 9.6 sunt prezentate colonii de Staphylococcus aureus crescute pe mediul de referin i pe bionanocompozite cu concentraii diferite. Se observ c: · BNC cu CB-R ( negru defum de canal) i CB-P (negru de fum de furnal), nu prezint nici o îmbuntire important, coloniile sunt slab dezvoltate, aleator dispersate, de dimensiuni mici. Pigmentogeneza lipsete sau este slab reprezentat.( din tabela 9.1) · BNC cu NC-LP1 (nanocarbon din piroliz laser, precursori etilen): La concentraia de 0,01% coloniile sunt bine dezvoltate similare cu referina sau uor mai mari. Pigmentogeneza este normal. La concentraia 0,1% creterea este exploziv cu pigmentogenez remarcabil. Peste aceast concentraie, la 1%, creterea este slab reprezentat, atipic iar pigmentogeneza lipsete. · BNC cu NC-LP3 ( nanocarbon cu fragmente fullerenice i PAH-uri): La concentraii de 0,01% se observ o cretere atipic de colonii. La 0,1% creterea este remarcabil i pigmentogeneza bine reprezentat. La 1% creterea un este evident, colonii slab reprezentate Toate aceste observaii sunt sumarizate în tabela 9.2.

Tabela 9.2-Comparaie calitativ a virulenei în BNC BNC 0.01% 0.1% 1% CB-R N. O M Ca in R CB-P N.O M to WD Ca in R NC-LP1 WD Pigmentare Exploziv atipic NC-LP2 slab Nu nu NC-LP3 & Forme W. D , neconclude NC-CVD2 atipice pigmentare nt atipica N.O- diferene neobservabile M-evoluie moderat ; WD-colonii bine dezvoltate, R-referina Figura 9.6- Creterea de colonii de Staphyloccocus aureus pe BNC cu diferite specii de nanocarboni i la diferite concentraii

Pentru evaluarea eficinei acestor medii de cultur s-au efectuat experimente de incubare la diferii timpi urmat de inspecia microscopic. S-a urmrit scurtarea timpului de analiz bacteriologic i de identificare a speciilor de microorganisme. În figura 9.6 se 145

reprezint dependena dezvoltrii de colonii funcie de timpul de incubare pentru dou din concentraiile de nanocarboni din BNC considerate optime.Se constat c diagnosticul microbioogic poate fi redus de la 24-48 de ore la 4-8 ore Creterea accelerat a acestor tipuri de microorganisme cu dezvoltare de colonii viguroase i pigmentogenez bine reprezentat este consecina interaciei acestora cu nanocarbonii din mediul de cultur bionanocompozit. Microorganismele aerobe, precum Staphylococcus aureus au nevoie de oxigen pentru dezvoltare iar nanocarbonul are o foarte mare afinitate de a adsorbi oxigenul din atmosfer i al concentra. Acesta este fenomenul principal ce st la baza relaiei nanocarbonmicroorganism. Nanocarbonul are funcia de a ,,pompa oxigenul" în mediul cultur prin urmtorul mecanism: adsorbia preferenial a oxigenului din atmosfer i concentrarea în jurul su. Mecanismul de transport implicat este diferena de concentraie i difuzia prin microporii bionanocompozitului. Din datele de analiz structural i spectroscopie FT-IR arat prezena de grupri OH i carbonil legate covalent de suprafaa nannocarbonilor ce au proprieti de schimbtori de ioni. Aceasta este benefic pentru microorganismele aerobe mari consumatoare de oxigen dar ar putea avea un impact major negativ atunci cînd vin în contact cu tegumentele i pielea. Caracterul de nanoelectrolit al nanocarbonilor poate schimba pH-ul local al filmelor hidrolipidice i aciditatea pielii favorizînd astfel atacul microorganismelor. Astfel se deschid multe canale pentru infecia microbian. În concluzie se poate afirma: · BNCul conceput ca un gel cu nutrieni specifici i cu nanocarboni este un bun mediu de cultur ce asigur o cretere accelerat a bacteriilor aerobe, in particular genului Stafilococcus. · Nu orice nanocarbon este o bun pomp de oxigen prin urmare nu induce creteri spectaculoase. · Concentraiile considerate optime sunt probabil i acelea ce se gsesc în natur i care pot influena aderena microorganismelor pe tegumente favorizînd astfel infecia primar. · Peste concentraia de 1% se poate considera c nano-carbonii pot fi bacteriostatici sau bactericizi funcie de natura i structura lor. Necesitatea unui raspuns mai rapid la investigare clinic bacteriologic cere funcionalizarea unui material avansat în mediul de cultur care s accelereze timpul de detecie al infeciei microbiene Rezultate experimentale prezentate au artat c microorganismele în contact cu nanoparticulele de compoziie i structur diferit au o comportare extrem de diferit în ceea ce privete capacitatea de adaptare i dezvoltare. O deosebit importan trebuie acordat impactului nano-particulelor asupra evoluiei microorganimelor patogene i a influenei acestora asupra diferitelor tipuri de boli de piele. Din acest motiv conceperea unor structuri de bionanocompozite cu nanoparticule carbonice simple ar putea da cîteva rspunsuri extrem de importante pentru medicin i industria medicamentelor. 146

Rezultatele acestui studiu conduc la concluzia c se poate schimba sau îmbunti diagnosticul microbiologic în sensulscurtrii timpului de analiz i identificrii microorganismelor patogen. Deasemeni se poate explica de ce stafilocociile cutanate sunt atît de frecvente în diagnosticul dermatologic, unele sunt greu de tratat i de ce frecvena lor este din ce în ce mai mare

Figura 9.6-Rata de cretere la dou concentraii BNC001 i BNC01 raportate la referin funcie de timpul de incubare. Sgeata indic momentul vizibil al creterii sub lupa microscopic [24]

9.3 Puncte cuantice

De la apariia apei pe pmînt, proprietile naturale de dizolvare- cristalizare a srii sunt perpetue. În timpul cristalizrii o soluie suprasaturat trece prin stadiul de nucleaie, dimensiunea cristalitelor fiind de domeniul nanometrilor. Un exemplu concludent este cel al mrii Aral, care poate fi socotit un exemplu la extrem prin dimensiunea producerii lui. De multe ori în istoria sa, volumul mrii Aral s-a schimbat dramatic datorit variaiilor climatice. În ultimii 30 de ani reducerea mrii cu 60%, a condus la o concentrare a srii de 25%. În anumite momente din istoriia etapei de nucleaie au aprut i sunt prezente tone de nanocristale de clorur de sodiu dispersate în ap. Imaginile luate din staelit arat o reflexie atipic cînd acest fenomen are loc. Din istoria evului mediu putem aminti sticla de geam frumos colorat a catedralelor, vitralii, ce conin particule de zinc, cadmiu, seleniu, sulf. Catedrala Notre Dame din Strassbourg se mîndreste i astzi cu frumoasele ei vitralii, i este foarte posibil ca acestea s fie nanocristale ale compuilor, zinc-cadmiu-sulf-seleniu cu proprieti specifice de emisie sub aciunea spectrului superior a luminii naturale. Relativ recent mecanica cuantic, a demonstrat c electronii liberi se pot confina într-o groap de potenial iar particule cu dimensiuni nanometrice pot expulza electronii spre periferie formînd un ,,pseudoatom" similar modelului lui Bohr cu un nucleu dintr-un 147

miez de ioni în jurul cruia graviteaz electronii generînd un spectru discret similar dar la energii mult mai mici. Termodinamica descompunerii fazei prin difuzie controlat a unei soluii suprasaturate a fost dezvoltat i experimentat pe aliaje metalice artînd c pot fi formate particule nanometrice stabile. Chimia colizilor a furnizat procedee de stabilizare fr înglobare în structuri micelare. Sintezele sol-gel de preparare de nanoparticule au devenit un instrument uzual. Istoric 1973 LEO ESAKI primete premiul nobel pentru dezvoltarea de structuri cuantice semiconductoare, teoria confinrii unidimensionale.[29] 1980. EKIMOV i. EFROS, de la Institutul IOFFE, au observat formarea de puncte cuantice în structura unei sticle coninînd Pb S.[30] 1983 LOUIS BRUS s-a ocupat de confinarea tridimensional de puncte cuantice crescute in lichide organice.[31] 1984 TADASHI ITOH dezvolt teoria confinrii tridimensionale în punctele cuantice crescute în volumul cristalelor de clorur de cupru i clorur de sodiu. 1997, profesor WARREN CHAN, de la Universitatea din Indiana a pus în eviden o metod pentru vizualizarea unei singure proteine i a virusului în actiune. În acelai an a fost posibil demonstrarea prezenei oligonucleotidelor legate de DNA, prin legarea lor de punctele cuantice, un pas important în domeniul analizelor genetice.[32]. Ulterior bioconjugatele coninînd puncte cuantice au artat un drum nou pentru studiile fundamentale în biologie. AKERMAN si echipa sa au demonstrat în 2002, c polimeri ce au în componenta lor puncte cuantice au fost folositi pentru diagnosticul cancerului la soareci.[33]. NIE i GAO, 2002, Universitatea Emory- Giorgia Tech, au injectat polimeri cu puncte cuantice la oareci urmrind procesul de carcinogenez i de metastazare. 2003, la Universitatea din Toronto, profesorul RED SARGENT i grupul su au observat electroluminiscena în infrarou (1000-1600 nm) a nanocristalelor de sulfur de plumb, imersate într-un polimer semiconductor. Aceste nanocristale sau materiale de polimeri hibrizi constituie platforma de plecare pentru electronica integrat, tehnologia optic i cea a comunicatiilor.Toate aceste importante descoperiri ale electroluminiscentei sau fluorescentei, bazate pe prezena punctelor cuantice are utilizri în biologie i medicin, cu conditia s fie biocompatibile, netoxice. În acest sens pledeaz si experimentul efectuat în anul 2002, cînd s-a reusit încorporarea de puncte cuantice in micele de fosfolipide, rezultînd un polimer fluorescent.[34]

Puncte cuantice-nanocristale semiconductoare

Punctele cuantice sunt cristale semiconductoare nanometrice din clasa compuilor binari II-VI, III-V sau III-VI.Nu sunt semiconductori tradiionali. Practic aceste tipuri de materiale nu sunt noi i nici fenomenele fizice implicate- cum ar fi fluorescena dependent de dimensiune. Elemente clasice din fizic cum sunt structura de benzi, raza Bohr, excitoni concur la fenomenul de fluorescen amplificat, dpendent de dimensiunea nanocristalelor semiconductoare. 148

În figura 9.7 sunt prezentate elementele de baz a trecerii de la un semiconductor normal cu dimensiuni macroscopice la un Q-dot i fenomenele implicate pentru a obine fluoresen amplificat. Electronii în volumul unui material semiconductor cu dimensiuni mult mai mai mari de 10 nm au larg spectru de nivele de energie . Fiecare electron ocup un nivel energetic dat i este stabilit c numai doi electroni pot ocupa acest nivel ( principiul de excluziune a lui Pauli). În volumul semiconductorului nivelele de energie sunt foarte apropiate astfel încît poate fi considerat a fi un spectru energetic continu (figura 9.7c).Tot ce este ocupat i contribuie la formarea legturilor chimice formeaz banda de valen Exist o limit superioar de energie pe care electronii o pot ocupa în banda de valen. Pentru a prsi zona de valen i a deveni liberi s conduc un curent electric este necesar un supliment de energie bine definit. Acest interval de energie se numete band interzis. Prin urmare nivelele de energie situate sub banda interzis formeaz banda de valen iar nivelele energetice de deasupra benzii interzise formeaz banda de conducie. Dac un stimul extern va furniza asupra electronilor din banda de valen suficient energie atunci el va trece din banda de valen lsînd în banda de valen un gol pozitiv. Astfel se formeaz o pereche electron-gol care se numete exciton. Prin urmare exist un minim de energie a radiaie ce provine de la stimulul extern pentru a produce generarea de perechi electron-gol. Banda interzis are un profil energetic bine stabilit prin compoziia i structura semiconductorului. Electronii care au tranzitat banda interzis în banda de conducie vor staiona un anumit timp dup care se vor reîntoarce în banda de valen ­starea lor natural. Revenirea în banda de valen se realizeaz prin emisia unei radiaii electromagnetice cu o lungime de und bine precizat egal cu energia pierdut datorit tranziiei. În general tranziia electronilor se realizeaz de la marginea inferioar a benzii de conducie la marginea superioar a benzii de valen. Pentru semiconductorii clasici aceste tranziii produc emisii cu o frecven fixat. Punctele cuantice ofer o abilitate nenatural i anume de a-i acorda banda interzis i de aici lungimea de und a radiaiei emise. Dac privim figura 9.7 e,f observm c perechea electron-gol este separat de o anumit distan. Ne putem imagina c electronul prsind un atom din structura sa el va gravita pe o raz dat în cristal fiind strict dependent de proprietile acestuia. Distana dintre electron i ionul de unde a plecat se numete raza excitonului sau mai simplu "raza Bohr a excitonului", termen împrumutat de la modelul Bohr al atomului de hidrogen. Dac privim formarea benzilor de energie de la un semiconductor normal spre un Q-dot observm imediat c atunci cînd dimensiunea acestuia este mai mic decît raza excitonului (Re) nivlele energetice devin discrete iar electronul este constrîns s evolueze în spaiul delimitat de nanocristal ( fenomen denumit confinare cuantic), figura 9.8 Fluorescena punctelor cuantice este net superioar oricror tipuri de colorni utilizai în tehnicile de biologie, microbiologie, pentru etichetarea i eantionarea materialelor biologice 149

Figura 9.7-Formarea unei perechi electron-gol (exciton) i fenomenul de fluorescen amplificat. a) Q-dot cu dimensiunea de ~30nmm miezul este un nanocristal de CdSe iar înveliul de stabilizare este ZnS. b) Nanocristal de PbSe (imagine TEM), se observ natura cristalini dispunerea ordonat a atomilor de Pb (puncte negre) i de Se c) structura de benzi a unui semiconductor normal (electronii ocup la temperaturi normale numai banda de valena. d) sub aciunea unui stimul extern (radiaie e.m) electronul sare în banda de conducie lsând un gol e) perechea elelctron-gol este un cuplu instabil ce evolueaz în volumul cristalului ca o cuasiparticul- excitonul. f) Recombinarea lor ( reîntoarcerea electronului în banda de valen) are loc cu emisia de radiaie cu o frecven bine precizat.

150

Figura 9.8-Trecerea de la un cristal normal (a) la un nanocristal ( b) conduce la discretizarea nivelelor benzilor de energie i dpendena largimii benzii interzise de dimensiune. Când raza excitonului, Re, este mai mare ca RQ atunci absorbia radiaiei se realizeaz pe domenii largi iar emisia este extrem de îngust proprorional cu dimensiunea Q-dotului

151

Aplicaiile punctelor cuantice

Microdomenii de celule maligne ( cancer protein microarrays) Scopul este identificarea i localizarea zonelor microscopice de celulel maligne. Cercetarea în domeniul biologiei celulare i a proteinelor este de a gasi noi proteine int.specifice unor produse farmaceutice i de biomarcheri în vederea managementului cancerului i a altor boli umane. De exemplu ( Evident Technology i Protea Biosciences) se dezvolt o serie cupluri anticorpi-puncte cuantice pentru investigarea de serii de proteine canceroase. Prin simple investigri de probe se pot identifica configuraii de proteine cu expresii difereniate dintr-o matrice de proteine. Mai mult microzone de esut din diferite tipuri de cancere pot fi identificate cu anticorpi cuplai cu puncte cuantice fluorescente. Absorbia celular de receptori mediai cu puncte cuantice Utilizarea punctelor cuantice ca ,,sonde" intracelulare prezint un potenial imens prin faptul c ele pot fi absorbite în celul Tipuri de puncte duantice solubile în ap (WSQD) prezint avantajul c pot fi transferate în celul prin metoda receptorului mediat prin conjugare la o protein de transfer. Din figura 9.9 se bserv c funcionalizarea punctelor cuantice se realizeaz în general prin straturi lipidice (naturale sau sintetice) covalent legate de înveliul de ZnS prin interemdiul atomilor de sulf. Structura acestor tipuri de puncte cuantice este format dintr-un miez de cristal nanometric de InGaP ce confer o bun toleran la toxicitate.

Figura 9.9 -WSQD ­ cu functionalizare natural cu lipide(tipul2) respectiv funcionalizare sintetic (tipul 1.)

Figura 9.10- Imagistc cu WSQD în domeniul NIR pentru identificarea tumorilor ( evidenttechnology.com)

Studiile au artat c toxicitatea punctelor cuantice cu miez de CdSe se datoreaz ionilor de Cd ce se elibereaz în celul. Fenomenul se datoreaz aciunii oxigenului ca rezultat al expunerii la UV timp îndelungat al punctelor cuantice. Acoperirea cu ZnS creaz o suprafa mai benign la aceste fenomene. Desigur punctele cuantice se pot acoperi cu polimeri îns în foarte multe cazuri aceti produc moartea prematur a celulelor. Studiile de citotoxicitate au artat c sistemele InGaP/ZnS sunt mult mai limitate în toxicitate [35, 36,37] Un exemplu al cercetrilor actuale cu tipul 2 este prezentat în figura 9.10 unde WSQD sunt utilizate în investigarea tumorilor prin tehnici de imagistic în domeniul NIR 152

( infrarou îndeprtat) unde esuturile sunt transparente iar tumorile pot fi puse în eviden prin fluorescen direct.În figura 9.10 este prezentat un exemplu pe un oarece cu o tumor cruia i s-a injectat 100 pmol de WSQD tipul 2 diluate în ser fiziologic . Se observ un contrast evident dintre localizarea tumorii i esuturile normale. Distribuia prin sistemul limfatic, vezica urinar i ficat practic este inexistent. Investigarea prin imagistic optic în domeniul NIR combinat cu punctele cuantice poate produce un impact major în detecia i diagnosticul i tratamentul cancerelor

Punctele cuantice un instrument versatil în tiintele vieii

Multiplexarea spectral. Qdoturile emit o radiaie caracteristic cu lungime de und fix independent de sursa de excitare. Prin urmare Qdoturile pot fi combinate în acelai test sau analiz i cu aceeai surs de excitare furnizînd un semnal ce poate fi multiplexat. Aceasta permite utilizarea lor în matrici sau în sisteme cu rezoluie spaial Qdoturile au artat c sunt foarte eficiente pentru transferul rezonant de electroni (donori de electroni) spre fluoroforii organici datorit unei largi acoperiri dintre spectrele de emisie i absorbie a coloranilor. Deoarece caracteristicile de emisie ale Qdoturilor pot fi acordate continu este posibil de a crea un numr de donori prin transfer rezonant de energie,pentru orice tip de colorant organic care de obicei emit aproximativ între 510-640 nm Microscopie i colorarea celulelor, imagistic in vivo Qdoturile conjugate cu anticorpi au fost cu succes introduse în celule permeabilizate i folosite pentru colorarea citoskeletonului, centromerilor, cinetocorilor, organele din broasc sau embrioane de nematode. Datorit fotostabilittii mari i proprietilor de multiplexare a culorilor multiple componente celulare pot fi observate în dinamica lor folosind microscopia confocal cu fluorescen. Deasemeni studiul metabolismului celular devine cu punctele cuantice uor de investigat ca de altfel orice tip de fenomen de transport Analize imunologice Punctele cuantice conjugate cu anticorpi primari au fost folosite pentru colorri preferniale a suprafeei E. Coli patogene i respectiv nepatogene. O excelent difereniere între cele dou specii poate fi realizat prin analiz de multiplexare a fluorescenei cu diferite puncte cuantice.

Puncte cuantice fluorescente, imagistic de fluorescen, aplicaii în microbiologie, parazitologie, hematologie

Se va enumera cîteva din aplicaii ale punctelor cuantice bioconjugate solubile în ap cu exemplificri acolo unde este posibil Evidenierea activitii celulare prin indexare fluorescent: · ,,Traficul molecular" intra i extracelular · Urmrirea diferenerii celulelor stem · Monitorizarea instabilitii genetice · Localizri moleculare la nivel celular 153

Imagistic molecular · Detecia timpurie a bolilor i monitorizarea tratamentului · Modaliti multiple de imagistic non invaziv (PET, SPECT, MRI, UV-Viz, ageni de contrast optic) Selecii i sortri de înalt performan a materialelor biologice · Microarii (proteomic, genomic) · Coduri de bare Citometrie reologic · Msurarea multipl i simultan a parametrilor celulari (coninutul de acizi nucleici, activitatea enzimatic, fluxul de calciu, potenialul membranei, pH) · Sortarea celular (separarea celulelor sau a sub compo-nentelor acestora) Fluorescen rezonant cu transfer de energie (FRET) · Identificarea interaciei dintre dou sau mai multe molecule · Înlocuirea fluoroforilor clasici i extinderea domeniului de fluorescena cu surse de excitaie minime Se constat c punctele cuantice deschid o nou etap întehnicile de analiz i investigare datorit fotostabiltii mult mai mari fa de fluoroforii clasici cu fluorescen îndelungat permiînd astfel s se investighezemecanisme moleculare i s elimine contaminrile spectrale ce necesit metode de corecii suplimentare. Montajul de figura 9.11 descrie eficiena noilor materiale ca instrumente de investigare a materiei vii.

Figura 9.11. Metod de investigare a sturcturilor organismelor vii prin metoda microscopiei de fluorescn confocale cu fibr optic. Fibra optic este format dintr-un set de microfibre din care una este de excitaie. Unitatea laser de scanare conine microscopul confocal, optica de mrire i detectorul CCD de prelucrare imagin ( 20-50 cadre/sec).Dioda laser cu =488nm poate excita toat gama de puncte cuantice dar i fluoroflori clasici (Syto13, Yoyo1, FITC, CellTracker Green, Calcein, Rhodamine, 123 or 6G, Cy3,). Sunt prezentate trei aplicaii: acces extern, endoscopic i invaziv minimal ( cu permisiunea Cellvizio tech)

În figura 9.12 sunt prezentate cîteva cazuri de investigare cu Qdot funcionalizate a materialelor biologice la nivel celular respectiv molecular. 154

Explorarea transformrii liniilor celulare mamliene cu Q-dots Carcinom de colon- liniile HT29 i SW 1222 (detalii,evitenttechnology.c om)

Figura 9.12 a. Celule neoplazice etichetate cu Qdot conjugate. Marcherul cancerului de plmîni, Her2, s-a detectat pe celule cu o combinaie de Herceptin biotinilat Cercetri în neurotiine *Imagistic în adîncimea creierului *Neurogenez Postnatal *Boli neuro-degenerative Celule stem & terapie regenerativ *Reparaii neuronale Figura 912b ­Explorri neuronale, investigri cu puncte cuantice funcionalizate Cercetarea cancerului Observaii histologice in vivo Angiogeneza tumorilor Imunoterapie Caracterizare criptfoci Cancere colorectale

Figura 9.12 c-Explorri histopatologice Cercetri microvasculare Arhitecturi microvasculare Angiogeneza Hemodinamica Interacia leucociteendotelium, inflamaii Permeabilitatea vaselor Densitatea capilarelor

Microvascularizare a mesenterului Leucocite Figura 9.12.d- Explorri sanguine

155

Expresia genelor, cercetri preclinice detecia drogurilor în ficat *Distribuia medicamentelor *Monitorizarea Apoptozei *Toxicitatea celular Rezultate puse la dispoziie prin amabilitatea firmei Evident technology

Figura 9.12-e Exemple de aplicii ale punctelor cuantice în medicin i biologie, explorri genetice

Protocoale eleborate pentru investigarea i identificare unor clase de microorganisme

Materiale Punctele cuantice utilizate în experimente au fost achiziionate de la Evident technology, SUA. Protocoalele de funcionalizare s-au derulat sub asistena firmei care a

furnizat materialele i substanele necesare. Protocoale de funcionalizare puncte cuantice Principiul functionalizarii Funcionalizarea punctelor cuantice prin conjugare cu proteine, oligonucleotide i alte molecule de interes poate fi relativ uor realizat prin protocoale de complexitate medie. Reaciile care au loc sunt urmtoarele: Protocol 1- Legarea chimic a streptavidinei la punct cuantic tip Evitag ( firma Evident Technology) funcionalizat cu grupri carboxilice Materiale : (sursa Evident technology) 1. Puncte cuantice CdSe/ZnS funcionalizate cu grupri carboxilice ( EVITAGAndirlock, emisie 540 nm, excitaie sub 450 nm (de la albastru spre UV), 0.25mg/ml 2. Microfiltre pentru separare prin centrifugare- Pall Nanosep tip 100k 300kMWCO 3. Soluie EDC [(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl 200 mg/ml- livrat cu punctele cuantice 4. Sulfo-NHS (N-hydrocylsulfo-succinimide)- 0.15mg/ml, ap DI 156

5. 10x: (1.37M NaCl; 27mM KCl; 101.4mM Na2HPO4; 17.6mM K2HPO4) pH 7.4, soluie tampon conform cu specificaiile productorului EVITAG notat PBS i preparat în laborator 6. Ap steril 7. Streptavidin (5mg/ml) Metoda- filtrare prin centrifugare, legare chimic ultracentrifugare Echipamente- centrifug laborator, lamp UV, siringi microlitrice, fiole de stocare A) activare carboxi-EVITAG prin combinare a urmtorilor reactivi, incubare la temperatura camerei 1h, agitare manual : · 50l- ap steril · 40l 10x PBS · 200l EviTags (0.25mg/ml) · 10l EDC (200mg/ml) · 100l sulfo-NHS (0.15mg/ml) Cantitatea excesiv de sulfo-NHS este eliminat prin colectarea soluie dup limpezire, expunere la UV, observarea prii fluorescente a soluiei. B) Desalinizare centrifugal · Asamblare filtru umectat în PBS în fiola de centrifugare · Încrcare filtru cu soluia de la punctul A, centrifugare min 6000 rpm minim15 min pîn <10% din soluie rmîne deasupra filtrului · adugare 500 l la soluia colectat i 1xPBS, filtrare normal pe hrtie milipor dac este cazul · Verificare fluorescentcu expunere la UV. Soluia se pstreaz în condiii normale C) Conjugare: prin adugarea proteinei de interes ( 100l Streptavidin, 5mg/ml) Un raport de 10:1 streptavidin la EviTag, raportul utilizat fiind mg/mg Incubarea soluiei activate i desalinizate de la punctele A i B cu streptavidin la temperatura camerei, agitare liber. Soluia cu EVITAG ­streptavidin se poate realiza dup 2 ore. Stabilitatea este 6 luni. Protocolul 1 este adaptat dup specificaiile firmei Evident technology i corectat cu referina [38] Protocol 2 Materiale 1. 2. 3. 4. 5. Soluie tampon fosfat de sodiu, , 0.5M, pH 6.0 Soluie tampon , borat de sodiu , 0.5M, pH 8.3 Streptavidin, 10mg/ml în ap distilat EviTags, 2nmol/ml în ap distilat EDC 157

6. sulfo-NHS Echipamente · Ultracentrifug · Lamp UV · Baie ultrasonic A) Activare carboxi-EVITAG prin combinare a urmtorilor reactivi, incubare la temperatura camerei 30h, agitare manual · 2ml EviTag · 0.4ml fodfat de sodiu · 20mg EDC · 15mg sulfo-NHS B) Desalinizare mixtura de reacie prin ultracentrifugare ( max 140000 g), 40 min C) Aspirare ( prelevare) supernatant cu verificare fluorescen D) Conjugare . · 0.5ml streptavidin, 10mg/ml) · 1.5ml ap distilat · 0.4ml sodium borate buffer E) Incubare RT în baie ultrasonic pîn cînd precipitatul se dizolv F) Agitare fiol timp de 2h G) Stocare 12 h în fiol închis H) Centrifugare la 40000 rpm min 80 min I) Recuperare supernatant în fiol cu 5ml ap J) Se repet paii H-I dac controlul fluorescenei nu este corect sau prezint turbiditate peste noapte K) Pstrare: 40C la întuneric Acest protocol este în general satisfctor pentru analize curente de microscopie de fluorescen pentru investigri uzuale i în parazitologie [39, 40] Protocol 3 Cuplare oligonucleotide sulfhidril modificate la puncte cuantice EviTags funcionalizate cu grupri aminice A) activare amin-EviTags cu sulfo-SMCC · Combinare 1:1 molar echivalent de sulfo-SMCC i amin EviTag în 50mM de soluie tampon de fosfat de sodiu pH 7,4 ( PBS , pH7 este deasemeni recomandat) · Incubare 60 minutes la RT ( temperatura camerei) · Eliminarea excesului de reticulator cu coloan de desalinizare echilibrat cu soluie tampon de conjugare (1mM EDTA, 0.1M fosfat, 0.15MNaCl, pH 7.2; pentru preparare se adaug 20l de 0.5M EDTA la 10ml de PBS pentru 158

fiecare 10 ml soluie tampon de conjugare necesar). Coloana de desalinizare PD-10, Amershan Nr 170851-01 sau D-Salt-dextran column, Sigma Aldrich · Fracia de EviTag este identificat prin controlul fluorescenei. În caz de diluie mare atunci se filtreaz cu filtru 100kD MWCO B) Cuplare EviTags maleimid activate la gruprile sulhidril · Mixare oligonucleotide sulfhidril modificate ( sursa EvidentTechnology) cu EviTag maleimid activate în conjugare cu soluia tampon · Incubare 4 ore la 40C Materiale ( sursa Evident Technology) · 1x PBS · 10x PBS · Oligonucleotide. 0.1mM (5' sulfhydryl modifi ed oligo) · BMPA, 200mM (N-ß-Maleimidopropiovnic acid) · Omega Nanosep Column 3000 MWCO · H2O · Amine EviTags (0.25mg/ml) · EDC, 100mg/ml · Tris, 1M, pH 7.4 · Omega Nanosep 3,000 and 100,000 MWCO spin fi lters Etape: A) Activare oligonucleotide prin combinare reactivi i incubare 2 h, RT · 450 l 1x PBS · 25 l 5' sulfhydryl-modifi ed oligonucleotide (0.1mM) · 25 l BMPA (200mM) B) Purificare oligonucleotide activate Filtrare prin centrifugare cu filtre de centrifugare (Omega Nanosep 3000 MWCO spin fi lter); 15 min la 5000g pentru înlturarea excesului de BMPA. Volumul reinut este aprox 140 l la care se adaug 1xPBS i aducere la 140 l C) Conjugare EviTag la oligonulcelotide activate Incubare 2h la RT · 70l purifi ed BMPA-oligo · 270l H2O · 50l 10x PBS · 100l amine-EviTags · 10l EDC (100mg/ml) La final se adug 500l 1M Tris pH 7.4. Utilizînd microscopul optic cu camer video, programul MATLAB cu modulul Image Processing au fost puse în eviden diferite aspecte din laboratorul clinic. De 159

remarcat c lucrnd cu puncte cuantice solubile în ap funcionalizate cu strptavidin (WSQD) s-au pus în eviden culturi de E. Coli pe BNC cu concentraii diferite descrise anterior, Stafilococ aureus pe BNC pe concentraii diferite, identificri rapide de parazii intestinali ( Enterobius, Giardia, i respectiv investigri de anemii de tip hipocrom )

BNC cu 0,1 % i 0,05% nanocarbon, E. Coli Matricea biologic de baz, mediul de cultur AABTL

BNC cu 0,1% NC, cultur Stafilococ aureus. Matricea biologic de baz, mediul Chapman

Identificarea cu WSQD de Enterobius în examenul

Enterobius, detaliu de fluorescen

160

coproparazitologic direct

Examen coproparazitologic direct, identificare Giardia cu WSQD

Identificarea anemiilor de tip hipocrom

Tehnica implementat cu WSQD elimin foarte multe din inconvenientele unor biosenzori de fluorescenî ele însele fiind biosenzori fluoresceni individuali. Au proprieti de stereospaialitate prin funcionalizarea lor cu biomolecule de bioafiniti diferite. Înlocuiesc tehnicile clasice de colorare, interferenele dintre lumina de excitaie. Se constat c WSQD sunt un instrument extrem de eficient în analizele medicale. Combinarea BNC cu WSQD imbuntete substanial tehnicile punnd în eviden numai printr-o simpl inspecie microscopic diferenieri clare ale microorganismelor de tip parazitar. Este o tehnic eficient care se aplic paraziilor cutanai Demodex, scabiae ( care sunt de mare risc i înc nu se pot preparate permanentizate). Instrument de difereniere a tipurilor de anemii [41]

161

9.4 Referine

1 Frenot A., Chronakis I.S. Current Opinion in Colloid and Interface Science; 8: 64­75. (2003) 2 Bognitzki M., Czado W., Frese T., et al. Adv Mater,13,70. (2001) 3 Ko F., Gogotsi Y., Ali A., et al.,Adv Mater; 15,1161-5 (2003) 4 Kenawy E.R., Bowlin G.L., Mansfield K., et al. J Contr. Release; 81:57­64. (2002) 5 Boland E.D., Wnek G.E., Simpson D.G., Pawlowski K.J., Bowlin G.L. J Macromol Sci, 38:1231­43.(2001) 6 Matthews J.A., Wnek G.E., Simpson D.G., Bowlin G.L. Biomacromolecules; 3, 232­8. (2002) 7 Tepper F., Lerner M., Ginley D.American Ceramic Society Bulletin, 80, 57-60. (2001) 8 Hartgerink,J.D., Beniash E., Stupp S.I, PNAS; 99, 5133­8 (2002). 9 Prum R.O., Torres R.H., Williamson S., Dyck J. Nature, 396, 28­9. (1998) 10. Shawkey M.D., Estes A.M., Siefferman L.M., Hill G.E. Proc Roy Soc, Ser B; 270, 1455-60. (2003) 11 Doolittle R.F. Fibrinogen and fibrin. Ann Rev Biochem; 53, 195-229. (1984) 12. Henschen A. Thromb Res;Suppl 5, 27-39(1983) 13 Doolittle R.F., Blomback M., Henschen A., et al. Nature; 218, 130-4. (1968) 14 Kudryk B., Reuterby J., Blomback B. Thromb Res; 2, 297-303,(1973) 15 a.Boland E. D., Wnek G. E., Simpson D. G., Pawlowski K. J., Bowlin G. L., J. Macromol.Sci.,38, 1231-43.(2001) b.Bognitzki M, Hou H., Ishaque M.,et al. Adv Mater; 12: 637-40. (2000) c.Hartgerink, J. D., Beniash E., Stupp S. I., PNAS; 99, 5133-8. (2002) d.Matthews J. A., Wnek G. E., Simpson D. G., Bowlin G. L. Biomacromolecules; 43:4403-12. (2002) 16 D. B. Warheit, Materials today, 32-36 (2004) 17 P.H.M.Hoet, I. Bruske-Hohlfeld, O. Salata, J. of Nanobiotechnology,2:12, (2004) 18 A.M. Glauert, M.J. Thorley, Annu. Rev. Microbiol, 23, 159-198, (1969) 19 Microsoft Encarta Encyclopedia 2002 20 Balbaie V., Posogy N. editori, Epidemiologie medicala, vol II, Ed Medical, Bucureti, (1985) 21 J. Riviera-Utrilla, I. Bautista-Toledo, M.A. Ferro-Garcia, C. Moreno-Castilla, Carbon, 41, 323-329 (2003) 22 H. Le Pape, F. Solano-Serena, P. Contini, C. Devillers, A. Maftah, P. Leprat, Carbon, 40, (2002), 2497-2954 23 M.A. Montez-Moran, D. Suarez, J.A. Menendez, E. Fuente, Carbon, 42, (2002), 24 Stamatin Luminita, Stamatin I., Nanobiocomposites based on nanocarbon for cell culture media, in Nanoengineered Nanofibrous Materials, Ed. Y. Gogotsi, S. Kacac, Kluwer, pp289-298 (2004) 162

25 Goeringer S., Tacconi N.R., Chenthamarakshan C.R., Rajeshwar K., Wampler W.A., Carbon, 39, 512-522, (2001) 26 F.Rodriguez-Reinoso, Carbon, 36, 159-175,(1998) 27 Habe H., Omori T., Biosci, Biotechnol, Biochem., 67, 225-43, (2003) 28 I. Alfheim, A. Lindskog, Sci. Total Environ, 15, 203-22 (1984) 29 http://nobelprize.org 30 Golubkov V, Ekimov A., Onushenko A., Tzehomskii V., Sov. Phys.and Chem.of glass, 6, 511, (1980 ) 31 Rosseti R., Nakahara S., Brus L., J.of Chem Phys, 79,1086, (1983) 32 C. B. Murray, C. R. Kagan, M. G. Bawendi,Annual Review of Materials Science, 30, 545-610, (2000) 33 Åkerman Maria E., Warren C. W. Chan, Pirjo Laakkonen, Sangeeta N. Bhatia, Erkki Ruoslahti , PNAS, 99, 20-27 (2002 34 Zhang Q, et all, PNAS, 104, 17843-8.(2007) 35 Christian Kirchner, Tim Liedl, Stefan Kudera, Nano Letters, 5, 2, 331-338, (2005) 36 Austin M. Derfus, Warren C. W. Chan, et al Nano Letters,4, 1, 11-18 (2004) 37 Florescu L. Gavrila, Fleaca C., Voicu I., Morjan I., Stamatin L., Stamatin Ioan, Appl Surf Sci. 253,19, 7729-7732, (2007) 38 Grabarek Gergely Anal. Biochem. 15;185,131-5 (1990) 39 G.T Hermanson,. Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York; pp226, (1996). 40 Baoquan Sun, et al., Journal of Immunological Methods 249 85-89. (2001) 41 Luminita Stamatin, Cercetri asupra structurilor de biosenzori implicai în diagnosticarea i monitorizarea bolilor parazitare ale pielii, Tez doctorat, 2006, coord T. esan

163

164

10 Nanotuburi de carbon

Nanotuburile de Carbon (CNT-carbon nanotubes) i microscopia de fore atomice pot fi considerate promotorii nanotehnologiei. CNT-urile au entuziasmat lumea tiinific prin proprietile lor remarcabile electronice, mecanice i termice. Posibilitatea funcionalizrii lor a deschis calea spre noi funcii specifice conexiunea spre nanobiotehnologie i a materialelor avansate, econanotehnologie. CNT-urile au un potenial ridicat pentru aplicaiile posibile în ramura energiei, a electronicii, IT-ului. Totui, datorit insolubilitii nanotuburilor în solveni, chimici, biochimici i biologici, folosirea acestor materiale a fost mai degrab limitat. CNT-urile solubile în ap i solveni organici reprezint un interes din moment ce pot deschide noi abordri în dezvoltarea de nanocompozite, nanosenzori, electronic molecular.

10.1 Istoric

Descoperirea lor este legat de cea a fullerenelor, forme alotropice ale carbonului, molecule compuse din carbon în forma unor sfere, elipsoid sau de tuburi. Fullerenele sferice se numesc buckyball i acelea cilindrice se numesc buckytub sau simplu nanotuburi de carbon (CNT). Fiecare dintre ele poate fi considerat ca un mod de organizare spaial a grafenelor (planele bazale din grafit). Fullerenele au fost descoperite de în 1985 de Curl, Kroto i Smalley la Universitatea Sussex, UK i Rice University (Houston, Texas) iar denumirea lor provine de la arhitectul Richard Buckminster Fuller care a construit un dom cu acest tip de geometrie [1]. În 1996 cei trei chimiti primesc premiul Nobel pentru aceast descoperire. Aceast familie era diferit de cea a grafitului i diamantului, C60 este o molecul format din 60 de atomi de carbon.Totul a început de fapt cînd experimentele lui Kroto au fost fcute cu ajutorul unui instrument realizat de Smalley ce studia clusterii moleculari. Kroto era interesat de tehnica lui Smalley, aceea a vaporizrii laser, pentru a verifica o teorie despre existena lanurilor lungi de carbon din spaiul interstellar. Kroto s-a gîndit c stelele roii gigante bogate în carbon produc forme complexe ale carbonului pe care radioastronomia putea s le detecteze. Acest grup de cercetare a încercat s identifice structura chimic a acestei noi familii folosind un spectrometru de mas. Smalley a alturat mai multe poligoane lipindu-le cu o band izolatoare obinînd structura perfect simetrica a C60. Aceast nou molecula de carbon (C60) a primit numele de "buckyball". În timp ce grafitul conine atomi de carbon sub forma plane grafenice ,,suprapuse", "buckyballs" sunt similare unor cuti sferice ce au legturile carbon-carbon foarte puternice cu acelai tip de hibridizare ca în planele grafenice. În 1991, au fost descoperite nanotuburi de carbon în funinginea depus pe un catod de carbon a unui arc voltaic. Acestea au fost descoperite de Sumio Iijima în laboartoarele de cercetare fundamental a firmei NEC din Tsukuba, Japonia. Micrografiile observate cu 165

un microscope electronic de înalt rezoluie au artat c nanotuburile de carbon multistrat (MWNT) ale lui Iijima erau înrudite cu fullerenele. Dei MWNT sunt înrudite cu fullerenele, ele nu sunt molecular perfecte [2]. În 1993, s-au descoperit simultan nanotuburile cu carbon unistrat (SWNT) de ctre Iijima i Toshinari Ichihashi de la NEC [3] i Donald S. Bethune et col [4]de la IBM Almaden Research Center din San Jose, California. Cele dou grupuri au descris rolul de catalizator pentru fier, nichel sau cobalt, introduse în anodul arcului voltaic din reactorul de sintez pentru nanotuburi i C60. Rezultatul a fost o funingine pe pereii camerei iar microscopia de transmisie electronic (TEM) a pus în eviden c funinginea era alcatuit din mai multe SWNT ce aveau o distribuie variat a diametrelor. Funinginea nu coninea nici un MWNT. În prezent sunt dezvoltate o serie de metode de sintez pentru fullerene (ablaie laser) respectiv pentru nanotuburi ( ablaie laser, CVD, CTR-chemical transport reaction) unde se folosesc descompunerile termice ale gazelor (metan, acetilen, etilen) în prezena catalizatorilor nanometrici din grupa fierului [5, 6, 7, 8]. Structurile tipice a celor trei tipuri de carbon C60, SWNT, MWNT sunt prezentate în figura 10.1

Figura 10.1-Fullerene C60 i C70, nanotuburi multiperei (MWNT), nanotuburi uniperete (SWNT) forma scaun (armchair) respectiv zigzag rezultai din roluirea i inchiderea planelor grafenice pe cele dou axe de simetrie. Formele chiralice depind de axa de roluire. SWNT ­zigzag au unele din legturi C-C paralele cu generatoarea i au un caracter de semimetal iar SWNT ­ scaun are lgturi C-C perpendiculare pe generatoarea cilindrului cu comportare de semiconductor. Formele chirale au o ax de chiralitate similar cu ADN.

În tabela 10.1 sunt prezentate cele mai importante din realizrile tiinifice cu nanotuburi de carbon 166

Tabela 10.1- Cronologia dezvoltrii nanotuburilor Anul Evenimentul Referine 1993 Sinteza SWCNT [3,4] 1997 SWCNT forma metalic [9] Studii spectroscopice, corelaii dintre structura atomic i [10 , 11] 1998 electronic 1998 FET cu SWCNT forma semiconductoare [12] 1998 SWCNT solubili via modificri chimice [13] 2000 Senzor chimic cu SWCNT individuali [14] 2000 Spectru Raman pe SWCNT singular [15] 2000 Transport balistic în SWCNT [16, 17] 2001 Operaii logice cu sdispozitive pe baz de SWCNT [18,19] 2001 Tranzistor cu SWCNT [20] 2002 Separarea complet în soluie din mnunchiuri cu SWCNT [21] 2004 Electroluminiscena SWCNT [22] 2004 Spectroscopia modurilor fononice cu rezoluie atomic [23]

În prezent se cerceteaz descoperirea de noi forme ale carbonului, fizico-chimia fullerenelor, producerea de cantiti industriale de CNT, metode de purificare, solubilizare, funcionalizare, separare dup natura metalic sau semiconductoare, definirea cu exactitate a proprietilor. Nanotuburile pot avea proprieti metalice comparabile sau mai bune decît ale cuprului sau pot fi semiconductori, ca siliciul în tranzistori, totul depinzînd de structura lor. Pot conduce de asemenea cldura similar diamantului, i din moment ce este carbon, chimitii pot crea legturi între atomii de carbon a fullerenelor i nanotuburilor cu ali atomi sau molecule. Aceast "abilitate" de a lega sau ataa alte molecule sau atomi de nanotuburi sau/i buckyballs le fac s fie un nou nanomaterial ce se poate folosi în sistemele biologice sau s fie legate în materialele compozite. Teoretic s-a calculat c din nanotuburi se vor face cele mai puternice fibre vreodat ( aproximativ de 100 de ori mai puternice ca oelul), cu doar 1/6 din greutatea lor. Se poate afirma c nanotuburile i buckyball-urile sunt cele mai interesante materiale descoperite în ultimele decade. De notat c din procesele de sintez rezult întotdeauna mnunchiuri de NT terminate cu jumti de fullerene.

10.2 Structur, proprieti

Structura geometric

Structura geometric din care provine un nanotub este rezultatul închiderii unui care este o combinaie liplan grafenic dup o ax chiral definit de un vector chiral niar a vectorilor celulei unitare a planului grafenic (figura 10.2): , , unde n i m sunt întregi (nm) [7]. Vectorul chiral poate fi privit ca vectorul ce conecteaz dou puncte identice din cadrul planului grafenic definind direcia de roluire. Unghiul chiral , a nanotubului este definit ca unghiul dintre vectorul reelei, , i vectorul chiral, , fiind dat de arctan 3 / 2 . Numai tuburile zigzag i 167

armchair sunt caracterizate prin , 0 respectiv , . Ele au simetrie axial corespunzînd grupului punctual de simetrie Dnd (n, impar) sau Dnh (n, par). Toate celelalte nanotuburi (n,m) prezint simetrie spiral i sunt chirale.

Figura 10.2-Construcia unui nanotub cu vectorul chiral =(4,2) dintr-un plan grafenic. Vectorul de translaie =(4,-5) este obinut prin prelungirea direct din punctul O normal pe pîn trece prin punctul identZic de pe reea.Vectorul de translaie, i vectorul chiral, formeaz dreptunghiul OABB` care este celula unitar a tubului cilindric desfurat. a) SWNT ­armchair, b) zigzag, c) chiral

Datorit simetriei C6 a reelei hexagonale unghiul 300 Atunci SWNT cu =300 este cunoscut ca armchair (a, din figura 10.2) iar cel =00 este cunoscut ca zigzag (b). Pentru celelalte unghiuri ne vom referi la nanotuburi chirale (c, figura 10.2). Din teoria benzilor de energie, metoda electronilor strîns legai (tight binding, TB), formele metalice de SWNT se obin pentru condiia ca (n-m) s fie un multiplu de 3 altfel este un semiconductor. Este interesant c pentru fiecare nanotub cu o chiralitate dat exist doi enantiomeri. Diametrul dt a unui nanotub este legat de indicele de chiralitate prin ecuaia: , unde a este constanta reelei hexagonale (a planului grafenic) .=2.46 Å. Vectorii de fiind legat de lungimea legturii a C-C=1.42Å, prin 3 adic: translaie pentru celula unitar a tubului sunt definii de componentele lui , unde dR este cel mai mare divizor comun dintre 2n+m i 2m+n. Numrul de atomi per celula unitar a unui (n,m)-tub este dublul numrului de hexagoane (N) din ea: . Din procesele de sintez toate nanotuburile au capetele închise terminate cu hemisfere de fullerene. În cazul nanotubului (5,5) i (9,0) tuburile se închid cu hemisfere de C60, în timp ce nanotuburile mai mari în diametre se închid dup regula ,,pentagonului izolat": un numr optim de hexagoane la fiecare pentagon din fulleren. În general exist ase pentagoane izolate pentru fiecare set de hexagoane în aa fel încît s se minimizeze deformrile geometrice [24] 168

Rute de sintez

Diametrul mediu pentru SWCNT depinde de ruta de sintez prin care este produs. În tabela 10.2 sunt prezentate cele mai curente metode.

Tabela 10.2- Diametrele SWCNT funcie de metoda de sintez Metoda de sintez Diametrul mediu, nm (variana, ) Evaporare laser pulsat ~1.3 ±0.1 (PLV) Descrcare în arc electric ~1.4 Metoda HiPCO, ~1.0 ±0.2 descompunere în faz gazoas la presiune înalt CVD- catalitic pe suport ~1.0 ±0.1 solid (CTR-CVD) ~1.4 ±0.2 ~0.8 Referine [25,26] [27] [26, 28] [29] [30] [31]

Cel mai subire nanotub raportat în literatur a avut diametrul de aprox 0.3 nm cu toate c acestea pot fi observate în cadrul MWNT [32]. Aceste tuburi s-au atribuit la (2,2) ­armchair coninînd dou jumti de C12 capete terminale. În toate metodele de sintez nanotuburile se formeaz sub form de mnunchiuri datorit tendinei lor pronunate de aderen. Numrul de tuburi din mnunchi este variabil atingînd ca ordin de mrime 100 per mnunchi. Împachetarea lor în mnunchi este trigonal iar energia de coeziune atinge 0.2-0.3 eV/Å [33 a,b]. Metodele CVD catalitice permit creterea individual de nanotuburi cu diametre controlate de diametrul i natura catalizatorului respectiv a substratului de cretere. De notat cîteva din inconvenientele metodelor de sintez: 1. Producerea de nanotuburi nu controleaz chiralitatea; 2. Întotdeauna nanotuburile sunt închise la capete i necesit prelucrri i tratamente chimice pentru deschiderea lor.

10.3 Funcionalizare

În aceast seciune se prezint o scurt sintez referitoare la: purificare chimic i oxidativ; dizolvarea CNT în ap i în solveni organici prin modificri chimice i fizice precum i a aplicaiilor lor din domeniul chimic i biologic; separarea SWNT metalice i a SWNT semiconductoare.

10.3.1 Purificarea nanotuburilor

Toate metodele de purificare ale nanotuburilor se bazeaz pe unul sau mai muli pai: oxidarea cu gaz sau cu vapori, oxidarea chimic, centrifugarea sau filtrarea (incluzînd metode cromatografice). Oxidarea chimic are loc în acid nitric diluat (2.6 M) în reflux pentru a elimina carbonul amorf sau alte impuriti, catalizatorii. Pentru cantiti mici de material acidul poate fi îndeprtat prin filtrare sub vid urmat de splarea cu o baz diluat (solubilizarea catalizatorilor prin trecerea în sruri i a carbonului amorf în acid carboxilic). Pentru 169

cantiti mai mari de material (grame) se înlocuiete filtrarea cu decantarea i oxidarea chimic repetat, urmat de centrifugare i colectare de supernatant. Adugarea de surfactani în procesele intermediare de purificare este benefic, extracia lor fiind realizat în etapele finale prin splare cu ap DI i metanol. MWNT se purific simplu prin oxidare în aer la temperatur înalt ce nu poate fi aplicat la SWNT deoarece metalul cataliztor poate iniia distrugerea lui. Etapele de oxidare pentru MWNT sunt: 200-2300C, oxidarea materialelor carbonice amorfe (oxidare cu oxigen 20% umidificat i atmosfer de argon). În urmtoarea etap este tratamentul cu HCl pentru eliminarea metalelor i a oxizilor metalici prin trecerea lor în sruri solubile. Dup splare i uscare ciclul se reia la temperaturi de 3000C respectiv 4000C.

10.3.2 Evaluarea puritii CNT

Rezidurile de metal poate fi realizat prin analiza termogravimetric (TGA). Prin arderea în aer a mostrei SWNT la 10000C, se elimin materialul carbonic iar impuritile prezente în mostra original sunt transformate în oxizi. Puritatea materialului carbonic se estimeaz prin metode spectrometrice, TEM, SEM (caracterizare local). Pentru a obine o msurare standard a puritii, este necesar s fie identificat caracteristica care s fac diferena dintre SWNT i alte forme de carbon care sunt adesea prezeni în mostrele SWNT. Aceast tehnic se bazeaz pe spectroscopia NIR a dispersiilor de SWNT fiind comparate cu probe standard de nanotuburi obinute în arc electric. Figura 10.3 arat o ilustraie schematic a spectrului electronic al unei mostre tipice de SWNT produse în arc electric. Tranziiile interband în SWNT încep la o energie foarte mic i sunt vizibile la aproximativ 3 eV. Absorbia -plasmonic în SWNT i impurittile carbonice se extinde peste toat regiunea spectral cu benzi pîn la ~5 eV. Aceste absorbii domin spectrul i complic folosirea tranziiei interband drept o msurare absolut a puritii SWNT. Caracteristicile interbenzii încep cu tranziii electronice de energie sczut de la nivelul Fermi al SWNT metalice (M00,~0-0.5 eV). În timp aceasta s-a dovedit a fi o regiune doar informativ a spectrului. În orice caz, urmtoarele trei tranziii ale interbenzii (S11, S22 i M11) sunt accesibile spectrometrului NIR i sunt mesagere ale semnturii SWNT. S22 (7750-11750 cm-1, ~1-1.5 eV), ce este aleas ca semntur a SWNT datorit faptului c S11 (~4000-8000 cm-1) este extrem de sensibil la impuriti i dopani. Intensitatea M11 (~12,500-17,500 cm-1) este mai sczut decît S22. din cauz c probele sunt compuse dintr-un sortiment de diametre i tipuri SWNT. Integrarea intensiti peste întreaga întindere a spectrului de tranziie a interbenzii S22, (AA) este folosit pentru estimri calitattive. Dou cantiti prezint interes pentru o mostr arbitrar X: suprafaa absorbiei tranziiei interbenzii S22, AA (S,X) i absorbia total, AA (T,X); raportul lor arat o msur a puritii SWNT. Aceast metod este util, în special pentru optimizarea proceselor de purificare.

170

Interaciunea radiaiilor electromagnetice cu molecule i particule poate lua dou forme, absorbia i împrtierea. Nanotuburile de carbon sunt considerate în general c posed caracteristicile ambelor aadar, împrtierea este determinat de dimensiunile caracteristice a particulelor (d) i de lungimea de lund a radiaiei incidente () Împrtierea Rayleigh corespunde dispersiei luminii pe particule cu dimensiuni caracteristice <1/10 din lungimea de und a radiaiei (d <0.1), i are o dependen foarte puternic de lungimea de und (s()-4). Seciunea eficace de absorbie este cea mai mare în momentul în care radiaia electromagnetic este polarizat de-a lungul axei SWNT, i dac se consider c aceasta este componenta dominant, atunci dimensiunea caracteristic a SWNT corespunde cu lungimea d. Pentru un SWNT cu lungimea de d=1 µm, este de ateptat ca radiaia Rayleigh împrtiat s fie important pentru l>10 microni, ce corespunde frecvenelor <1000 cm-1. În aria spectrului a tranziiei interband (~10,000 cm-1), d, iar în aceast regiune împrtierea Mie trebuie luat în consideraie. Împrtierea Mie devine important în momentul în care dimensiunile caracteristice ale particulelor sunt mai mari decât lungimea de und a luminii (d ), i contribuie la nivelul liniei de baz, influenînd msurarea gradului de puritate a mostrei SWNT, în special în cazul mostrelor slab dispersate. Pentru a obine rezultate credibile în procedura de evaluare a puritii este esenial s folosim mostre bine dispersate. Acest lucru poate fi fcut prin folosirea concentraii de SWNT <0.01 mg/mL, sonicate cu un solvent convenabil ales pîn cînd dispersia este omogen vizual.

Figura 10.3-Ilustrare schematic a spectrului electronic a unui SWCNT obinut prin arc electric. Spectrul acoper regiunile IR îndeprtat-UV ( aprox 0.001-5.5 eV. Este detaliat o extensie a regiunii din tranziia interband S22 (adaptare dup [34])

171

10.3.3 Selectarea nanotuburilor dup lungime i diametru

Sortarea SWNT dup lungimea lor devine extrem de important pentru aplicaii. De exemplu, nanotuburile cu lungimi scurte (ex: 20-250 nm) sunt ideale pentru nano i micro electronic sau de ordinul micronilor preferate pentru aplicaii în materiale structurale i de compozite. Tehnici variate au fost folosite pentru a obine SWNT sortate în funcie de lungime. Aceasta este de obicei realizat prin tehnici cromatografice, electroforez capilar i fracionare. Au fost folosii surfactani pentru a obine soluii de SWNT dispersate. Separarea NT dup diametru i a chirilitii se realizeaz prin metodele specifice de sintez i nu prin procesare fizico chimic. Cele mai cunoscute metode sunt creterile din structuri mezoporoase cu pori controlati. Tang et al.[35] au raportat decurând c SWNT cu diametru de 0.4 nm, cresc într-un singur cristal AlPO4-5 zeolit, atingând o chirilitate preferenial- care este, (5,0) de form zigzag- opus celorlalte dou chiriliti posibile de diametru similar (3,3) armchair i (4,2) chirale. Controlul diametrului cavitilor unidimensionale ale zeoliilor mezoporoi ar putea conduce la materiale care s poat servi drept abloane pentru creterea selectiv de SWNT monodisperse. Tehnicile bazate pe CVD pe catalizatori suportai de zeolii duc la creteri selective în diametre. Combinând dezvoltrile recente din separarea SWNT metalice i semiconductoare, împreun cu cercetrile în curs pentru a produce nanotuburi cu o distribuie limitat dup diametre se va atinge condiiile minimale de aplicaii în nanoelectronic Tierea i oxidarea CNT se poate realiza dup urmtoarea metod: La 2 mg SWNT se adaug 1ml 3:1(V/V) H2SO4 i HNO3 concentrat. Mixtura este sonicat 2,4,6,8,10, 12,14 ore funcie de lungimea ce surmrete a fi obinut. Temperatura de lucru se menine la 200C prin rcire cu ghea. Dup sonicare se dilueaz cu 250 ml ap DI i se filtreaz pe un filtru de PTFE de 40 microni. Splare cu ap pîn la pH deasupra lui 5 urmat cu splare în etanol i uscare în vid.[36] Prin utilizare de acelai raport de acizi i concentraii dar cu tratament la 40-700C pentru cîteva ore cu sonicare se obin CNT scurtate i cu grupri carboxilice ataate. Acesta este cel mai simplu procedeu de a pregati CNT în vederea funcionalizrii i solubilizrii [37,38]. Prin fierberea nanotuburilor într-un amestec de H2SO4/HNO3 a rezultat o soluie limpede, incolor care la evaporarea solventului i eliminarea excesului de acid, rezult un solid alb ce conine nanotuburi funionalizate. Neutralizarea soluiei acide de ctre o baz rezult un precipitat solid de culoare maro ce conine nanotuburi.

10.3.4 Separarea CNT dup proprietile lor metalice sau semiconductoare

Separarea SWNT în fraciuni metalice i semiconductoare ar trebui s simplifice i s permit extinderea de aplicaii spre dispozitivele nanoelectronice (tranzistori i circuite logice), de emisie în câmp, nanosenzori, actuators, materiale pentru ecrane electromagnetice. Metodele de sintez genereaz mixturi sub form de mnunchiuri de SWNT metalice i semiconductoare într-un raport de 1:2 , face separarea lor s fie dificil. Prin explorarea interaciunilor fizico-chimice complexe ale aminelor dintr-un surfactant (octadecilamine- ODA, CH3(CH2)17NH2) cu nanotuburi de carbon conduce în etapele de 172

purificre la separarea formelor metalice de cele semiconductoare. Interaciunile slabe donor-acceptor dintre grupul de amine al ODA i SWNT semiconductoare par s acioneze împreun ca un zwiterion SWNT-COO-/+NH3-(CH2)17CH3. Spre deosebire de zwiterion care sunt inui împreun într-un solvent cu constant dielectric mic, complexele donor-avcceptor surfactant-amin-nanotub sunt stabilizate prin grupul alifatic al ODA spre suprafaa grafenei a SWNT. Studii spectroscopice i termogravimetrice recente indic faptul c aceste amine interacioneaz mai puternic cu SWNT semiconductoare decît cu cele metalice. Acest fapt reduce tendina SWNT semiconductor s se aglomereze în timp ce concentraia este crescut prin evaporarea parial a solventului, lsând precipitatul s fie populat în mare parte de nanotuburi metalice. Prin spectrometrie Raman analiza modurilor de vibraie RBM (radial breathing modes) se pune în eviden c în supernatant sunt SWNT semiconductoare, iar în fracia precipitat este bogat cu SWNT metalice. Spectrometria Raman de rezonan arat c un factor de îmbogire de ~90% în SWNT semiconductoare se poate atinge în supernatant. Separri cu o eficien mai înalt (97% i chiar mai mult) au fost observate pentru SWNT cu diametre de1 nm. Un alt experiment asupra separrii SWNT metalice/semiconductoare: suspensie apoas a SWNT în surfactant de Triton X-100 i brominare, urmat de o centrifugare la 24000 g pentru 12 ore. În acest caz supernatantul conine nanotuburi semiconductoare iar sedimentele nanotuburi metalice. De notat c separarea se bazeaz pe faptul ca nanotuburile individuale în suspensie cu surfactantul apos rmîn ,,suspendate" pe parcursul centrifugrii la factori g mari. Explicaia pentru acest rezultat const în formarea de structuri micelare surfactant-nanotub ce exclud apa spre capetele hidrofobe. Dou efecte sunt concurente la separare: (1) bromul formeaz un transfer complex de sarcin cu nanotuburile metalice i (2) stabilizarea surfactantului Triton X-100 este slab pentru nanotuburi metalice (ex., surfactantul are o toleran limitat a puterii ionice, care, odat depit, îi pierd activitatea). Aceste efecte sugereaz c separarea se datoreaz unei destabilizri a suspensiei cu nanotuburi metalice- surfactant, rezultînd din afinitatea lor selectiv pentru brom. A fost artat c un lan de ADN (ss-ADN) se leag puternic de SWNT prin rearanjare- i astfel produce exfolierea i solubilizarea SWNT în ap prin desfacerea din mnunchiuri. Mai mult de atât, gruprile de fosfat aduc unui hibrid ADN-SWNT o densitate de sarcin negativ pe suprafaa nanotubului de carbon, distribuie care ar trebui s fie o funcie de secvena ADN . Bazat pe aceasta, complexul ADN/SWNT metalic este predispus s aib o suprafa mai mic de înrcare decât complexul ADN/SWNT semiconductor. O separare dielectroforetica a SWNT metalice de SWNT semiconductoare a fost de asemenea raportat. SWNT solubilizate cu dodecil sulfat de sodiu (SSD) în D2O în concentraii de 10mg/L au fost supuse la dielectroforez la o frecven de 10MHz, i un câmp de aproximativ 2 x 103 V/cm. Datorit diferenelor dintre constantele dielectrice relative ale formei metalice versus semiconductoare cu privire la solvent, nanotuburile metalice au fost ataate ctre zona microelectrodului, lsând nanotuburile semiconductoare în solvent. Spectroscopia raman de rezonan a estimat un factor de îmbogire de 80% al fraciunii SWNT metalice depozitate. Lucrri mai recente indic faptul c SWNT metalice sufer transferuri prefereniale de electroni cu sri de 173

diazoniu în soluii apoase, fa de SWNT semiconductoare. Aceast aparent selectivitate pare s fie indus de mobilitatea mare a electronilor (pentru SWNT metalice) din zona nivelului Fermi. (O discuie de detaliu asupra modalitilor de separare i selectare a dup tipul de nanotub se gsete în seria MRS-Bulletin aprilie 2004)

10.3.5 Ataarea de grupe funcionale

Acidul azotic concentrat i amestecuri de H2SO4 cu HNO3, H2O2 sau KMnO4 au fost folosite pentru a funcionaliza ataînd grupri acidice la nanotuburi. Prima data, se ataeaz grupe acidice la capetele deschise ale SWNT-ului (figura 10.4). Principalele funciuni acidice cuprinde gruprile ­COOH, -C=O i ­OH i sunt în proporie de 4:2:1. Concentraia la suprafa a gruprilor acidice din nanotuburile tratate cu diferii oxidani variaz între 2x1020 pana la 10x1020 situri/g sau echivalent în rapoarte molare 5.5% - 7.7% (­COOH), ~6% (-C=O), ~5% (-OH) pentru SWNT-urile scurte sau ~4% pentru SWNT-urile lungi. Metoda simpl de titrare acido-bazic arat ca trei probe diferite de SWNT purificat au cam 1-3% situsuri acidice i 1-2% au grupe funcionale ­ COOH. Concentratia grupelor functionale este dependent de timp. Tratarea SWNT-urilor cu H2SO4 concentrat ce conine persulfat de amoniu, (NH4)4S2O7 i pentaoxid de fosfor, urmat de tratare cu acid sulfuric i permanganat de potasiu va rezulta un material ce conine C/O/H în proporie atomic de 2.7:1.0:1.2. Ozonoliza nanotuburile creaz centrii reactivi ce pot fi folosii în alte reacii de ataare de funciuni acidice sau bazice. SWNT-urile funcionalizate, purificate i scurtate pot fi dispersate în ap prin sonicare ce prezint o stabilitate rezonabil ( aproximativ 1 lun). Solubilitatea i stabilitatea soluiei este dependent de pH

Figura 10.4- Tratarea CNT-urilor cu soluii de permanganat de potasiu i acid sulfuric scurteaz nanotuburile i induce formarea de grupri funcionale pe suprfaa lor

Gruprile carboxilice de la extremitile SWNT-urilor pot reaciona chimic în soluii organice formînd inele sau compui ce pot fi utilizai în procese de ataare pentru biomolecule. Cel mai important aspect pentru funcionalizarea ionic sau covalent este posibilitatea exploatrii gruprilor carboxilice de la capetele tubului sau a pereilor. 174

Aminele sunt reactivi care au atras cea mai mare atenie. Sunt trei tipuri de reacii a aminelor cu gruprile carboxilice: amidarea; interacia acid-baz; condensarea. De altfel, aminele pot fi adsorbite fizic în pereii nanotuburilor. În acest sens exist o literatur bogat asupra proceselor de solubilizare, funcionalizare, amidare ce poate fi consultat pentru o reacie specific [39].

175

10.4 Referine

1. Kroto H. W, Heath J. R., O'Brien S. C,. Curl R. F and. Smalley R. E. C60 Buckminsterfullerene. Nature 318: 162 - 163(1985) 2. Iijima, Sumio. Helical microtubules of graphitic carbon. Nature 354: 56 - 58(1991) 3 Iijama, Sumio Single-shell carbon nanotubes of 1-nm diameter, Nature 363: 603 ­ 605 (1993). 4. Bethune, D. S.; et al. Cobalt-catalysed growth of carbon nanotubes with single-atomiclayer walls. Nature 363: 605­607. (17 June 1993). 5 a.Guo, Ting. Self-Assembly of Tubular Fullerenes,J. Phys. Chem. 99: 10694 ­ 10697 (1995 b.Guo, Ting Catalytic growth of single-walled nanotubes by laser vaporization, Chem. Phys. Lett. 243: 49 ­ 54 (1995). c.Flahaut, E.; Bacsa R, Peigney A, Laurent C. Gram-Scale CCVD Synthesis of Double-Walled Carbon Nanotubes. Chemical Communications 12: 1442 ­ 1443 (2003). 6 M. I. Ionescu , I. Stamatin F. Nastase C. Nastase C. Serban, High-quality carbon nanotubes production using plasma-chemistry deposition method, Molecular Crystals and Liquid Crystals, vol 415, 133-140, (2004) 7 a.Saito R G Dresselhaus & M S Dresselhaus, Physical Properties of Carbon Nanotubes, CRC press, ISBN 978-1-86094-093-4, (1998) b.M.S. Dresselhaus, G. Dresselhaus, and P.Avouris, eds., Carbon Nanotubes: Synthesis,Structure, Properties and Applications,Springer-Verlag, Berlin, (2001). 8 Stamatin I., Matei C., Buliga E., The closing of the Carbon structures sheets in fullerenes C60 Rom. Rep. Phys., 48, N78, p599, (1996) 9 Tans S.J., M.H. Devoret, Dai H.J., Thess A., Smalley R.E., Geerligs L.J., Dekker C., Nature 386 474­477. (1997) 10 J.W.G. Wildoer, L.C. Venema, A.G. Rinzler, R.E. Smalley, C. Dekker, Nature 391 59­62. (1998) 11 Odom T.W., Huang J.L., Kim P., Lieber C.M., Nature 391 62­64. (1998) 12 Tans S.J., Verschueren A.R.M., Dekker C., Nature 393 49­52 (1998) 13 Chen J., Hamon M.A., Hu H., Chen Y.S., Rao A.M., Eklund P.C., Haddon R.C., Science 282 95­98, (1998) 14 Kong J., Franklin N.R., Zhou C.W., Chapline M.G., Peng S., Cho K.J., H.J. Dai, Science 287 622­625. (2000) 15 Duesberg G.S., Blau W.J., Byrne H.J., Muster J., Burghard M., Roth S., Chem. Phys. Lett. 310 8­14. (1999) 16 Krstic V., Roth S., Burghard M., Phys. Rev. B 62 R16353­R16355. (2000) 17 Kong J., E Yenilmez., Tombler T.W., Kim W., Dai H.J., Laughlin R.B., Liu L., Jayanthi C.S., Wu S.Y., Phys. Rev. Lett. 87 Art. no. 106801. (2001) 176

18 Derycke V, Martel R., Appenzeller J., Avouris P., Nano Lett. 1 453­456. (2001) 19 Bachtold A., Hadley P., Nakanishi T., Dekker C., Science 294 1317­1320. (2001) 20 Postma H.W.C., Teepen T., Yao Z., Grifoni M., Dekker C., Science 293 76­79. (2001) 21 M.J. O'Connell, et al. Science 297 593­596. (2002) 22 M. Freitag, V. Perebeinos, J. Chen, A. Stein, J.C. Tsang, J.A. Misewich, R. Martel, P. Avouris, Nano Lett. 4 1063 -1066. (2004) 23 Vitali L., Burghard M., Schneider M.A., Liu L., Wu S.Y., Jayanthi C.S., Kern K., Phys. Rev. Lett. 93, Art. no.136103. (2004) 24 Harris P.J.F., Carbon Nanotubes and Related Structures, Cambridge Univ. Press, (1999). 25 Kukovecz A., Pichler T., Pfeiffer R., Kramberger C., Kuzmany H., Phys. Chem. Chem. Phys. 5 582­587. (2003) 26 Hulman M., Plank W., H. Kuzmany, Phys. Rev. B 6308, Art. no. 081406(2001 27 Journet C., Maser W.K., Bernier P., Loiseau A., De la Chapelle M.L., Lefrant S., P. Deniard, R. Lee, J.E. Fischer, Nature 388 756­758. (1997) 28 A. Kukovecz, C. Kramberger, V. Georgakilas, M. Prato, H. Kuzmany, Eur. Phys. J. B 28 223­230. (2002) 29 An L., Owens J.M., McNeil L.E., Liu J., J. Am. Chem. Soc. 124 13688­13689,(2002) 30 Choi H.C., Kim W., Wang D.W., Dai H.J. J. Phys. Chem. B 106 12361­12365,(2002) 31 Bachilo S.M., et all, J. Am. Chem. Soc. 125,11186­ 11187 (2003) 32 Zhao X., et all, Phys. Rev. Lett. 92 Art. no. 125502. (2004) 33 a. Monthioux M., et all, Carbon 39 1251­1272. (2001) b. Girifalco L.A., Hodak M.,Lee R.S., Phys. Rev. B 62, 13104­13110. (2000) 34 Itkis M.E., et all NanoLett. 2 ,p. 155. (2002) 35 Tang Y.H., Lee C.S., Lee S.T., Appl. Phys. Lett. 73, 3902-3904 (1998) 36 Marshall Matthew W., Popa-Nita Simina, Shapter Joseph G.,Carbon 44 1137­1141, (2006) 37 Hamon M. A., et all, Appl. Phys. A 74, 333 (2002). 38 .a Sun Y.P., Fu K., Lin Y. Huang W., Acc. Chem. Res. 35, 1096 (2002); b. Niyogi S.,et all, Acc. Chem. Res. 35, 1105 (2002); c. Hirsch A., Angew. Chem.Int. Ed. 41, 1853 (2002); d. Banerjee S, Kahn C, Wong S., Chem.Eur. J. 9, 1898 (2003); e. Tasis D., Tagmatarchis N., Georgakilas V. Prato M.,Chem. Eur. J. 9, 4000 (2003); 39 Naotoshi Nakashima, Int.J. of Nanoscience vol. 4, no. 1 119­137, (2005)

177

178

11 Nanofire, nanosenzori

Detecia speciilor chimice i biologice constituie placa turnant din multe arii din sntate i tiinele vieii acoperind diagnoza bolilor, descoperirea de noi medicamente sau de noi droguri. Dezvoltarea de noi dispozitive senzoriale pentru analize rapide a acestor specii la limita de sub picomoli va avea un impact asupra societii în multiple moduri. Dispozitive ultrasensibile dezvoltate pe nanofire va crea o nou clas de nanosenzori capabili s detecteze proteine, ADN, molecule specifice designului de noi medicamente. Cheia central în recunoaterea molecular este transducia semnalului asociat cu recunoaterea selectiva speciilor de interes. Nanostructuri cum sunt nanofirele [1-7] i nanocristale [8-12] ofer posibilitatea unic de a construi dispozitive nanometrice de senzare. Diametrele lor sunt comparabile cu dimensiunile speciilor biologice i chimice, prin urmare, intuitiv, reprezint un promitor mijloc de transducie de semnal i interfaare cu instrumentele macroscopice. Nanofirele anorganice i nanocristalele prezint proprieti electrice [2-5, 13-28] i optice [8-12] unice ce pot fi exploatate pentru senzare. Dependena de dimensiunea nanocristalelor a proprietilor de emisie i a culorii deschide mari oportuniti de etichetare respectiv marcare i detecie optic a speciilor biologice prin comparaie cu coloranii i markerii chimici fluoresceni utilizai curent [812]. Proprietile de comutaie electronic a nanofirelor semiconductoare furnizeaz modalitatea de senzare i indexare electric cu citire direct. Aceasta devine extrem de atractiv pentru multiple aplicaii [29-37]. Semnalele electrice de la un asemenea tip de nanodispozitiv pot fi direct rutate spre exterior iar acesta pot fi direct integrat în sisteme miniaturizate. Detecia de semnale electrice direct de la speciile moleculare reduce timpul de indexare cu markeri chimici. În paragrafele urmtoare se vor prezenta cîteva din aplicaiile dispozitivelor pe baz de nanofire care se pare vor revoluiona, prin proprietile lor remarcabile, detecia în biologie i medicin.

11.1 Senzori FET cu nanofire

Principiile de construcie ale FET-urilor prezentate în capitolul 6 se transpun direct în conceperea de senzori pe baz de nanofire, NFET. Într-un FET standard , (figura 6.1) siliciul dopat, p-Si, este conectat la surs i dren prin dou contacte metalice prin care trece un curent electric sub un potenial dat. Conductana semiconductorului este modificat de al treilea electrod (poarta) cuplat capacitiv printr-un strat dielectric. În cazul p-Si dac se aplic pe poart un potenial pozitiv are loc o diminuare a sarcinilor iar conductana se reduce. Invers dac se aplic un potenial negativ atunci are loc o acumulare de sarcini i conductana crete. Dependena conductanei de tensiunea aplicat pe poart face din FET un candidat firesc pentru senzarea pe baz electric deoarece cîmpul electric va depinde de speciile de sarcini electrice ce se pot ataa pe nanofir. 179

Exist o multitudine de tipuri de nanofire crescute pe substratul de siliciu. Utilizînd diferite metode de evaporare termic, procese de depunere chimic din vapori (CVD) sau construcii pe abloane cu fascicule moleculare. Unul din cele mai studiate exemple este nanofirul de Si ce poate fi preparat ca o structur cristalin singular cu diametre de 23nm [1-4,42,43]. Ambele tipuri de Si dopat p sau n (n-Si) prezint performanele i caracteristicile comparabile cu cele atinse de industria electronic în privina stabilitii i reproductibilitii [24]. Caracteristicile electronice ale nanofirelor de Si sunt controlate cu precizie în timpul procesului de cretere ceea ce este un avantaj raportat la nanotuburile de carbon. Nanofirele de Si prezint caracteristici de comutaie de înalt performan ceea ce este un factor decisiv care afecteaz sensibilitatea. Nanofirele de Si au depit inconvenientele de limitare a sensibilitii pentru tranzistorii FET obinuti prin tehnologia planar (vezi capitolul 6). FET urile cu nanofire de Si sunt structuri unidimensionale ce faciliteaz ataarea pe suprafa de specii de biomolecule i markeri de recunoatere molecular. Acumularea sau sracirea de sarcini are loc în ,,volumul" nanostructurii fa de dispozitivul planar care conducea la modificarea regiunii superficiale [29]. În acest context sensibilitatea de a detecta o singur molecul ar putea deveni posibil. În figura 11.1 este prezentat metoda de trecere de la FET construit pe o structur planar de Si la un NFET unde nnanofirele de Si sunt conectate între surs i dren. Cele dou tipuri de NFET prezint fiecare avantaje i dezavantaje. Structura din figura 11.1b permite ataarea direct de grupe funcionale sau molecule. Tipul (c) dei are caracteristici superioare nu permite o ataare direct, în particular grupele funcionale sunt în contact cu electrodul de Au al porii. În figura 11.2 este prezentat principiul de construcie a unui NFET ce are nanofirul de Si (SiNW) funcionalizat i expus direct la o soluie ce conine analitul. Rspunsul este msurat prin variaia conductanei cu timpul. Ataarea de molecule receptoare (figura 11.2b) se realizeaz direct pe stratul oxidic al nanofirului nefiind necesar alte modificri chimice. Cînd dispozitivul este expus direct cu suprafaa la o soluie ce conine macromolecule cum ar fi proteine ce au o sarcin pozitiv net atunci legarea va conduce la descreterea în conductan pentru un nanofir din Si dopat p. În figura 11.3 este descris principiul de funcionare a unui pH-NFET i rspunsul în conductan. Pentru gruprile naturale de silanol, Si-OH, (figura 11.3-1) rspunsul în conductan este continu cresctor funcie de echilibrul protonare/ deprotonare care schimb starea suprafeei prin cumularea sau sarcirea de sarcin. Prin funcionalizarea cu grupri amino (de exemplu 3-aminopropiltrietiloxisilan) modificarea de sarcin se realizeaz în trepte funcie de valoarea pH ului iar rspunsul în timp este definit cu mare precizie. De notat c gruprile amino i silanol funcioneaz ca receptori pentru reaciile de protonare-deprotonare care schimb starea de sarcin a suprafeei nanofirului. Rezultatele i observaiile anterioare confirm pe deplin astzi realizrile cu nanofire de Si [29-46].

180

Figura 11.1-Trecerea FET de la tehnologia planar (a) unde potenialul de pe poarta G moduleaz sarcina superficial dintre surs i dren , respectiv conductana la tehnologia pe nanofire (b,c). În (b) este descris formarea unui nanofir de Si prin corodare în plasm sau cretere pe structura Si-SiO2 între contactele sursdren. În (c) este descris conectarea unui nanofir de Si construit pe un ablon de Ge iar poarta este un electrod de Au depus pe un film dielectric cu permitivitate înalt. Acest tip de structur este proiectat pe un strat complex de poart format din 2 oxizi SiO2-ZrO2- dielectric high k. Nanofirul Ge-Si formeaz o structur de benzi de tipul vale cuantic (e) , BV-banda de valen, BC-banda de conducie, EF ­ nivelul Fermi.

Figura 11.2- Principiul de construcie a unui NFET (a) pe structura din figura 11.1b. Fluidul cu analit este condus spre nanofirul de Si (SiNW) printr-un microcanal. Ataarea de grupe funcionale (b) conduce la modificarea acumulrilor de sarcin i în consecin conductana se modific în timp (c).

181

Figura 11.3-Schem de realizare a unui NFET funcionalizat cu grupe silanol (a) respectiv amino (b) pentru msurarea de pH.Rspunsul ipotetic în conductan pentru silanol(1) respectiv amino (2), graficul (d) corespunde rspunsului în timp la diferite valori de pH.

Figura 11.4- Formarea de NFET din mnunchiuri de nanotuburi prin evaporarea celor metalice i selectarea SWNT semiconductoare

În cazul nanotuburilor de carbon trebuie abordata o alt metod. Proprietatea lor de conducie unidimensional respectiv dificultatea de a selecta formele metalice de cele semiconductoare impune o metod oarecum diferit. În figura 11.4 este prezentat o metod de formare a unui FET din mnunchiuri de SWCNT unde formele metalice sunt evaporate prin aplicarea unei tensiuni înalte între surs i dren. În etapa a doua nanotuburile 182

sunt funionalizate cu grupri carboxilice sau amidice prin procedeele schiate în seciunea 10 pe care se pot ataa receptorii. Figura 11.4 arat c SWNT pot fi folosite ca simple nanofire prin care se poate senza un semnal electric prin simpl ataare de molecule sau prin aplicarea unui potenial pe poart se transform într-un FET. Fie c este un nanofir de Si sau SWCNT senzarea de macromolecule biologice cum ar fi proteine sau acizi nucleici care în soluii apoase sunt încrcate electric se poate realiza prin ataarea la suprafaa lor de receptori convenabili alei. Primul exemplu de cuplul de detecie a proteinelor este molecula de biotin care are o selectivitate mare la streptavidin. Cînd o soluie de streptavidin este în contact cu nanofirul funcionalizat cu biotin interacia lor modific conductana. Acelai procedeu se aplic i la indexarea ADN ului prin ataarea de secvene complementare pe nanofir [33-48]. Extinderea de atari de diferii receptori i crearea de arii cu anticorpi se pot genera platforme de detecie de virui, droguri.[49-67].

11.2 Limitele de detecie i rspuns pentru nanobiosenzori

Din paragraful anterior s-a constatat efortul cercetrilor de a construi nanosenzori ultrasenzitivi pentru detecia moleculelor biochimice, virusuri droguri, ADN, la concentraii mici de analit i în flux rapid. Structurile angajate în designul lor sunt planare (FET) fire cilindrice sau nanosfere. Din considerente electrostatice este cunoscut c structurile cilindrice sunt mai senzitive la adsorbia de sarcini ( adic ADN, proteine, etc) în raport cu cele planare de tipul ISFET sau CHEMFET. Din punct devedere electrostatic ISFET este o structur 1D, firele sunt 2D iar sferele 3D. Rspunsul unui nanosenzor din partea de detecie este mai mult cinetic ,cînd este imersat în soluie el msoar timpul de captur a unui anumit numr de analii ( timpul de atingere a valorii maxime, tS). Altfel interpretat, dac exist pe nanosenzor NS receptori per unitate de arie atunci tS este timpul de saturaie pentru o reacie analt-receptor dat. Acest timp este deasemeni dependent de dimensionalitatea senzorului. Intuitiv se poate constata c tS,2D tS,1D pentru o concentraie dat de analit, 0. Se pune întrebarea care sunt limitele de detecie pentru un timp rezonabil de rspuns. Aceasta se poate estima din considerente de cinetic respectiv de difuzie a analitului. Se consider un senzor izolat imersat într-un electrolit cu analit staionar la t=0. Suprafaa senzorului este funcionalizat cu receptori pentru moleculele int. Viteza de conjugare dintre analii i receptori este descris de: 11.1 unde N este densitatea de receptori conjugai, N0 este densitatea de receptori de pe suprafaa senzorului, kF, kR, constantele de captur i de disociere, S, concentraia de analii la suprafaa senzorului care se determin prin combinare cu ecuaia de difuzie: 11.2 cu D coeficientul de difuzie a analitului din soluie. Fluxul de molecule de analit spre suprafaa senzorului de arie AD: 183

11.3 unde I este fluxul incident de analit pe o arie AD. Rspunsul în timp este dat prin rezolvarea ecuaiilor 11.1 i 2 unde este necesar cunoaterea ratelor de captur respectiv de detaare a analitului la receptori. Luînd în considerare dinamica capturii de biomolecule dezvoltate în [65] cu raportul ratelor de regul kF/kR~105 [66] i pentru concentraii de N0~104 /m2.[67] ecuaia cineticii 11.1 se reduce la: 11.4 iar fluxul în condiii staionare: 11.5 , unde densitatea fluxului de analit,CD,SS este capacitana de difuzie echivalent pentru cazul cînd concentraia 0 a analitului rmîne constant la o distan W de suprafaa senzorului (tabela 11.1). Cum fluxul de analit trebuie sa fie echilibrat de viteza de ataare analit-receptor avem condiia j=dN/dt. Rezolvînd ecuaiile 11.4-5 se obine: ecuaie ce arat o dependen liniar a concentraiei analitului cu timpul i prin urmare un rspuns liniar al senzorului în condiii staionare. Cu aceste relaii se poate estima rspunsul tranzient al unui nanosenzor prin perturbarea strii staionare dup cum urmeaz: cu cît reacia de ataare a analitului progreseaz concentraia sa se diminueaz în apropierea suprafeei senzorului datorit capturii; distana de srcire este unde n este dimensionalitatea senzorului (tabe2 lul 11.1). Se poate defini un coeficient de difuzie echivalent cu capacitana, CD(t) ca funcie de W(t) i inserîndu-l direct în 11.6 se obine: 11.7 i cu notaiile din tabela 11.1 conduce la timpul de saturaie tS de a care pentru captura NS de molecule. Pentru fiecare tip de nanosenzor se obine o relaie de scalare unic: ~ 11.8 unde MD i kD sunt constante dependente de dimensionalitatea senzorului (tabela 11.1) Relaiile de mai sus conduc imediat la un numr de concluzii importante pentru estimarea concentraiei minime detectabile pentru un senzor planar, cilindric respectiv sferic, o problem tipic a deteciei de ADN. S presupunem c timpul maxim de saturaie este de 100s iar NS= 10 m-2 ce corespunde corespunde la dou conjugri per 1 micron lungime, 30nm diametru de nanofir. Considerînd coeficienii de difuzie pentru biomolecule D de ordinul 10-10 m2/s se poate reprezenta un grafic simplu pentru cele trei tipuri de senzori (figura 11.5).

,

11.6

184

Figura 11.5-Estimarea concentraiei limit (0) de detecie pentru un timp prestabilit de saturare (tS). Pentru un timp de detec,ie prestabilit la 100s structurile cilindrice (nanofirele) respectiv sferice pot detecta concentraii de ordinul pmol în timp ce ISFET ca structur planar are limita de detecie de ordinul nanomolar. Tabela 11. 1- Geometrii 1D, 2D i 3D de nanosenzori i caracteristicile lor pentru regim staionar de detecie a analiilor Tip de model W AD, CD,SS CD(t) MD kD senzor ISFET 1 1/2 2 planar 2 1D

Nanosenzor cilindric 2D Nanosenzor sferic 3D

2

2

2 4

1

4

4

4 6

1

a0-raza senzorului; distana W a analitului de concentraie constant raportat la suprafaa senzorului

Rezultatele obinute sunt în concordan cu o serie de refeine i articole de sintez []

185

11.3 Referine

1. Morales, A. M., and Lieber, C. M., Science 279, 208(1998) 2. Hu, J., et al., Acc. Chem. Res. 32 (5), 435(1999) 3. Lieber, C. M., MRS Bull. 28 (7), 486(2003) 4. Cui, Y., et al., In: Nanowires and Nanobelts ­ Materials, Properties and Devices, Wang, Z. L., (ed.), Kluwer Academic Publishers (2003), 3 5. Samuelson, L., Materials Today 6 (10), 22 (2003) 6. Xia, Y., et al., Adv. Mater. 15 (5), 353 (2003) 7. Wang, Z. L., Materials Today 7 (6), 26 (2004) 8. Niemeyer, C. M., Angew. Chem. Intl. Ed. 40 (22), 4128 (2001) 9. Chan, W. C. W., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 13 (1), 40 (2002) 10. West, J. L., and Halas, N. J., Annu. Rev. Biomed. Eng. 5, 285 (2003) 11. Alivisatos, P., Nat. Biotechnol. 22, 47 (2004) 12. Gould, P., Materials Today 7 (2), 36 (2004) 13. Cui, Y., et al., J. Phys. Chem. B 104 (22), 5213 (2000) 14. Duan, Y., et al., Nature 409, 66 (2001) 15. Cui, Y., and Lieber, C. M., Science 291, 851 (2001) 16. Huang, Y., et al., Science 294, 1313 (2001) 17. Gudiksen, M. S., et al., Nature 415, 617 (2002) 18. Huang, Y., et al., Nano Lett. 2 (2), 101 (2002) 19. Lauhon, L. J., et al., Nature 420, 57 (2002) 20. Cui, Y., et al., Nano Lett3 (2), 149. (2003) 21. McAlpine, M. C., et al., Nano Lett3 (11), 1531.(2003) 22. Zhong, Z., et al., Science 302, 1377 (2003) 23. Panev, N., et al., Appl. Phys. Lett. 83 (11), 2238 (2003) 24. Jin, S., et al., Nano Lett.) 4 (5), 915 (2004 25. Greytak, A. B., et al., Appl. Phys. Lett. 84 (21), 4176 (2004) 26. Wu, Y., et al., Nature 430, 61 (2004) 27. Zheng, G., et al., Adv. Mater. 16 (21), 1890 (2004) 28. Bjork, M. T., et al., Nano Lett. 4 (9), 1621 (2004) 29. Cui, Y., et al., Science 293, 1289 (2001) 30. Comini, E., et al., Appl. Phys. Lett. 81 (10), 1869 (2002) 31. Zhou, H. T., et al., Chem. Phys. Lett. 369 (1-2), 220 (2003) 32. Li, C., et al., Appl. Phys. Lett. 82 (10), 1613 (2003) 33. Hahm, J., and Lieber, C. M., Nano Lett. 4 (1), 51 (2004) 34. Wang, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3208 (2005) 35. Patolsky, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 14017 (2004) 36. Kolmakov, A. and Moskovits, M., Annu. Rev. Mater. Res. 34, 151 (2004) 37. Wan, Q., et al., Appl. Phys. Lett. 84 (18), 3654 (2004) 38. Sze, S. M., Physics of Semicondutor Devices, Wiley, New York), 431(1981 186

39. Bergveld, P., IEEE Trans. Biomed. Eng. BME-19, 342 (1972) 40. Blackburn, G. F., In: Biosensors: Fundamentals and Applications, Turner, A. P. F., et al. (eds.), Oxford University Press, (1987), 41. Hafeman, D. G., et al., Science 240, 1182 (1988) 42. Cui, Y., et al., Appl. Phys. Lett. 78 (15), 2214 (2001) 43. Wu, Y., et al., Nano Lett. 4 (3), 433 (2004) 44. Iler, R. K., The chemistry of silica, John Wiley & Sons, New York (1979) 45. Bartlett, P. N., In: Handbook of Chemical and Biological Sensors, Taylor, R. F., Schultz, J. S. (eds.), IOP Publishing, Philadelphia 139 (1996), 46. Bolt, G. H., J. Phys.Chem. 61 (9), 1166 (1957) 47. Bayer, E. A., and Wilchek, M., Methods Enzymol. 184, 49 (1990) 48. Nielsen, P. E., et al., Science 254, 1497 (1991) 49. Jensen, K. K., et al., Biochem. 36 (16), 5072 (1997) 50. He, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 122 (38), 9071 (2000) 51. Hook, F., et al., Langmuir 17 (26), 8305 (2001) 52. Grosios, K., Traxler, P., Drugs Future 28, 679 (2003) 53. Strausberg, R. L, Schreiber, S. L., Science 300, 294 (2003) 54. Stockwell, B. R., Trends Biotechnol. 18 (11), 449 (2000) 55. Becker, J., Nat. Biotechnol. 22, 15 (2004) 56. Blume-Jensen, P., and Hunter, T., Nature 411, 355 (2001) 57. Stadler, K., et al., Nat. Rev. Microbiol. 1, 209 (2003) 58. Atlas, R. M., Nat. Rev. Microbiol. 1, 70 (2003) 59. Niiler, E., Nat. Biotechnol. 20, 21(2002) 60. Weiss, S., Nat. Struct. Biol 7, 72. (2000)4 61. Zhuang, X., Rief, M., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 (1), 88 (2003) 62. Huang, Y., et al., Science 291, 630 (2001) 63. Whang, D., et al., Nano Lett3 (9), 1255 (2003) 64. Whang, D., et al., Jpn. J. Appl. Phys. 43 (7B), 4465(2004) 65. Berg H. C., Random Walks in Biology Princeton University Press,NJ,(1993). 66. Lohse J., Dahl O. Nielsen P. E, Proc. Natl. Acad. Sci (PNAS). 96,11804 (1999) 67.Fritz J, E. B. Cooper, Gaudet S,. Sorger P. K, Manalis S. R., PNAS.. 99, 14142 (2002). 68.Gruner G.,Anal Bioanal Chem 384: 322­335 (2006)

187

Information

Microsoft Word - Nanotech_Biosensori_A4_final_2.docx

193 pages

Find more like this

Report File (DMCA)

Our content is added by our users. We aim to remove reported files within 1 working day. Please use this link to notify us:

Report this file as copyright or inappropriate

448439