x

Read Microsoft Word - Techniki_separacyjne_roz.docx text version

Publikacja wspólfinansowana przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spolecznego

TECHNIKI SEPARACYJNE

Piotr Stepnowski Elbieta Synak Beata Szafranek

1

Wydawnictwo Uniwersytetu Gdaskiego

Zbigniew Kaczyski

Publikacja wspólfinansowana przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spolecznego

© Copyright by: Piotr Stepnowski, Elbieta Synak, Beata Szafranek, Zbigniew Kaczyski

Sklad komputerowy: Zbigniew Kaczyski & Piotr Stepnowski Okladk i stron tytulow zaprojektowali: Anna Bialk-Bieliska, Jolanta Kumirska, Piotr Stepnowski

Recenzent: Prof. dr hab. in. Waldemar Wardencki

ISBN 978-83-7326-712-1

All rights reserved

Uniwersytet Gdaski Wydzial Chemii 80-952 Gdask, ul. Sobieskiego 18/19

2

Techniki separacyjne

Piotr Stepnowski Elbieta Synak Beata Szafranek Zbigniew Kaczyski

Uniwersytet Gdaski, Gdask 2010

Spis treci

Od autorów .................................................................................................................................. 9 I. Wstp do technik separacyjnych ................................................................................................. 9 1. Wstp ................................................................................................................................... 9 2. Teoria separacji ....................................................................................................................12 2.1. Termodynamiczny opis separacji .....................................................................................13 2.2. Adsorpcja i podzial .........................................................................................................17 2.3. Oddzialywania midzyczsteczkowe................................................................................21 2.3.1. Oddzialywania dyspersyjne ......................................................................................21 2.3.2. Oddzialywania polarne.............................................................................................22 2.3.3. Oddzialywanie jonowe .............................................................................................23 2.4. Lipofilowo w opisie potencjalu oddzialywa molekularnych ..........................................24 3. Literatura.................................................................................................................................29 II. Ekstrakcja ................................................................................................................................30 1. Wstp ..................................................................................................................................30 2. Podzial technik ekstrakcyjnych ..............................................................................................31 3. Ekstrakcja próbek gazowych..................................................................................................35 3.1. Ekstrakcja w ukladzie gaz ­ ciecz .....................................................................................35 3.1.1. Ekstrakcja membranowa przez blony pólprzepuszczalne ............................................35 3.2. Ekstrakcja w ukladzie gaz ­ cialo stale .............................................................................37 3.2.1. Ekstrakcja gazów przez membrany porowate ............................................................39 3.2.2. Mikroekstrakcja do fazy stalej ..................................................................................42 4. Ekstrakcja próbek cieklych ....................................................................................................50 4.1. Ekstrakcja w ukladzie ciecz ­ gaz .....................................................................................50 4.1.1. Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej .......................................................50 4.1.2. Ekstrakcja strumieniem gazu przeplywajcym przez próbk .......................................53 4.2. Ekstrakcja w ukladzie ciecz-ciecz .....................................................................................56 4.2.1. Ekstrakcja zwizków organicznych ............................................................................59 4.2.2. Ekstrakcja zwizków nieorganicznych........................................................................61 4.2.2.1. Ekstrakcja kompleksów chelatowych ..................................................................61 4.2.2.2. Ekstrakcja jonów metali w postaci kompleksów jonowo-asocjacyjnych.................62 4.2.2.3. Ekstrakcja specjacyjna .......................................................................................65 4.2.3. Klasyczna technika ekstrakcji ciecz ­ ciecz .................................................................67 4.2.4. Ekstrakcja cigla ......................................................................................................67 4

4.2.5. Mikroekstrakcja .......................................................................................................69 4.2.5.1 Mikroekstrakcja do rozpuszczalnika.....................................................................69 4.2.5.2. Mikroekstrakcja do kropli ..................................................................................69 4.2.5.3. Mikroekstrakcja poprzez membran do fazy cieklej .............................................72 4.2.6. Ekstrakcja cieczami jonowymi...................................................................................73 4.3. Ekstrakcja w ukladzie ciecz ­ cialo stale ...........................................................................79 4.3.1. Ekstrakcja do fazy stalej ...........................................................................................79 4.3.2. Mikroekstrakcja do fazy stalej ..................................................................................84 4.3.3. Ekstrakcja za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego ...........................................84 4.3.4. Ekstrakcja z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej .........................................90 4.3.5. Ekstrakcja przez wykluczanie na sorbentach immunologicznych .................................91 4.3.6. Ekstrakcji za pomoc polimerów z nadrukiem molekularnym .....................................92 4.3.7. Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce .........................................95 5. Ekstrakcja próbek stalych ......................................................................................................97 5.1. Ekstrakcja próbek stalych faz gazow.............................................................................98 5.1.1 Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej ........................................................98 5.1.2. Ekstrakcja dynamiczna technik wymywania i wychwytywania...................................99 5.1.3. Ekstrakcja strumieniem gazu z desorpcj termiczn ...................................................99 5.2. Ekstrakcja w ukladzie cialo stale ­ ciecz ......................................................................... 100 5.2.1. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie....................................................... 100 5.2.2. Ekstrakcja przez homogenizacj próbki z rozpuszczalnikiem ..................................... 100 5.2.3. Ekstrakcja przez zmydlanie (saponifikacja)............................................................... 100 5.2.4. Ekstrakcja za pomoc strumienia rozpuszczalnika .................................................... 101 5.2.5. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypelniaczem............... 102 5.2.6. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta ...................................... 103 5.2.7. Ekstrakcja wspomagana ultradwikami ................................................................. 107 5.2.8. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym ...................................................................................................................................... 108 5.2.9 Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika pod zwikszonym cinieniem.......................... 111 5.2.10. Przyspieszona ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika ............................................. 112 5.2.11. Ekstrakcja plynem w stanie nadkrytycznym ........................................................... 115 5.2.12. Ekstrakcja poprzez mineralizacj........................................................................... 119 6. Literatura ........................................................................................................................... 121 III. Techniki chromatograficzne ................................................................................................... 123

5

1. Wprowadzenie do chromatografii ....................................................................................... 123 1.1. Wstp.......................................................................................................................... 123 1.2. Podstawowe definicje chromatograficzne...................................................................... 125 1.3. Chromatogram............................................................................................................. 127 1.4. Podstawowe parametry retencyjne............................................................................... 129 1.5. Podstawy teoretyczne procesu chromatograficznego ..................................................... 130 1.5.1. Teoria pólek .......................................................................................................... 132 1.5.2. Teoria kinetyczna................................................................................................... 135 1.6. Sprawno kolumn chromatograficznych ....................................................................... 139 1.7. Analiza jakociowa ....................................................................................................... 141 1.8. Analiza ilociowa .......................................................................................................... 144 1.8.1. Metoda krzywej kalibracyjnej ................................................................................. 145 1.8.2. Metoda wzorca wewntrznego............................................................................... 146 1.8.3. Metoda dodatku wzorca ........................................................................................ 149 1.8.4. Metoda normalizacji wewntrznej .......................................................................... 150 2. Chromatografia cieczowa .................................................................................................... 152 2.1. Wstp.......................................................................................................................... 152 2.2. Chromatografia cienkowarstwowa ................................................................................ 153 2.2.1. Wstp ................................................................................................................... 153 2.2.2. Proces chromatograficzny ...................................................................................... 154 2.2.3. Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej w TLC............................................................ 157 2.3. Chromatografia kolumnowa niskocinieniowa ............................................................... 159 2.3.1. Wstp ................................................................................................................... 159 2.3.2. Proces chromatograficzny ...................................................................................... 160 2.3.3. el krzemionkowy jako faza stacjonarna.................................................................. 161 2.3.4. Klasyfikacja rozpuszczalników w normalnym ukladzie faz ......................................... 162 2.3.5. Dobór warunków rozdziele w chromatografii kolumnowej na elu krzemionkowym za pomoc analizy TLC......................................................................................................... 165 2.4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa .................................................................... 169 2.4.1. Wstp ................................................................................................................... 169 2.4.2. Aparatura.............................................................................................................. 170 2.4.3. Chromatografia adsorpcyjna .................................................................................. 175 2.4.4. Chromatografia podzialowa ................................................................................... 175 2.4.5. Chromatografia jonowa ......................................................................................... 177

6

2.4.6. Chromatografia wykluczania .................................................................................. 182 2.4.7. Chromatografia powinowactwa.............................................................................. 183 3. Chromatografia gazowa ..................................................................................................... 184 3.1. Wstp.......................................................................................................................... 184 3.2. Aparatura .................................................................................................................... 184 3.3. Wybór parametrów analizy GC...................................................................................... 190 4. Polczenie chromatografii gazowej ze spektrometri mas..................................................... 192 5. Chromatografia z faza ruchom w stanie nadkrytycznym ...................................................... 198 5.1. Wstp.......................................................................................................................... 198 5.2. Fazy ruchome .............................................................................................................. 199 5.3. Proces rozdzielania chromatograficznego ...................................................................... 199 5.4. Aparatura .................................................................................................................... 200 5.5. Zastosowanie chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym............................ 203 6. Literatura ........................................................................................................................... 204 IV. Techniki elektromigracyjne .................................................................................................... 206 1. Wstp ................................................................................................................................ 206 2. Podzial technik elektroforetycznych..................................................................................... 210 2.1. Elektroforeza kapilarna................................................................................................. 211 Zalety elektroforezy kapilarnej......................................................................................... 217 2.1.1. Strefowa elektroforeza kapilarna ............................................................................ 218 2.1.2. Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna ............................................ 218 2.1.3. Kapilarna elektroforeza elowa............................................................................... 219 2.1.4. Ogniskowanie izoelektryczne.................................................................................. 219 2.1.5. Izotachoforeza kapilarna ........................................................................................ 220 2.1.6. Elektrochromatografia kapilarna............................................................................. 221 2.2. Elektroforeza elowa na plaszczynie ............................................................................ 222 2.2.1. ele stosowane w elektroforezie ............................................................................ 223 2.2.2. Przygotowanie próbek ........................................................................................... 225 2.2.3. Rozdzielenie .......................................................................................................... 225 2.2.4. Wizualizacja .......................................................................................................... 225 2.2.5. Dokumentacja rozdziele ....................................................................................... 226 3. Wykorzystanie technik elektromigracyjnych......................................................................... 226 4. Literatura ........................................................................................................................... 227

7

Od autorów

Techniki separacyjne, a szczególnie techniki chromatograficzne s dzisiaj najczciej stosowanymi technikami laboratoryjnymi ­ adne wspólczesne laboratorium chemiczne czy biochemiczne nie moe si bez nich obej. Nabywanie umiejtnoci poslugiwania si nowoczesnymi technikami separacyjnymi staje si wic zasadniczym obszarem ksztalcenia praktycznego na kierunkach chemicznych i pokrewnych w szkolnictwie wyszym. Od wielu lat Wydzial Chemii Uniwersytetu Gdaskiego wprowadza do programów studiów na kierunkach CHEMIA oraz OCHRONA RODOWISKA zagadnienia zwizane z zastosowaniem technik separacyjnych w zaawansowanej analityce chemicznej i biochemicznej, fizykochemii organicznej czy monitoringu rodowiska. Dodatkowo, na jednej ze specjalnoci kierunku chemia (analityka i diagnostyka chemiczna) realizowany jest przedmiot pod nazw Techniki separacyjne. Niniejszy skrypt przygotowany zostal z myl o studentach wszystkich kierunków i specjalnoci Wydzialu Chemii UG, którzy z elementami technik separacyjnych stykaj si ju na pierwszym roku studiów, by w kolejnych latach poznawa coraz to bardziej zaawansowane metody rozdzielncze zarówno w obrbie kursów podstawowych jak i specjalnociowych. Skrypt podzielony jest na trzy samoistne czci: techniki izolacji analitów, techniki chromatograficzne oraz techniki elektormigracyjne. Takie podejcie umoliwilo zawarcie wikszoci zagadnie teoretycznych i praktycznych towarzyszcych technikom separacyjnym ukazujc je, jako integralny obszar wiedzy. Mamy nadziej, e skrypt Techniki separacyjne stanie si wan pozycj wspomagajc ksztalcenie studentów na Wydziale Chemii Uniwersytetu Gdaskiego oraz innych uczelni w Polsce. Autorzy

8

I. Wprowadzenie do technik separacyjnych

1. Wstp

Techniki separacyjne we wspólczesnej analityce chemicznej s podstaw wikszoci procesów izolacji i identyfikacji zwizków chemicznych. Ich zadaniem jest selektywne rozdzielenie pierwiastków czy substancji chemicznych ze skomplikowanych mieszanin, przy jednoczesnym okreleniu ich rodzaju i iloci. Stosujc techniki separacyjne, w trakcie jednej operacji analitycznej mona uzyska bardzo wiele informacji. Jest to najprawdopodobniej najwiksza ich zaleta w porównaniu z klasycznymi metodami analitycznymi. Oprócz zastosowania analitycznego, techniki separacyjne wykorzystywane s obecnie równie w procesach preparatywnych, tzn. do wydzielania wikszych iloci pojedynczych substancji lub frakcji wybranych zwizków o okrelonym dalszym zastosowaniu. W duej mierze procesy te s bardzo podobne do zastosowa analitycznych ze wzgldu na mechanizm rozdzielania jak i stosowanej aparatury, róni si natomiast skal. Zastosowanie technik separacyjnych w analityce chemicznej zwizków organicznych rozpoczlo si ponad sto lat temu, wraz z odkryciem zjawiska chromatografii przez Michaila Cwieta, który po raz pierwszy zastosowal t metod do rozdziele wyekstrahowanych barwników rolin. Rozwój tej dziedziny nauki nie bylby jednak moliwy bez wkladu takich uczonych jak Irving Langmuir (Nagroda Nobla w 1932) czy Archer Martin i Richard Synge (Nagroda Nobla w 1952), których badania nad fizykochemi powierzchni czy zjawiskami midzyfazowego podzialu daly faktyczne podstawy nowoczesnym technikom separacyjnym. Wspólczenie, techniki separacyjne stosowane w chemii analitycznej obejmuj trzy zasadnicze grupy: · · · techniki izolacji analitów z matryc, techniki chromatograficzne, techniki elektromigracyjne.

Techniki izolacji analitów reprezentowane s przede wszystkim przez rónorodne metody ekstrakcyjne, takie jak ekstrakcja rozpuszczalnikiem czy ciecz w stanie nadkrytycznym, ekstrakcja i mikroekstrakcja do fazy stalej czy ekstrakcja do kropli. Dodatkowo, procesy te mog by wspomagane energi ultradwików, mikrofal lub podwyszaniem cinienia. Najobszerniejsz grup technik separacyjnych, stosowanych w analityce chemicznej, jest chromatografia. Obejmuje ona chromatografi planarn, gazow i cieczow wraz z ich odmianami, jak chromatografia adsorpcyjna, podzialowa, powinowactwa, wykluczenia, jonowymienna i in. oraz techniki lczone, wykorzystujce np. polczenie procesu ekstrakcji z dozowaniem próbki do ukladu pomiarowego czy separacji analitów wraz z okreleniem ich iloci i identyfikacji struktury. Trzecia grupa obejmuje techniki elektromigracyjne, takie jak: elektroforeza planarna i kapilarna, micelarna chromatografia elektrokinetyczna, kapilarne ogniskowanie izoelektryczne oraz izotachoforeza kapilarna. Podstawowy podzial technik separacyjnych wykorzystywanych w analityce chemicznej przedstawiono na rysunku 1. Dodatkowo, podzialu metod mona dokona na podstawie cech charakterystycznych dla konkretnego procesu. S to: typ fazy ruchomej (gaz lub ciecz), profil ukladu 9

(strefowy lub czolowy), rodzaj izotermy (liniowy lub nieliniowy), rozmieszczenie wypelnienia (planarne lub kolumnowe), sklad fazy ruchomej (izokratyczny lub w gradiencie), wymiarowo ukladu (jednowymiarowy, dwu- lub wielowymiarowy), skala (analityczna lub preparatywna) oraz rodzaj mechanizmu.

Techniki separacyjne w analityce chemicznej

Techniki ekstrakcyjne

Techniki chromatograficzne

Techniki elektromigracyjne

Ekstrakcja gazem

Chromatografia gazowa Chromatografia kolumnowa

Ekstrakcja ciecz Ekstrakcja do fazy stalej

Elektroforeza elowa na plaszczynie Elektroforeza kapilarna

Chromatografia ciecz w stanie nadkrytycznym Chromatografia kolumnowa

Chromatografia cieczowa Chromatografia kolumnowa Chromatografia planarna

Rysunek 1. Techniki separacyjne w analityce chemicznej

10

Procesom separacyjnym towarzysz okrelone mechanizmy fizyczne i chemiczne, w konsekwencji umoliwiajce rozdzielenie substancji z mieszaniny (rysunek 2). Istniej trzy podstawowe grupy mechanizmów wykorzystywanych w separacji analitycznej, s to: podzial, adsorpcja oraz filtracja. Ostatni z nich ma charakter wylcznie fizyczny i ma zastosowanie glównie w procesach zatania i wydzielania analitów z matryc. Z kolei zarówno sorpcja jak i podzial oparte s na oddzialywaniach fizykochemicznych pomidzy analitem a medium separacyjnym.

Mechanizmy towarzyszce procesom separacyjnym

Adsorpcja

Podzial Podzial cieczciecz

Filtracja

Adsorpcja chemiczna Adsorpcja fizyczna

Ultrafiltracja Nanofiltracja

Podzial cieczciecz na noniku Podzial cieczgaz

Odwrócona osmoza Sczenie molekularne

Oddzialywania: - jonowe - dipol-dipol - wizania wodorowe - -

Podzial gaz-ciecz na noniku

Oddzialywania dyspersyjne

Oddzialywania: - dyspersyjne - jonowe - jon-dipol - dipol-dipol - dipol-dipol indukowany - wizania wodorowe - - Rysunek 2. Mechanizmy towarzyszce procesom separacyjnym 11

Intensywno oraz selektywno tych oddzialywa odgrywa zasadnicz rol w procesie rozdzielenia substancji. Kluczow rol w doborze procesu separacyjnego ma budowa chemiczna analitu, od której zaley potencjal oddzialywa molekularnych jego czsteczki. Zdolno oddzialywa molekularnych czsteczki analitu nie jest mierzona jednym parametrem, lecz jest wypadkow przynajmniej kilku deskryptorów molekularnych, okrelajcych zachowanie si czsteczki w ukladzie separacyjnym.

2. Teoria separacji

Tak w analityce jak i preparatyce, separacja (rozdzielenie) substancji moe mie charakter pelny bd czstkowy. W pierwszym przypadku dochodzi do pelnego rozdzielenia mieszaniny na jej poszczególne skladniki, zgodnie z poniszym schematem: (a + b + c + d + ....) (a) + (b) + (c) + (d) + ... (1)

gdzie: nawiasy to okrelony obszar w przestrzeni, poszczególne litery a, b, c, d ... to komponenty (anality), zajmujce te obszary. Zgodnie z tym schematem, po zastosowaniu techniki separacyjnej, komponenty stanowice mieszanin (zmieszane), zostaj rozdzielone, czyli formalnie zajmuj róne obszary w przestrzeni. Jest to wynik najbardziej korzystny, umoliwiajcy dalsz, dokladn analiz poszczególnych skladników, zarówno pod ktem ilociowym jak i jakociowym. W drugim przypadku, w którym dochodzi do separacji czstkowej, schemat ten moe przyj nastpujce postaci: (a + b + c + d + ....) lub (a + b + c + d + ....) (a + b) + (b + a) + ... (3) Schemat (2) opisuje przypadek wydzielenia z wieloskladnikowej mieszaniny jednej, czystej substancji (analitu). Jest to sytuacja czsto towarzyszca zastosowaniu technik separacyjnych do wydzielania i oznaczania jednego skladnika, z pominiciem pozostalych komponentów mieszaniny, bdcych np. skladnikami matrycy analizowanej próbki. Niestety, stosowane techniki separacyjne nie zawsze s w stanie doprowadzi do jednoznacznego wyodrbnienia czystego analitu. Tak sytuacj opisuje schemat (3), z którego wynika, i w wyniku procesu separacyjnego rozdzielane s wieloskladnikowe frakcje, bogate w skladnik a (1 frakcja) lub skladnik b (2 frakcja). Otrzymane frakcje, o ile zachodzi taka potrzeba, mona poddawa dalszym procesom rozdzielczym, uywajc tej samej lub innej techniki separacyjnej. Przedstawione schematy separacji, niezalenie od tego, na jakim etapie rozdzielania czy wzbogacania próbki zachodz, opisuj zasadnicz cech wszystkich technik separacyjnych. Glówn cech wszystkich technik separacyjnych jest fakt, i w trakcie procesu dochodzi do przeniesienia (transportu) i redystrybucji analitów w przestrzeni w taki sposób, aby bylo moliwe ich pojedyncze i/lub grupowe oznaczenie jakociowe i ilociowe. (a) + (b + c + d + ... ) (2)

12

Transport analitów zachodzi w medium separacyjnym, w którym kluczow rol odgrywaj nastpujce czynniki: · · · budowa molekularna medium separacyjnego, okrelajca rodzaj oddzialywa midzyczsteczkowych, decydujcych o selektywnoci wobec konkretnych analitów, równowaga (dynamiczna) zachodzca pomidzy analitem a medium, bdca sil napdow procesu separacji, budowa mikro- i makroskopowa medium, okrelajca mechaniczne parametry separacji, tj. przeplyw, opory, wymian masy i in.

Ogólny schemat procesu separacji przedstawiono na rysunku 3. Najwaniejsz czci ukladu jest medium separacyjne, od którego rodzaju zaley nie tylko typ (budowa chemiczna) analitów poddawanych rozdzielaniu, ale równie ich liczba i stenie.

Rysunek 3. Ogólny schemat rozdziele analitów w technikach separacyjnych Medium separacyjne stanowi najczciej uklad dwufazowy. Wprowadzone do takiego ukladu anality, w trakcie procesu separacyjnego, ulegaj przeniesieniu z jednej fazy do drugiej. Wielokrotno tego procesu wraz z odpowiedni selektywnoci faz doprowadza do stopniowego rozdzielania (bd wydzielania) skladników mieszaniny. Uklad ten najczciej ma charakter dynamiczny, tzn. fazy przemieszczaj si wzgldem siebie w trakcie procesu separacyjnego, wielokrotnie zwikszajc moliwo oddzialywa na granicy faz. Wydluony w ten sposób kontakt midzy fazami umoliwia wielokrotne zajcie stanu równowagi, w którym zachodzi selektywne przeniesienie analitu, co prowadzi do jego rozdzielenia od innych skladników mieszaniny. 2.1. Termodynamiczny opis separacji Przeniesieniu masy analitu z jednej fazy do drugiej w ukladzie otwartym towarzyszy stan stalej lub chwilowej równowagi. Na gruncie termodynamiki mona przewidywa wlaciwoci ukladu znajdujcego si w stanie równowagi. Do tego celu sluy funkcja termodynamiczna nazywana entalpi swobodn, G (energi Gibbsa). Funkcja ta nie tylko opisuje stany równowagowe, ale równie dostarcza informacji o tym, czy okrelone procesy osign stan równowagi w danych warunkach. Z procesami przebiegajcymi samorzutnie w kierunku równowagi zwizana jest ujemna zmiana entalpii swobodnej G (w warunkach stalego cinienia i temperatury), wic, obliczajc G dla 13

przemiany fizycznej czy te chemicznej, mona przewidzie czy w danych warunkach temperatury i cinienia bdzie ona samorzutna. Zgodnie z I i II zasad termodynamiki zmiana entalpii swobodnej takiego ukladu opisana jest funkcj temperatury i objtoci, co pokazuje nastpujce równanie:

dG = - SdT + Vdp

(4)

gdzie: dG ­ zmiana entalpii swobodnej, S ­ warto entropii, dT ­ zmiana temperatury, V ­ objto ukladu, dp ­ zmiana cinienia. Jeeli w czasie procesu separacji, w warunkach stalej temperatury i stalego cinienia, zostanie wprowadzona do mieszaniny skladników pewna, bardzo mala ilo moli analitu i (dni) przy niezmienionej iloci pozostalych skladników (analitów), to spowoduje to zmian entalpii swobodnej G calej mieszaniny: (5) G dG = dni n i T , p ,n j W tym przypadku entalpia swobodna ukladu G zmienia si nieznacznie, proporcjonalnie do dni. Ten wklad wlasnej entalpii swobodnej danego skladnika i do calkowitej entalpii swobodnej ukladu definiuje si jako potencjal chemiczny substancji µi:

G

µi = n i T , p ,n j

(6)

Innymi slowy, potencjal chemiczny to cz entalpii G wniesiona do ukladu przez n moli substancji i przy stalej temperaturze i cinieniu. Wymiarem potencjalu chemicznego jest jednostka energii na mol. Po podstawieniu pochodnej czstkowej G/ n do równania (5), zmiana entalpii ukladu przyjmuje nastpujc posta: (7) dG = µ i dni Podobnie, zmiana iloci kadego z pozostalych skladników rozdzielanej mieszaniny (np. analitu j) ma wplyw na calkowit entalpi swobodn mieszaniny: (8) dG = µ j dn j Std, przeniesienie dowolnej liczby skladników w ukladzie jest sum wkladów czstkowych,

dG =

µi dni

(9)

przy czym suma dotyczy wszystkich skladników wchodzcych i opuszczajcych system (potencjaly chemiczne opuszczajcych skladników stanowi ujemny wklad do dG). Jeeli w trakcie procesu separacyjnego zmienia si take temperatura i cinienie, naley dodatkowo uwzgldni ich udzial:

14

dG = - SdT + Vdp +

µ dn

i

i

(10)

Jak powiedziano wczeniej, rozdzielenie analitów w wikszoci technik separacyjnych odbywa si najczciej w ukladzie dwufazowym (przedstawionym w uproszczeniu na rys. 4), zawierajcym dwie niemieszajce si (lub mieszajce si w bardzo ograniczonym stopniu) fazy i , pomidzy którymi moe doj do wymiany skladników. Fazy i rozpatrywane razem, stanowi uklad zamknity, który po uplywie dostatecznie dlugiego czasu osiga stan równowagi termodynamicznej. Do równowagi tej dochodzi za spraw przemieszczania si skladników pomidzy fazami. W równowadze skladniki przemieszczaj si równomiernie pomidzy fazami zachowujc okrelone, równowagowe, stenia w tych fazach. Wówczas zmiany entalpii swobodnych faz maj tak sam warto. Std wypadkowa zmiana entalpii swobodnej wynosi zero, dG = 0, zgodnie z równaniem:

dG = dG + dG = ( µi + µi ) dni = 0

(11)

Potencjal chemiczny wyraa status energetyczny skladnika i w kadej z tych faz. Przy stalej temperaturze i cinieniu równowaga na granicy faz oznacza zrównanie potencjalów chemicznych substancji i w fazie i fazie : (12) µ =µ

i i

Rysunek 4. Schemat ukladu dwufazowego skladajcego si z fazy , zawierajcej n moli analitu (ni) i z fazy , do której migruj czsteczki analitu Równo ta zachodzi we wszystkich procesach separacyjnych. Wielko potencjalu chemicznego zaley od dwóch zasadniczych czynników: · · termodynamicznego powinowactwa zwizku do danej fazy, stopnia rozcieczenia (stenia zwizku).

Powinowactwo (intensywno oddzialywa analitu z faz) opisuje tzw. standardowy potencjal chemiczny µi0, natomiast stopie rozcieczenia - stenie substancji w ukladzie. Obie te wielkoci s zwizane z potencjalem chemicznym w nastpujcy sposób:

µ i = µ i 0 + RT ln ci

(13)

gdzie: R ­ stala gazowa, ci ­ stenie analitu i (mol/L lub mol/kg).

15

Standardowy potencjal chemiczny µi0 zaley przede wszystkim od energii (w mniejszym stopniu entropii) oddzialywa pomidzy analitem a jego otoczeniem (faz), std zmienia si w czasie przemieszczania analitu z fazy do fazy. Wielko µi0 przyjmuje najmniejsze wartoci w ukladach, gdzie oddzialywania analit ­ faza s najsilniejsze. Czlon RTln ci opisuje stopie rozcieczenia analitu w fazie. Na stopie rozcieczenia wplywa przede wszystkim warto entropii (entropii rozcieczenia). Wplyw ten jest niebagatelny, zwaywszy na fakt, i w ukladach separacyjnych (dwóch faz) wystpuje zwykle duy stopie rozcieczenia analitu. Biorc powysze pod uwag moemy powiedzie, i w ukladzie dwufazowym bodcem do przejcia analitu z fazy do fazy jest obnianie potencjalu chemicznego. W ukladzie takim osignicie stanu równowagi oznacza, e potencjal chemiczny analitu jest taki sam w obu fazach, czyli µi = µi, co prowadzi do nastpujcego równania:

c i c i

0 = exp - µi RT eq

(14)

gdzie: µi0 = µi0 - µi0, (ci / ci)eq - iloraz ste analitu w fazach. Iloraz ste analitu w fazach jest równowagowym wspólczynnikiem podzialu K, std:

- µ i0 K = exp RT

(15)

W równowadze zachodzi równo µi = µi, wic w fazie z mniejsz wartoci µi0 równo kompensuje wysza warto skladowej RT lnci, a wic wysze stenie analitu. Dodatkowo, jeeli µi0 przyjmuje warto dodatni, oznacza to, e µi0 w fazie jest mniejsze ni w fazie . Rónica ta spowodowana jest zarówno rón sil (energi) oddzialywa chemicznych analitów z fazami jak i rónym stopniem rozcieczenia (entropi) w fazach. W konsekwencji to wlanie ta rónica umoliwia separacj rónych analitów w ukladzie dwufazowym. Przyjmujc, e calkowit zmian entalpii ukladu reprezentuje rónica standardowych potencjalów chemicznych w ukladzie, to:

- G 0 K = exp RT

(16)

gdzie: G0 - calkowita zmiana entalpii ukladu std:

RT ln K = - G 0

(17)

Z II zasady termodynamiki wiadomo, i na entalpi swobodn ukladu G sklada si zarówno zmiana entalpii, H0, stanowica wklad energetyczny do entalpii swobodnej, jak i zmiana entropii (S0), czyli:

G 0 = H 0 - T S 0

(18)

gdzie: H0 ­ zmiana entalpii ukladu, S0 ­ zmiana entropii ukladu. 16

Po podstawieniu do równania (17) otrzymuje si ogólne równanie wice równowagowy wspólczynnik podzialu, z entalpi i entropi danego procesu:

H 0 S 0 ln K = - - R RT

(19)

Równowagowy wspólczynnik podzialu K, bdcy miar wszystkich procesów separacyjnych, jest wypadkow dwu udzialów: entalpowego i entropowego, przy czym w zalenoci od zastosowanej techniki, dominujcy moe by udzial jednej albo drugiej skladowej. Ilustruj to przykladowe wykresy Van't Hoffa, przedstawione na rysunku 5, opisujce temperaturow zmienno stalej równowagi w dwu rónych procesach separacyjnych.

Rysunek 5. Wykresy Van't Hoffa, opisujce temperaturow zmienno stalej równowagi w dwu (a i b) rónych procesach separacyjnych W pierwszym procesie (wykres A), przy malym udziale czynnika entropowego (S/R), nastpuje wyrana zmiana entalpii ukladu wraz ze zmian temperatury (duy kt nachylenia krzywej). Taki przypadek ma miejsce w przypadku technik opartych o podzial do fazy (chromatografia podzialowa, ekstrakcja), gdzie energia oddzialywa fizykochemicznych analitu z faz odgrywa decydujc rol w separacji. W drugim procesie (wykres B), udzial czynnika entropowego (S/R) jest zdecydowanie wikszy, natomiast wplyw zmian temperatury na czynnik entalpowy jest mniej wyrany (mniejsze nachylenie krzywej). Jest to przypadek opisujcy techniki oparte o zjawisko adsorpcji (chromatografia adsorpcyjna lub jonowymienna), gdzie dochodzi do gwaltownych zmian w strukturze uporzdkowania ukladu w trakcie separacji. 2.2. Adsorpcja i podzial Z punktu widzenia procesu separacyjnego rónica pomidzy adsorpcj a podzialem tkwi w miejscu, w którym dochodzi do zmiany stenia rozdzielanego analitu; podczas adsorpcji zmiana ta zachodzi na powierzchni graniczcych ze sob faz, natomiast w trakcie podzialu dotyczy ona calej objtoci faz ukladu. Na rysunku 6 przedstawiono schematyczne ujcie obu procesów.

17

Rysunek 6. Schematyczne ujcie adsorpcji (a) i podzialu (b) Na granicy faz dochodzi do nierównomiernego rozloenia (asymetrii) oddzialywa molekularnych na powierzchni (rysunek 7a). W efekcie czsteczki powierzchniowe s silniej wcigane do wntrza fazy objtociowej, co jest przyczyn powstania napicia powierzchniowego na granicy faz, na której dochodzi do adsorpcji. Natomiast w przypadku podzialu, oddzialywania w obrbie fazy objtociowej s jednakowe, niezalene od miejsca w przestrzeni (rysunek 7b). Zarówno mechanizm adsorpcji (i desorpcji) jak i podzialu, zachodzcy w technikach separacji analitów, jest zwykle sum kilku typów oddzialywa. Ich poszczególny udzial decyduje o intensywnoci i trwaloci interakcji analitu z medium separacyjnym. Po zajciu adsorpcji anality trac swobod ruchu, co oznacza obnienie entropii ukladu. Anality po zwizaniu z sorbentem trac równie energi, czyli maleje ich entalpia swobodna. Skoro zachodzi równo opisana zalenoci (18), oznacza to, e wszystkie procesy adsorpcji s egzotermiczne.

Rys. 7. Schematyczna reprezentacja oddzialywa midzyczsteczkowych w fazie powierzchniowej (a) i objtociowej (b) Aby okreli, w jakim stopniu zwizek chemiczny gromadzi si na granicy faz w stanie równowagi w danym ukladzie, naley zna stosunek calkowitej iloci zwizku na sorbencie do iloci pozostalej w drugiej fazie. Stosunek ten odpowiada stalej podzialu zdefiniowanej wyraeniem (15), przy czym w opisie zjawiska adsorpcji stala ta nazywana jest równowagowym wspólczynnikiem sorpcji, Kd:

18

Kd =

gdzie:

Cs Cw

(20)

Cs - calkowita ilo zaadsorbowanego analitu na jednostk sorbentu (np.: mol kg-1), Cw - ilo zwizku pozostajca w drugiej fazie (gazie lub roztworze) w stanie równowagi (np.: mol l-1). W równowagowym podziale substancji chemicznej midzy gaz lub ciecz a cialo stale na stenie analitu w gazie lub roztworze wplywa calkowita pojemno sorbentu i zwizany z tym stopie nasycenia powierzchni sorbentu. W najprostszym przypadku, dla niskich cinie lub bardzo malych ste (powierzchnia sorbentu jest prawie pusta) zaleno (20) jest spelniona w postaci: Cs = Kd Cw i jest zwana równaniem izotermy Henry'ego (zaleno liniowa, potwierdzona eksperymentalnie). Powizanie midzy steniami analitu w fazie wolnej i zwizanej duo lepiej oddaje izoterma sorpcji wg modelu Freundlicha: Cs = KF. Cw 1/n (22) gdzie: KF - stala Freundlicha lub wspólczynnik pojemnociowy, 1/n - wykladnik potgowy Freundlicha. Zaleno ta zaklada, e równoczenie oddzialuj róne typy miejsc aktywnych, zrónicowanych zarówno pod wzgldem iloci, jak i entalpii swobodnych. Dodatkowo, model ten zaklada, e moe wystpowa wielowarstwowa sorpcja. Wykladnik potgowy jest wskanikiem zrónicowania entalpii swobodnych, powizanych z sorpcj z roztworu przez róne skladniki heterogenicznego sorbentu:

· · ·

(21)

gdy 1/n =1, mona wnioskowa, e entalpia swobodna procesu jest stala w calym zakresie ste; kiedy 1/n < 1, izoterma wskazuje, i dodawany sorbat jest wizany z centrami o coraz mniejszej entalpii swobodnej; gdy 1/n > 1, izoterma ma przebieg rosncy, z czego mona wnioskowa, e wiksza ilo czsteczek na powierzchni zwiksza entalpi swobod, a tym samym potguje dalsz sorpcj.

Parametry KF oraz 1/n mog zosta wyznaczone z danych eksperymentalnych, poprzez przeksztalcenie równania (22) do postaci logarytmicznej (23): 1 log C s = log C n + log K F (23) n Jeli na sorbencie istnieje ograniczona liczba miejsc aktywnych, które zostan wysycone, Cs nie moe rosn w nieskoczono wraz ze wzrostem Cw i izoterma nie moe by opisana przez równanie (23). W takim przypadku lepiej sprawdza si model izotermy Langmuira. Zaklada on, e na powierzchni sorbentu istnieje okrelona liczba jednakowych centrów sorpcji (adsorpcji), z których kade jest zdolne do zaadsorbowania tylko jednej czsteczki adsorbatu (proces ten nazywany te jest adsorpcj zlokalizowan). Stan maksymalnej adsorpcji odpowiada obsadzeniu wszystkich centrów, tj. wytworzeniu na powierzchni monomolekularnej warstwy. Izoterm Langmuira opisuje nastpujce równanie:

Cs =

Cmax K L CW 1 + K L CW

(24) 19

gdzie: Cmax - maksymalna liczba centrów aktywnych na jednostk masy sorbentu, KL - stala Langmuira. W idealnym przypadku, Cmax bdzie takie samo dla wszystkich sorbentów, w rzeczywistoci Cmax moe mie róne wartoci, w zalenoci od rodzaju analitu (np: rónica w wielkoci czsteczki oddzialywujcej). Dlatego te, Cmax zwykle wyraa maksymaln powierzchni dostpn dla danego zwizku. Stala KL jest okrelana, jako stala równowagi reakcji sorpcji: centrum powierzchniowe + analit w roztworze lub w gazie analit na powierzchni Przy zaloeniu, e KL jest stala, nastpuje cigle powinowactwo analitu do wszystkich centrów powierzchniowych. Aby wyznaczy KL i Cmax z danych eksperymentalnych, naley graficznie przedstawi zaleno 1/Cs od 1/Cw:

1 1 1 = + C s K L C max C s C max

(25)

i z parametrów prostej wyznaczy stale izotermy. Model Freundlicha jest zwykle stosowany do opisu zachowa czsteczek chemicznych na zrónicowanych powierzchniach porowatych, natomiast model Langmuira bardzo dobrze ilustruje koncepcj tworzenia monowarstwy adsorpcyjnej na powierzchni porowatej, a take procesy chemisorpcji. W przypadku zjawiska podzialu take dochodzi do równowagi, w której, zgodnie z równaniem (14) stosunek ste analitu w dwóch niemieszajcych si fazach jest staly, opisany stal podzialu K:

c i c i

= K = const eq

(26)

Stan ten opisuje prawo Nernsta, które jest spelnione w stalej temperaturze i przy stalym cinieniu. Prawo Nernsta jest spelnione dla ukladu dwu cieczy niemieszajcych lub mieszajcych si w sposób ograniczony. Warunkiem koniecznym jest take (jak w przypadku izotermy Henry'ego) niskie stenie substancji rozpuszczonej w obu fazach oraz brak jakichkolwiek reakcji analitów, w kontakcie z jedn lub obu fazami ukladu (dysocjacja, asocjacja, polimeryzacja i in.). Wszystkie wymienione stale opisujce równowag ukladu, zarówno podczas procesu adsorpcji (Kd, KF i KL) czy podzialu (K) s jedn z miar efektywnoci procesu separacyjnego. Im wysza warto dowolnej z nich, opisujcej dany proces, tym intensywniejsze oddzialywanie analitu z medium separacyjnym, powodujce dluszy czas przebywania analitu w ukladzie. Poniewa wynik procesu separacyjnego najczciej okrela si czasem przebywania (retencji, retardacji, mobilnoci) analitu w ukladzie, czas ten jest wprost proporcjonalny do stalej równowagi opisujcej dany proces.

20

2.3. Oddzialywania midzyczsteczkowe Wielkoci charakteryzujc termodynamiczne powinowactwo analitu do danej fazy jest standardowy potencjal chemiczny µi0 (13). Na to powinowactwo sklada si szereg oddzialywa fizykochemicznych o charakterze odwracalnym, powodujcych przemieszczanie si analitu w ukladzie. W procesach rozdzielczych najczciej wykorzystywane s nastpujce oddzialywania: dyspersyjne, jonowe, dipol ­ dipol, dipol ­ dipol indukowany oraz wizanie wodorowe. Trwalsze oddzialywania (wizania chemiczne), ze wzgldu na ich nieodwracalno, praktycznie nie s wykorzystywane w procesach separacji. W tabeli 1 zgrupowano typowe oddzialywania towarzyszce procesom rozdzielania wraz z zakresami ich energii oraz ilustrujcymi je przykladami. Wszystkie oddzialywania midzyczsteczkowe maj natur elektrostatyczn. Generalnie mona wyodrbni trzy grupy oddzialywa, których natura uzaleniona jest od budowy chemicznej biorcych w nich udzial czsteczek. S to: oddzialywania dyspersyjne, oddzialywania polarne oraz oddzialywania jonowe.

Tabela 1. Typowe oddzialywania zachodzce w ukladach separacyjnych Zaleno energii od odlegloci

R C O

Rodzaj oddzialywania

Energia (kJ/mol)

Przyklad

Silne oddzialywanie jonowe

200

1/r

H

N

O

+

N

Oddzialywanie jonowe Odzialywanie jon- dipol Wizanie wodorowe Oddzialywanie dipol- dipol

40 25 20 4

1/r 1/r2 1/r3 1/r3

Cl

+N R 4

R3 N:

+

N4R

OH

C +

O

:NR3

R

Oddzialywania dyspersyjne

2

1/r6

R

2.3.1. Oddzialywania dyspersyjne Oddzialywania dyspersyjne (zwane inaczej silami Londona) wywolywane s przede wszystkim pomidzy substancjami obojtnymi, nieposiadajcymi trwalych ladunków elektrycznych czy momentów dipolowych. Mimo to, wzajemne ssiedztwo dwóch obojtnych czsteczek z czasem prowadzi do nieznacznych fluktuacji elektronów w ich strukturze, co z kolei wywoluje powstanie chwilowych dipoli. Dipole te, cho trwaj doslownie ulamki sekund, zaczynaj na siebie oddzialywa przycigajc si i odpychajc elektrostatycznie. Sila tego typu oddzialywa zaley od polaryzowalnoci czsteczek, zarówno tych, w których rozpoczynaj si fluktuacje elektronów, jak i 21

tych, które ulega bd temu wplywowi. Fluktuacje te bd tym intensywniejsze im slabszy bdzie wplyw jdra na wzbudzane (walencyjne) elektrony. Dua polaryzowalno wiadczy o uprzywilejowanej sklonnoci czsteczek do ulegania takim oddzialywaniom. W uproszczeniu energi oddzialywa dyspersyjnych mona przybliy wzorem Londona:

C r

6

V =-

II C 1 2 1 2 I +I 1 2

(27)

gdzie: V ­ energia potencjalna oddzialywania, r ­ odleglo midzy czsteczkami, 1 i 2 ­ polaryzowalno czsteczek biorcych udzial w oddzialywaniu, I1 i I2 ­ energie jonizacji obu czsteczek. Oddzialywania dyspersyjne maj kluczowe znaczenie w jednym z najwaniejszych obecnie rodzajów chromatografii cieczowej - w ukladzie faz odwróconych. Ten typ chromatografii cieczowej pozwala na precyzyjne projektowanie selektywnoci ukladu, dziki niewielkim energiom oddzialywa (odleglym o a r6), towarzyszcym procesowi separacji. Jest to obecnie jedna z najpopularniejszych metod rozdzielania analitów. 2.3.2. Oddzialywania polarne Oddzialywania polarne zachodz pomidzy czsteczkami polarnymi, które posiadaj trwaly lub indukowany moment dipolowy. Trwaly moment dipolowy wynika z obecnoci konkretnych grup funkcyjnych w czsteczce, których budowa zapewnia powstanie czstkowych ladunków w obrbie struktury. Z kolei indukowanie dipolu moe zaj w czsteczce obojtnej (jak to ma miejsce w oddzialywaniach dyspersyjnych), przy czym zjawisko to dotyczy duo silniejszych pól elektrycznych, pochodzcych od czsteczek polarnych. Energia oddzialywa polarnych zaley przede wszystkim od momentu dipolowego czsteczki polarnej oddzialujcej z inn czsteczk polarn bd indukujc dipol w innej czsteczce obojtnej. Moment dipolowy wyraany jest w debajach (D), przy czym 1D = 3,3 10-30 C m. Sama warto momentu dipolowego nie zawsze odzwierciedla faktyczn polarno czsteczki. Np. zmierzony moment dipolowy wody, substancji z natury wysoce polarnej, wynosi zaledwie 1,8 D lub polarnego metanolu, tylko 2,8 D. W obu przypadkach jest to wynik dodatkowych oddzialywa, jakie zachodz w tych rozpuszczalnikach, prowadzcych do wzajemnych asocjacji czsteczek poprzez wizania wodorowe, w konsekwencji kompensujcych potencjalnie znaczne momenty dipolowe. W oddzialywaniach polarnych wan rol odgrywa take wzajemne uloenie dipoli w przestrzeni. Ogólnie, energia potencjalna takiego oddzialywania zaley od momentów dipolowych µ obu dipoli, odleglych od siebie o r3 w przypadku uloenia równoleglego lub o r6 w przypadku innej orientacji:

V

µ1µ 2

r3

f

(28)

gdzie: czynnik f uwzgldnia zmian energii wywolan zblianiem si do siebie jednakich lub przeciwnych ladunków dipoli (zmian kta pomidzy wektorami reprezentujcymi oddzialujce na siebie dipole).

22

Gdy oddzialywanie dotyczy dipola indukowanego, energia potencjalna oddzialywania, opisana równaniem (27), jest zdecydowanie nisza, a stala C zaley od momentu dipolowego substancji indukujcej µ1 i polaryzowalno substancji indukowanej 1:

2 C µ1 1

(29)

Szczególnym przypadkiem oddzialywa polarnych jest wizanie wodorowe. W oddzialywaniu tym atom wodoru jest usytuowany pomidzy dwoma silnie elektroujemnymi atomami (np. atomem azotu, tlenu lub fluoru) wic je nawzajem. W najprostszym ujciu, pomijajc teori orbitali molekularnych, oddzialywanie to powstaje w wyniku pojawienia si na atomie wodoru czstkowego ladunku dodatniego (w zwizku ze spolaryzowaniem ukladu), który elektrostatycznie oddzialuje z woln par elektronow na drugim atomie elektroujemnym, wg nastpujcego schematu:

-

gdzie:

X - H + L: Y -

X i Y to atomy wysoce elektroujemne biorce udzial w oddzialywaniu. Oddzialywanie takie jest stosunkowo trwale (20kJ/mol) i pelni istotn rol w strukturze krysztalów molekularnych czy drugorzdowej strukturze bialek. Z punktu widzenia technik separacyjnych, jest to zasadnicze oddzialywanie zachodzce podczas procesu sorpcji zwizków polarnych na powierzchniach takich jak krzemionka czy tlenki glinu. Ponadto, podobnie jak pozostale oddzialywania polarne, wspólwystpuje ono z oddzialywaniami dyspersyjnymi i jonowymi w trakcie procesów rozdzielania. Do oddzialywa polarnych naley take zaliczy oddzialywania donorowo-akceptorowe par elektronowych (nazywanych take oddzialywaniem przeniesienia ladunku). Zachodzi ono pomidzy donorem pary elektronowej - czsteczk posiadajc wysokoenergetyczny orbital molekularny a akceptorem pary elektronowej ­ czsteczk posiadajc niskoenergetyczny orbital molekularny. Najwyszymi energiami charakteryzuj si orbitale zajte przez wolne pary elektronów n (np. w aminach, eterach, fosfinach i in.) lub elektronów (nienasycone zwizki organiczne). Orbitale akceptorowe to nieobsadzone orbitale walencyjne metali, orbitale antywice (np. chlorowce) lub zwizki zawierajce uklad -elektronowy. W technikach separacyjnych, w celu podniesienia selektywnoci rozdziele czsto wykorzystuje si te oddzialywania pomidzy ukladami nienasyconymi (oddzialywania -*). 2.3.3. Oddzialywanie jonowe Oddzialywania jonowe zachodz midzy dwiema rónoimiennie naladowanymi czsteczkami. W odrónieniu od wizania jonowego, w oddzialywaniu jonowym ladunek jest zdelokalizowany pomidzy atomami tworzcych je czsteczek. Energi tego oddzialywania opisuje kulombowska energia potencjalna pomidzy dwoma ladunkami odleglymi o r, wg wzoru:

V=

gdzie:

z i e2 4 0 r

(30)

zi ­ wartociowo jonu, e - ladunek elementarny, 0 ­ przenikalno elektryczna w próni (8,85 10-12 J-1C2m-1).

23

W przypadku orodka zawierajcego inne ladunki, np. roztworu elektrolitu, efekt oddzialywania jest duo slabszy. Oddzialywanie jonowe jest wykorzystywane w technikach separacyjnych przede wszystkim w chromatografii jonowej, gdzie naladowane anality rozdzielane s na fazach stacjonarnych (jonitach) obdarzonych przeciwnym ladunkiem. 2.4. Lipofilowo w opisie potencjalu oddzialywa molekularnych Rónorodny zakres energetyczny oddzialywa umoliwia taki dobór ukladu separacyjnego, który jest w stanie selektywnie rozdzieli anality o rónej budowie chemicznej, czyli rónice si potencjalem oddzialywa molekularnych. Std, przed przystpieniem do procesu separacyjnego, warto jest scharakteryzowa badane anality pod tym ktem, aby móc dobra jak najkorzystniejszy uklad. Nie jest to zadanie latwe, gdy opisu substancji chemicznej pod ktem jej oddzialywania z otoczeniem dokonuje si przy pomocy kilkunastu parametrów (deskryptorów molekularnych), których wyznaczenie wymaga zastosowania zloonego aparatu chemometrycznego oraz niejednokrotnie dodatkowych eksperymentów. W praktyce jednak, wprowadza si parametry grupowe (zbiorcze), znacznie ulatwiajce prognoz efektywnej separacji. Parametry grupowe opieraj si o zasad liniowoci energii swobodnych, która zaklada, e podobne polczenia chemiczne reaguj podobnie, i e podobne zmiany w strukturze podobnie wplywaj na reaktywno. W myl tej zasady mona z duym przyblieniem obliczy, na podstawie udzialu poszczególnych fragmentów molekularnych w czsteczce, jaka np. bdzie rozpuszczalno badanej substancji w wodzie, jaka bdzie jej prno pary lub, co jest wykorzystywane w technikach separacyjnych, w jakim stopniu badana substancja ulegnie podzialowi pomidzy faz organiczn a faz wodn. Wielkoci charakteryzujc t sklonno nazywa si zwyczajowo lipofilowoci (powinowactwo zwizku chemicznego do fazy lipidowej, tzn. niemieszajcej si z wod), któr oczywicie charakteryzowala bdzie stala podzialu. Przyjto, e rozpuszczalnikami najlepiej odwzorowujcymi uklad faz polarnych i niepolarnych s n-oktanol i woda. Rozpuszczalniki te po zmieszaniu tworz dwie odseparowane fazy, przy czym ze wzgldu na wzajemn czciow rozpuszczalno jest to uklad zawierajcy oktanol nasycony wod (2,3 mol/L) oraz wod nasycon oktanolem (4,5 x10-3 mol/L). Stala podzialu pomidzy tymi fazami, opisywana jako KOW lub wspólczynnik podzialu P, jest wyraana ilorazem dwóch ste substancji rozpuszczonej:

P = K OW =

gdzie:

C okt Cw

(31)

Cokt (mol/L) - stenie molowe substancji w oktanolu, Cw (mol/L) - stenie molowe substancji w wodzie. Eksperymentalnie, wspólczynnik taki wyznacza si w 25oC, przy steniu substancji badanej nie wyszym ni 0.01 mol/L. W takim ukladzie, jeeli wiksza ilo czsteczek badanego zwizku chemicznego znajdzie si w fazie oktanolowej, to mamy do czynienia ze zwizkiem lipofilowym (hydrofobowym). Jeeli za wikszo pozostanie w fazie wodnej, bdzie to zwizek lipofobowy (hydrofilowy). W fazie oktanolowej, dominujcymi s oddzialywania dyspersyjne pomidzy hydrofobowymi fragmentami czsteczki rozpuszczonego zwizku a lacuchem alkilowym n-oktanolu. Poniewa n-oktanol posiada zarówno wlaciwoci lipo- jak i hydrofilowe, wystpuj tam równie oddzialywania dipol-dipol czy wizania wodorowe z grup hydroksylow alkoholu, s one jednak o nieco mniejszym znaczeniu. Cecha zwizku, polegajca na wykazywaniu zarówno wlaciwoci lipofilowych jak i hydrofilowych nazywa si amfifilowoci. T cech n-oktanolu przedstawiono 24

schematycznie na rysunku 8, na którym uwidoczniono wszystkie oddzialywania zachodzce pomidzy oboma rozpuszczalnikami.

OH

H O

HO

H

OH

OH H O H HO

OH HO

H O H OH

Rysunek 8. Oddzialywania midzyczsteczkowe ukladzie n-oktanol : woda W fazie n-oktanolu analit moe oddzialywa z rozpuszczalnikiem poprzez oddzialywania dyspersyjne, ale równie na zasadzie oddzialywa dipol-dipol oraz wiza wodorowych. W fazie wodnej z kolei, wystpowa bd niemal wylcznie wizania wodorowe oraz oddzialywania dipol-dipol pomidzy polarnymi fragmentami czsteczki zwizku rozpuszczonego a wod. Warto wspólczynnika podzialu oktanol ­ woda zaley zarówno od budowy chemicznej czsteczki rozpuszczonego zwizku (liczba i rodzaj rónych grup funkcyjnych, udzial miejsc nienasyconych, fragmentów alkilowych, warto momentu dipolowego i in.) jak i, w duej mierze, od jej wielkoci. W trakcie mieszania obu rozpuszczalników (proces spontaniczny) calkowita entropia takiego ukladu gwaltownie wzrasta, jednak jej uprzywilejowany wzrost jest ograniczany spadkiem entropii w fazie wodnej, zwizanym ze stopniowym uporzdkowywaniem czsteczek wody w otoczce hydratacyjnej solwatowanego zwizku. Poniewa wiksze rozmiary czsteczki wymaga bd coraz wikszej wnki w rozpuszczalniku (wikszej otoczki hydratacyjnej), powodowa to bdzie nieuprzywilejowany spadek entropii calego ukladu. W takiej sytuacji korzystniejsze termodynamicznie staje si obnienie rozpuszczalnoci czsteczek o duych rozmiarach w fazie wodnej, co wplywa na zwikszenie wspólczynnika podzialu. Std te czsteczki, nawet stosunkowo due, ale zawierajce w swojej strukturze uklady nienasycone, rozgalzione i in., ulatwiajce zmniejszenie rozmiaru molekularnego, charakteryzuj si duo niszymi stalymi podzialu od swoich analogów pozbawionych tych cech. Stala podzialu n-oktanol ­ woda mieci si w bardzo szerokim zakresie, od 0,01 dla zwizków o wysokiej polarnoci do 1010 dla substancji wysoce hydrofobowych. Na rysunku 9 przedstawiono zakres wartoci wspólczynnika podzialu P dla wybranych grup zwizków chemicznych. Tak rozpity zakres wartoci wspólczynnika spowodowal, e przyjto wyraa go w formie logarytmicznej:

log P = log Cokt - log c w

(32) 25

Przyjmuje si, i zwizki, których log P jest mniejszy od jednoci, mog by charakteryzowane jako hydrofilowe (liofobowe), zwizki dla których 1 < log P < 3, charakteryzuj si redni lipofilowoci (liofilowoci), natomiast zwizki, których log P > 3, charakteryzuj si wysok lipofilowoci (liofilowoci). Wartoci wybranych wspólczynników podzialu P (log P) przedstawiono w tabeli 2.

Halogenki alkilów C1- C2

Alkilowe pochodne benzenu Chlorobenzeny Polichlorowane bifenyle (PCB) Estry kwasu ftalowego Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne WWA Wglowodory alifatyczne C5 ­ C18

1

102

104

106

108 Wspólczynnik podzialu P

1010

Rysunek 9. Wartoci wspólczynnika podzialu P wybranych grup zwizków chemicznych W pionierskich badaniach Hansha i Leo nad wyznaczeniem stalej podzialu oktanol-woda dla szerokiej gamy zwizków zauwaono, e okrelone fragmenty strukturalne badanych substancji, wnosz kadorazowo do calkowitej wielkoci log P staly wklad, niezaleny od tego, w jakiej czsteczce wystpuj. I tak np. rónica w zlogarytmizowanych wartociach stalych podzialu pomidzy benzenem a toluenem (strukturalnie rónice si obecnoci grupy metylowej) wyniosla 0,55. Podobn rónic zaobserwowano pomidzy lipofilowoci aniliny i metyloaniliny, w których przypadku rónic strukturaln równie stanowi ugrupowanie metylowe. Tabela 2. Wartoci logarytmu wspólczynnika podzialu P dla wybranych substancji chemicznych Zwizek Acetamid Metanol Kwas mrówkowy Eter di etylowy Chlorek metylenu Heksametylobenzen 2,2',4,4',5-Pentachlorobifenyl log P -1,16 -0,82 -0,41 0,83 3,37 4,61 6,41

26

W myl zasady liniowoci energii swobodnych przyjto wic, e niezalenie od miejsca przylczenia grupa metylowa wnosi do calkowitej wartoci log KOW substancji staly udzial w wysokoci ok. 0,55. Z czasem baza danych czstkowych udzialów lipofilowoci zostala rozszerzona o dziesitki ugrupowa funkcyjnych, grup czy pojedynczych atomów, oraz uzupelniona szeregiem poprawek, uwzgldniajcych miejsca przylczenia danej grupy czy atomu, czynniki steryczne, zjawiska elektronowe, geometryczne i in. W tabeli 3 przedstawiono przykladowe wspólczynniki czstkowe wnoszone przez konkretne fragmenty do calkowitej lipofilowoci analitu. Korzystanie z bazy danych pozwala bardzo szybko policzy calkowit lipofilowo substancji chemicznej wylcznie na podstawie jej struktury. Obliczona w ten sposób lipofilowo, wyraona logarytmem ze stalej podzialu, umoliwia prognoz zachowania si analitu w ukladzie separacyjnym. Wspólczenie korzysta si z kilku metod obliczenia log P zgodnie z powysz zasad. Obliczenia dokonuje si wykorzystujc nastpujc zaleno: (33) log P = ai fi + b j F j gdzie: fi - czstkowy udzial fragmentu i, ai - ilo fragmentów i, Fj - czstkowy udzial czynnika strukturalnego j, bj - ilo czynników strukturalnych j. Tabela 3. Wybrane wspólczynniki czstkowe fragmentów i czci struktury molekuly Fragment Alifatyczny ­ CH3 Alifatyczny ­ CH2 Alifatyczny C Aromatyczny C lub ­CH Wodór Cl ­ polczony z alifatycznym fragmentem Cl ­ polczony z aromatycznym fragmentem OH ­ polczony z aromatycznym fragmentem Br ­ polczony z aromatycznym fragmentem Aromatyczny ­ NH2 Czynnik strukturalny Wizanie podwójne Wizanie potrójne Elastyczny lacuch alkilowy o n atomach wgla 2 chlorowce na tym samym atomie wgla 3 chlorowce na tym samym atomie wgla fi 0,5473 0,4911 0,2000 0,2940 0,2300 0,0600 0,6445 -0,4802 0,8900 -0,8540 Fj -0,09 -0,50 (n-1)(-0,12) 0,60 1,59

Ograniczeniem tych metod jest dzi wielko analizowanej czsteczki. Metoda obliczeniowa sprawdza si bardzo dobrze dla malych czsteczek, natomiast w przypadku zwizków wielkoczsteczkowych dochodzi do dodatkowych efektów zwizanych z objtoci molekuly, co wprowadza dodatkowe oddzialywania w ukladzie, niemoliwe do przewidzenia tym prostym modelem.

27

Metody obliczeniowe lipofilowoci koreluj bardzo dobrze z wielkociami retencji (czasem przebywania w rozdzielajcym ukladzie chromatograficznym) zwizków o redniej i wysokiej hydrofobowoci. Poniej podano przyklad obliczenia teoretycznej wartoci logarytmu ze stalej podzialu KOW trichloroetanu (CCl3-CH3). Do równania (33) naley wprowadzi:

· ·

sum udzialów fragmentów: 2 x (wgiel alifatyczny) + 3 x (wodór) + 3 x (chlor), oraz sum udzialów czynników strukturalnych: 1 x (elastyczny lacuch alkilowy o 2 atomach wgla) + 1 x (3 chlorowce na jednym atomie wgla). log P = 2 · (0,20) + 3 · (0,23) + 3 · (0,06) + 1 · (-0,12) + 1 · (1,59) = 2,50

Warto stalej podzialu wyznaczona eksperymentalnie dla trichloroetanu (CCl3-CH3) wynosi dla 2,49. Na rysunku 10 przedstawiono korelacj lipofilowoci wybranych wglowodorów alifatycznych i aromatycznych z ich wartociami retencji, otrzymanymi przy uyciu chromatografii cieczowej w odwróconym ukladzie faz. Dla przedstawionej na rysunku wybranej grupy zwizków zaleno ta jest niemal idealnie liniowa, co wskazuje, i dominujcym parametrem decydujcym o zatrzymywaniu tych analitów w danym ukladzie chromatograficznym jest lipofilowo. Istotnie, w chromatografii w odwróconym ukladzie faz parametr ten jest najlepszym deskryptorem retencji (zatrzymywania w ukladzie).

Rysunek 10. Zaleno lipofilowoci wybranych substancji od chromatograficznego czasu retencji

28

3. Literatura

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Boethling, R. S.; Mackay, D. Handbook of Property Estimation Methods for Chemicals; Environmental and Health Sciences; Lewis Publishers: Boca Rota, 2000. Dutkiewicz, E. Fizykochemia powierzchni; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1998. Giddings, J. C. Unified separation science; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1991. Hammett, L. P. Fizyczna chemia organiczna; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 1970. Kaliszan, R. Structure and retention in chromatography. A chemometric approach; Harwood Academic Publisher: Amsterdam, 1997. Schwarzenbach, R. P.; Gschwend, P. M.; Imboden, D.M. Environmental organic chemistry; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1993. Witkiewicz, Z. Podstawy chromatografii; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2000.

29

II. Ekstrakcja

1. Wstp

Klasyczna ekstrakcja jest sposobem wyodrbniania poszczególnych substancji lub grup zwizków chemicznych poprzez rozpuszczanie ich w rozpuszczalniku i oddzielenie ich w postaci roztworu od pozostalych skladników próbki. W przypadku próbek cieklych ekstrakcja jest przenoszeniem wybranych skladników z roztworu próbki (matrycy pierwotnej) do roztworu w innej cieczy (matrycy wtórnej zwanej te matryc odbierajc). Gdy próbka jest cialem stalym, ekstrakcja polega na rozpuszczeniu wybranych skladników w cieczy i oddzieleniu roztworu od pozostalych, nierozpuszczalnych skladników matrycy. Przenoszenie skladników z fazy stalej do cieklej nazywa si lugowaniem lub roztwarzaniem, ale te terminy uywa si zwykle do wydzielania (powizanego czsto z rozkladem próbki) zwizków nieorganicznych z próbek stalych (np. gleby czy stopu metali) za pomoc roztworów kwasów, zasad, soli oraz zwizków chelatujcych i innych. We wspólczesnych technikach ekstrakcji, jako matryc odbierajc stosuje si równie gaz, plyn w stanie nadkrytycznym lub cialo stale.

Ekstrakcj stosuje si z dwóch zasadniczych powodów: · dla wyodrbnienia grupy lub poszczególnych zwizków chemicznych z ich pierwotnej matrycy, · dla uzyskania odpowiedniego stenia wyodrbnianych zwizków (zatenia), umoliwiajcego zastosowanie odpowiedniej techniki instrumentalnej w analizie ilociowej, szczególnie w analizie zwizków wystpujcych w ilociach ladowych. Wyodrbnianie moe dotyczy substancji podstawowej, np. produktu reakcji, biologicznie czynnych zwizków zawartych w surowcach rolinnych albo substancji zanieczyszczajcych dany roztwór czy inn próbk. Ekstrakty to anality i zwizki ekstrahujce si razem z nimi, w nowej matrycy, któr jest zwykle rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników o znanym skladzie. Sklad chemiczny ekstraktu jest zdecydowanie prostszy od skladu matrycy pierwotnej. Rozpuszczalniki organiczne, bdce matryc odbierajc, mona latwo odparowa, bez straty ekstraktu oraz s zwykle odpowiednie do zastosowania w technikach analizy kocowej, np. w chromatografii. Substancje obecne w ekstrakcie obok analitu mog powodowa zaklócenia (interferencje) w oznaczaniu, jednak jest ich, w stosunku do analitu, zdecydowanie mniej ni w próbce pierwotnej.

30

Proces lub operacja zwikszajca stosunek ste lub iloci analitów (mikroskladników) wzgldem matrycy (makroskladników) w badanej próbce nazywa si wzbogacaniem (definicja przyjta przez IUPAC). Ekstrakcja jest jedn z metod wzbogacania analitów.

Do oceny ilociowej procesu ekstrakcji sluy wielko nazwana procentem ekstrakcji (%E). Jest to stosunek masy substancji ekstrahowanej, znajdujcej si w matrycy odbierajcej po ekstrakcji (A) do masy substancji ekstrahowanej, znajdujcej si w matrycy pierwotnej przed ekstrakcj (A):

%E =

( A) ( A)

100%

(1)

Jeli substancja ekstrahowana nie znajduje si w takiej samej postaci w obu matrycach ( bo ulega np. dysocjacji, hydratacji lub hydrolizie) naley uwzgldni masy wszystkich form substancji ekstrahowanej, wystpujce w matrycy odbierajcej [(A)] oraz masy wszystkich form substancji ekstrahowanej, wystpujce w matrycy pierwotnej [(A) ]:

%E =

( A) 100% ( A)

(2)

2. Podzial technik ekstrakcyjnych

Kryterium podzialu technik ekstrakcyjnych s stany skupienia próbki oraz medium ekstrahujcego (ekstrahenta). Technika ekstrakcji ciala stalego róni si od techniki ekstrakcji cieczy czy gazu. W tradycyjnej ekstrakcji matryc odbierajc jest ciecz natomiast nowoczesne techniki ekstrakcyjne s czsto bezrozpuszczalnikowe, gdzie matryc odbierajc jest gaz lub cialo stale. Nazywajc technik ekstrakcji naley przyj stal kolejno wymieniania faz, tak by mówic o ekstrakcji typu cialo stale ciecz i ciecz - cialo stale bylo oczywiste, która faza jest ekstrahentem. Logicznym wydaje si wymienia w pierwszej kolejnoci stan skupienia fazy zawierajcej substancj przed ekstrakcj, czyli próbki, natomiast stan skupienia fazy zawierajcej substancj po ekstrakcji (ekstrahenta), jako drug i taki sposób przyjto w niniejszym opracowaniu. Na rysunkach 1, 2 i 3 przedstawiono podzial technik ekstrakcyjnych stosowanych do próbek o rónym stanie skupienia. Wybór techniki ekstrakcji zaley od wlaciwoci fizyko-chemicznych substancji ekstrahowanych i matrycy, a take kocowego celu stosowanego procesu. Wlaciwoci analitu o podstawowym znaczeniu jest jego rozpuszczalno w ekstrahencie. Poza tym naley bra pod uwag posta fizyczn analitu, jego lotno, zdolno do sublimacji, odporno termiczn, odporno na dzialanie promieniowania UV czy zdolno do sorpcji na powierzchni. Wlaciwoci analitu i matrycy warunkuj te dobór parametrów wybranej techniki ekstrakcji, takich jak: temperatura, rodzaj i moc oddzialywa fizycznych (cinienia, ultradwików czy promieniowania mikrofalowego), intensywnoci mieszania, itp. Wybór techniki ekstrakcji zaley od tego czy celem ma 31

by wyodrbnienie pojedynczej substancji czy okrelonej grupy zwizków chemicznych, czy wyodrbnianie przeprowadza si na skal preparatywn czy analityczn. Sposób ekstrakcji zaley od poziomu ste analitu w matrycy, jak równie od tego, czy kocowa analiza jest identyfikacj skladników ekstraktu i/lub oznaczeniem ilociowym jego skladu. Sposób ekstrakcji musi by dostosowany do wymogów techniki analizy kocowej.

Ekstrakcja gaz ­ ciecz Ekstrakcja próbek gazowych

Ekstrakcja do fazy cieklej Ekstrakcja przez blony pólprzepuszczalne

Ekstrakcja do fazy stacjonarnej Ekstracja gaz ­ cialo stale

Mikroekstrakcja do fazy stalej

Ekstrakcja przez membrany porowate Rysunek 1. Sposoby ekstrakcji próbek gazowych

Kierunkiem rozwoju wspólczesnych technik ekstrakcyjnych s zasady ,,zielonej chemii", w tym chemii analitycznej. Podstawowymi cechami ,,zielonej chemii analitycznej" s: ograniczenie zuycia odczynników chemicznych, zwlaszcza rozpuszczalników organicznych, lub ich eliminacja, · niestosowanie odczynników toksycznych dla czlowieka i rodowiska naturalnego, · ograniczenie emisji par i gazów, cieków i odpadów stalych, powstajcych w wyniku procesu analitycznego, · zmniejszenie nakladu pracy i zuycia energii w procesie analitycznym. Powysze wymogi spelnia wiele wspólczesnych technik ekstrakcji, jak ekstrakcja do fazy stalej lub gazowej. W ekstrakcji ciecz znalazly zastosowanie nowe ekstrahenty, takie jak: plyn w stanie nadkrytycznym, woda w stanie podkrytycznym czy ciecze jonowe.

·

Techniki ekstrakcyjne umoliwiajce automatyzacj procesu lub oznaczanie kilku substancji w jednej próbce zmniejszaj zuycie energii i pracy w przeliczeniu na analit.

32

Statyczna analiza fazy nadpowierzchniowej Dynamiczna analiza fazy nadpowierzchniowej Dynamiczna analiza fazy gazowej nad filmem Wymywanie i wychwytywanie Klasyczna ciecz - ciecz Techniki ekstrakcji próbek cieklych Ekstracja cigla Ekstrakcja ciecz - ciecz Mikroekstracja Mikroekstracja do pojedynczej kropli Mikroekstracja poprzez membran Ekstrakcja do fazy stalej Mikroekstrakcja do fazy stalej Ekstrakcja poprzez sorbent pokrywajcy powierzchni mieszadelka magnetycznego Ekstrakcja ciecz ­ cialo stale Mikroekstrakcja poprzez membran do fazy stacjonarnej Metoda ograniczonego dostpu do fazy stalej Ekstrakcja wykluczenia na sorbentach o powinowadztwie immunologicznym Ekstrakcja do sorbentów z nadrukiem molekularnym Ekstrakcja do fazy stalej w strzykawce

Ekstrakcja ciecz - gaz

Rysunek 2. Sposoby ekstrakcji próbek cieklych

33

Ekstrakcja do fazy stalej w ukladzie statycznym Ekstrakcja cialo stale gaz Ekstrakcja do fazy stalej w ukladzie dynamicznym Ekstrakcja strumieniem gazu z desorpcj termiczn Ektrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie Techniki ekstrakcji próbek stalych Ekstrakcja strumieniem rozpuszczalnika Ekstrakcja w aparacie Soxhleta Homogenizacja próbki z rozpuszczalnikiem Ekstrakcja wieloetapowa (sekwencyjna) Zmydlanie (saponifikacja) Ekstrakcja cialo stale ciecz Metody klasyczne

Metody klasyczne ­ wspomagane

Ultradwikami, sonikacja

Promienowaniem mikrofalowym

Przyspieszona ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika Ekstrakcja rozpuszczalnikiem pod zwikszonym cinieniem Ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana promieniowaniem mikrofalowym Ekstrakcja plynem w stanie nadkrytycznym

Nowoczesne metody ekstrakcji

Rysunek 3. Sposoby ekstrakcji próbek stalych

34

3. Ekstrakcja próbek gazowych

3.1. Ekstrakcja w ukladzie gaz ­ ciecz Ekstrakcja próbek gazowych ciecz (ang. gas liquid extraction, GLE) polega na podziale izolowanych z próbki analitów gazowych do cieczy, pod warunkiem, e s one w niej calkowicie rozpuszczalne lub rozpuszczalne czciowo, ale w wikszym stopniu ni pozostale skladniki próbki. Mieszanin gazow (próbk) przepuszcza si przez okrelony rozpuszczalnik. W trakcie tego procesu rozpuszczalne skladniki próbki s absorbowane i sklad mieszaniny gazowej opuszczajcej ciecz jest inny ni sklad mieszaniny wejciowej. Proces podzialu zachodzi w calej objtoci cieczy. Przenoszenie mas polega na dyfuzji czsteczek substancji w obu fazach (gazowej i cieklej) poprzez warstw graniczn, wywolanej rónic stenia substancji w obu fazach. Rónica ste skladnika absorbowanego jest sil napdow dyfuzji, im wiksza rónica ste tym wiksza szybko dyfuzji. W plynie nieruchomym jest to dyfuzja czsteczkowa, przy przeplywie cieczy - dyfuzja burzliwa. Przenikanie (podzial) czsteczek substancji przez warstw graniczn, czyli stref przylegl do powierzchni midzyfazowej i poprzez powierzchni midzyfazow (granic faz) zaley od szybkoci przenikania i jest tym wiksze im wiksza jest powierzchnia midzyfazowa. Zwikszenie powierzchni midzyfazowej uzyskuje si przez mieszanie, zastosowanie belkotki lub rozpylanie, a take przez rozpraszanie na wypelnieniach o rónych ksztaltach. Etap dyfuzji mona wydluy, stosujc odpowiedni czas ekstrakcji. T metod ekstrakcji gazu stosuje si do próbek o steniu analitu rzdu kilku procent lub niszych, pod warunkiem, e ekstrahowany gaz bardzo dobrze rozpuszcza si w cieczy ekstrahujcej. Ciecz (medium ekstrahujce) nazywa si absorbentem, skladnik gazowy ekstrahowany z próbki gazowej ­ absorbatem, urzdzenie, w którym zachodzi absorpcja nazywa si za absorberem. Proces podzialu sklada si tu z trzech etapów: przenoszenia masy z fazy gazowej do powierzchni cieczy, rozpuszczenia w warstwie granicznej i przenoszenia masy z warstwy granicznej w glb cieczy. Szybko przenoszenia masy do granicy faz po obu stronach zaley od szybkoci dyfuzji czsteczkowej i burzliwej. Rozpuszczanie w warstwie granicznej wie si z oporami wnikania mas po obu stronach granicy. Przyczyn oporów jest bariera fizyczna i hydrodynamiczna. Barier fizyczn stwarzaj czsteczki, które blokuj dostpno powierzchni midzyfazowej do wnikania gazu. Z kolei barier hydrodynamiczn stwarza napicie powierzchniowe cieczy, które utrudnia ruch w strefie przyleglej do powierzchni midzyfazowej. W nieruchomej warstwie cieczy o przenoszeniu masy decyduje dyfuzja czsteczkowa. Gazy slabo rozpuszczaj si w cieczach w warunkach normalnych w porównaniu z innymi substancjami, a ich rozpuszczalno maleje wraz ze wzrostem temperatury. Oddzialywania midzyczsteczkowe gaz ­ ciecz (solwatacja) s slabe z powodu niewielkiej polarnoci gazów, a niewielki wzrost temperatury powoduje ich ulatnianie si (zwikszenie entropii lotnych zwizków nie wymaga duych nakladów energii).

35

W ukladach rozcieczonych gaz - ciecz w stanie równowagi, matematyczn zaleno stenia gazu pochlanianego w cieczy i jego cinienia podaje prawo Henry'ego (prawo Henry'ego nie obowizuje, gdy gazy wchodz w reakcje chemiczne lub ulegaj dysocjacji):

p A = H cA

(3)

gdzie: pA- równowagowe cinienie gazu pochlanianego (cinienie czstkowe tego gazu nad roztworem nasyconym), cA- równowagowe stenie gazu w cieczy (roztwór nasycony), H- stala Henry'ego. Z równania Henry'ego wynika, e rozpuszczalno gazu w cieczy bdzie tym wysza im wysze cinienie w ukladzie. Warto stalej Henry'ego zaley od temperatury, i wzrasta wraz z jej wzrostem, zatem wzrost temperatury zmniejsza rozpuszczalno gazu. W stanie równowagi szybko absorpcji skladnika gazowego w cieczy równa jest szybkoci jego desorpcji z cieczy. Czas osigania równowagi jest dlugi i w praktyce, podczas ekstrakcji, nieosigany. 3.1.1. Ekstrakcja membranowa przez blony pólprzepuszczalne Do oczyszczania lub rozdzielania gazów stosuje si równie membrany pólprzepuszczalne zwane zwartymi. Material, z którego wykonana jest blona pólprzepuszczalna zachowuje si jak ciecz, w której rozpuszczaj si i dyfunduj skladniki gazu. Motorem separacji skladników gazu jest rónica ich cinie czstkowych po obu stronach membrany. Efekt rozdzielania zaley od selektywnoci materialu membrany oraz rozpuszczalnoci skladników gazu w membranie i od wartoci ich wspólczynników dyfuzji, które mona modyfikowa warunkami przeprowadzania ekstrakcji, jak temperatur i cinieniem. Schemat procesu separacji przez membran pólprzepuszczaln przedstawiono na rysunku 8.

Mieszanina gazów do rozdzielenia o steniu analitu(c1), tzw. strefa zasilania

Membrana o gruboci L i przekroju poprzecznym A

Analit (po przejciu przez membran zw. permeatem) o steniu c2 w strefie permeatu

Kierunek dyfuzji

Rysunek 8. Schemat separacji przez membran pólprzepuszczaln

36

Przenoszenie masy przez membran pólprzepuszczaln opisywane jest równaniem dyfuzji Ficka i równaniem Henry'ego. Pierwsze dotyczy transportu masy podczas dyfuzji skladnika, wywolanej rónic jego ste po obu stronach membrany:

J = AD c L

(4)

gdzie:

­ szybko dyfuzji wyraana strumieniem molowym (objtociowym) skladnika, [cm3/cm2 s], - rónica ste skladnika midzy stron zasilania a stron permeatu (c1 ­ c2), - grubo membrany [cm], A ­ poprzeczny przekrój strefy dyfuzji, D ­ wspólczynnik dyfuzji analitu w materiale membrany. W polczeniu z równaniem Henry'ego, zaleno przyjmuje posta:

J= QA( p1 - p 2 ) L

(5)

z której wynika, e dla okrelonego analitu i materialu membrany, o wymiarach membrany decyduje rónica cinie po obu jej stronach, a szczególnie cinienie permeatu. Membrany zwarte s wykonywane z polimerów, ze szkla kwarcowego, materialów ceramicznych i metali. Polimery nie maj duej selektywnoci i nie s wytrzymale na wysokie temperatury, s za to zdecydowanie tasze od pozostalych. Wród polimerów najwikszym zastosowaniem ciesz si membrany wykonane z gumy silikonowej. Membrany zwarte ceramiczne lub metalowe mog by jednofazowe lub dwufazowe, jak spieki ceramiczno-metalowe, tzw. cermety. Ekstrakcj membranow przez blony pólprzepuszczalne stosuje si w przemyle i w laboratoriach analitycznych. W przemyle membrany stosowane s do rozdzielania takich mieszanin, jak: tlen ­ azot, wodór ­ wglowodory, wodór ­ tlenek wgla, wodór ­ azot, ditlenek wgla ­ wglowodory, para wodna wglowodory, siarkowodór ­ wglowodory, hel ­ wglowodory, hel ­ azot, wglowodory ­ powietrze w procesach wzbogacania, osuszania, oczyszczania, wydzielania i odzyskiwania. W analityce gazów stosowane s urzdzenia wykorzystujce ekstrakcj membranow. S to permeacyjne osuszalniki strumienia gazów, dozymetry permeacyjne, denudery permeacyjne, dozowniki w spektrometrach mas, umoliwiajce wprowadzenie próbki gazowej do komory jonizacyjnej, separatory membranowe do przenonych spektrometrów mas. 3.2. Ekstrakcja w ukladzie gaz ­ cialo stale Rozdzielanie na sorbentach stalych moe odbywa si wg rónych mechanizmów: poprzez adsorpcj fizyczn, adsorpcj chemiczn, kondensacj kapilarn i in. (por. rozdz. II.3.1.2). Adsorpcja fizyczna polega na zatrzymywaniu skladników gazu na powierzchni zewntrznej i wewntrznej (w porach) adsorbentu, w wyniku oddzialywa midzyczsteczkowych bliskiego zasigu, jak sily Van der Waalsa czy wizania wodorowe. W wyniku tych oddzialywa najlatwiej adsorbuj si czsteczki gazów o duej masie czsteczkowej i niskiej temperaturze wrzenia. Podczas gdy male czsteczki gazu maj mniejsz energi wizania z adsorbentem. Wtrakcie procesu adsorpcji czsteczki silniej wice si z adsorbentem wypieraj te, slabiej zwizane. Poniewa adsorpcja nastpuje na skutek oddzialywa bliskiego zasigu miedzy czsteczkami 37

skladników gazu a czsteczkami powierzchni adsorbentu, ilo zaadsorbowanych czsteczek jest ograniczona i adsorpcja fizyczna zachodzi do momentu calkowitego wykorzystania przez analit powierzchni zewntrznej i wewntrznej sorbentu. Dlatego wan cech adsorbentu jest jego powierzchnia wlaciwa. Rozrónia si dwa rodzaje powierzchni wlaciwej: powierzchnia wlaciwa ziaren adsorbentu i powierzchnia wlaciwa zloa adsorbentu. Powierzchnia wlaciwa ziaren adsorbentu, zwana te powierzchni adsorpcyjn, jest to stosunek calkowitej powierzchni zewntrznej ziaren (granulek) i powierzchni porów do masy ziarna. Powierzchnia wlaciwa wyraana jest zwykle w m2/g. Na wielko i kinetyk adsorpcji ma równie wplyw struktura porów adsorbentu, okrelana calkowit objtoci porów i struktur porów. Calkowita objto porów sklada si z objtoci wlaciwej wszystkich rozmiarów porów (makroporów, mezoporów i mikroporów, patrz rozdzial: Ekstrakcja membranowa przez membrany porowate) i wyraana jest w cm3/g adsorbentu. Struktur porów okrela: ksztalt powierzchni bocznej porów, ksztalt przekroju poprzecznego porów (jest zmienny wzdlu jego dlugoci), profil porów w przekroju podlunym, krto porów, rodzaje polcze porów (obustronnie i jednostronnie otwarte), uporzdkowanie lub nieuporzdkowanie porów (poloenie), polczenie elementów zloa adsorbentu (sztywny szkielet lub oddzielne, przylegajce do siebie elementy). Od struktury porów zaley droga migracji czstek analitu, tym samym szybko adsorpcji. Powierzchnia wlaciwa zloa adsorbentu jest potrzebna do obliczania transportu masy substancji z gazu do powierzchni adsorbentu. Powierzchni wlaciw zloa adsorbentu oblicza si na podstawie masy pojedynczego ziarna i gstoci nasypowej zloa, po uwzgldnieniu ksztaltu ziarna. Charakterystyk najczciej stosowanych adsorbentów przedstawiono w tabeli 1. W przypadku adsorpcji chemicznej, oddzialywanie czsteczek adsorbatu z czsteczkami powierzchni adsorbentu zwizane jest z przejciem elektronów, w wyniku tego energia wizania czsteczek na powierzchni jest tak dua, e zaadsorbowana substancja moe by desorbowana tylko w postaci zwizku chemicznego lub usunita jak substancja stala.

Przy doborze adsorbentu do rozdzielania mieszanin gazowych naley uwzgldni:

· · · · · ·

charakter chemiczny izolowanych substancji, charakter chemiczny adsorbentu odpowiadajcy wlaciwociom rozdzielanych gazów, pojemno sorpcyjn adsorbentu (odpowiednia powierzchnia wlaciwa, wielko porów), metod desorpcji analitu z sorbentu, czysto adsorbentu, trwalo analitu na wybranym sorbencie (moliwo zmian chemicznych analitu).

Proces adsorpcji sklada si z trzech glównych etapów (por. rozdz. II.3.2.1.)

·

wdrówka adsorbatu do zewntrznej powierzchni adsorbentu, polegajca na dyfuzji czstek gazu w fazie gazowej ­ dyfuzja zewntrzna,

38

· ·

dyfuzja adsorbatu w porach w kierunku powierzchni wewntrznej porów ­ dyfuzja wewntrzna, kondensacja czsteczek adsorbatu na powierzchni porów ­ wlaciwy proces adsorpcji.

Proces adsorpcji moe przebiega w rónych warunkach: gaz poddawany adsorpcji moe by jedno- lub wieloskladnikowy, adsorpcji ma ulega jeden lub kilka skladników gazu, adsorpcja moe by prowadzona statycznie lub dynamicznie, zloe adsorbentu moe by nieruchome lub ruchome itd. Warunki adsorpcji maj zdecydowany wplyw na jej calkowit szybko oraz szybko poszczególnych jej etapach. Calkowit szybko adsorpcji wyraa si przyrostem iloci adsorbujcej si substancji [jednostka masy] w jednostce czasu. Adsorpcja moe by prowadzona w sposób statyczny lub dynamiczny. W sposobie statycznym, ruch czsteczek gazu w kierunku fazy stacjonarnej jest swobodny (dyfuzja molekularna). Statyczna adsorpcja stosowana jest w analityce, do pobierania próbek gazowych (dozymetry pasywne). Stosowanie metody statycznej nie wymaga urzdze do zasysania gazu ani pomiaru jego objtoci. Adsorpcja dynamiczna polega na przepuszczaniu strumienia gazu przez adsorbent. Jest czsto stosowana w analityce do oznaczanie organicznych skladników gazowych. Wymaga zasysania gazu przez sorbent (np. przez rurk sorpcyjn wypelnion zloem sorbentu stalego lub kilku warstw rónych sorbentów) oraz pomiaru objtoci zasysanego gazu. W przemyle procesy adsorpcyjne przeprowadza si metodami dynamicznymi, najczciej na zlou nieruchomym, rzadziej ruchomym czy fluidalnym. Zatrzymane na adsorbencie skladniki musza by uwalniane ­ desorbowane. Przy rozdzielaniu mieszanin gazowych, proces desorpcji jest zwizany z procesem adsorpcji. Rozdzielanie adsorpcyjne mieszanin gazowych mona przeprowadza dwoma sposobami:

·

·

metod adsorpcji zmienno-temperaturowej, polegajcej na adsorpcji w niskiej temperaturze (adsorpcja jest procesem egzotermicznym, odprowadzanie ciepla zwiksza wydajno), desorpcji i regeneracji adsorbentu w podwyszonej temperaturze, metod adsorpcji zmienno-cinieniowej (,,metoda bezgrzewcza"), polegajcej na adsorpcji w podwyszonym cinieniu, a desorpcji i regeneracji przy obnionym cinieniu.

W skali laboratoryjnej stosowana jest równie desorpcja przez plukanie zloa gazem obojtnym, wypieranie zaadsorbowanego gazu innym, nieadsorbujcym si na sorbencie oraz desorpcja rozpuszczalnikiem (ekstrakcja). 3.2.1. Ekstrakcja gazów przez membrany porowate Do selektywnego rozdzielania skladników mieszanin gazowych (gazów i par) stosuje si równie klasyczne membrany porowate. Ze wzgldu na rednic porów membrany dzieli si na:

· · ·

mikroporowate, o rednicy porów mniejszej ni 2 nm, mezoporowate (membrany o porach przejciowych), o rednicy od 2 nm do 50 nm, makroporowate, o rednicy porów wikszej ni 50 nm.

Podstaw separacji na membranach porowatych jest proces selektywnej adsorpcji skladników mieszanin gazowych na powierzchni i wewntrz porów oraz na mechanizmie wykluczania.

39

Tabela. 1. Charakterystyka najczciej stosowanych adsorbentów wg klasyfikacji Kisielewa* specyficzny dodatni

Adsorbent

Wlaciwoci fizyczne

Sklad chemiczny i wlaciwoci chemiczne SiO2 (99,71%) + Fe2O3, Al2O3,TiO2, Na2O, CaO, ZrO2 polarny, kwany, o duej pojemnoci sorpcyjnej Al2O3 (92%) + H2O, Na2O, SiO2, Fe2O3,TiO2, polarny, kwany

Zastosowanie

ele krzemionkowe

Wskoporowe (red. 1,5 nm), pow. wl. 550÷700 m2/g szerokoporowe (red.6 nm), pow. wl. 400÷530 m2/g Powierzchnia wlaciwa ­ 200÷250 m2/g

Osuszanie gazów, usuwanie polarnych zanieczyszcze organicznych, np. alkoholi, fenolu, chlorofenoli, chlorobenzenów, amin aromatycznych i alifatycznych Usuwanie zwizków polarnych: alkoholi, glikoli, aldehydów , ketonów itp., osuszania powietrza, oczyszczanie z lotnych zwizków fluoru Usuwanie z powietrza par zwizków organicznych, usuwanie SO2 z gazów spalinowych Osuszanie wodoru, powietrza, gazów szlachetnych, usuwanie NH3,H2S,SO2,CO2, n-alkany, dieny, etyloamina, benzen, naftalen, proste zwizki heterocykliczne, chlorowcowglowodory Usuwanie zanieczyszcze organicznych, kwasów i zasad organicznych, fenoli, zwizków organicznych z wieloma grupami funkcyjnymi

Tlenek glinu (aluminoel)

specyficzny dodatni

Wgle aktywne

Sorbent czsteczkowy (zeolit)

Dua porowato, posiadaja makro-, mezo-, mikropory, pow. wl. ­ 700÷1200 m2/g Dua porowato, pory jednorodne o redn.0,3÷1,1nm, pow. wl. ­ 700÷1100 m2/g

Nazwy handlowe: Wgiel N, Wgiel A, Carbosorbit, Carbopol ZO-4, Glinokrzemiany metali jedno- i dwuwartociowych, sita molekularne, typ A, X, Y, polarne,

niespecyfic zny niepolarny

specyficzny dodatni

Polimery porowate

Dua porowato, wskoporowate, pow. wl. kilkaset m2/g

Polimery porowate

Dua porowato, wskoporowate, pow. wl. kilkaset m2/g

Niepolarne, niespecyficzne: XAD-2, XAD-4, Porapak(P,Q), Chromosorb (101, 102) Polarne, Chromosorb 104,Vinylosorb N, XAD11, Amberlite IRC-50 XAD-2, XAD-4, Porapak(P,Q), Chromosorb (101, 102) Chromosorb 104,Vinylosorb N, XAD11, Amberlite IRC-50

specyficzny ujemny

Usuwanie zanieczyszcze organicznych, kwasów i zasad organicznych, fenoli, zwizków organicznych z wieloma grupami funkcyjnymi

Niepolarny niespecyficzny lub specyficzny ujemny

*klasyfikacja chemicznego charakteru powierzchni wg Kisielewa: niespecyficzne (niepolarne, neutralne i hydrofobowe, na powierzchni nie znajduj si jony ani grupy funkcyjne), specyficzne dodatnie (polarne, na powierzchni znajduj si skupione ladunki dodatnie), specyficzne ujemne (polarne, na powierzchni znajduj si rozloone ladunki ujemne).

40

Adsorpcj nazywa si zjawisko zmian stenia substancji na powierzchni styku fazy stalej z faz gazow lub ciekl (por. roz. I.2.2.). Zmiany stenia (sorpcja) nastpuj w wyniku reakcji zachodzcej na powierzchni ciala stalego (adsorpcja chemiczna) lub w wyniku oddzialywa midzyczsteczkowych (sil Van der Waalsa), wystpujcych w glbi fazy stalej oraz sil adhezji, skierowanych prostopadle do powierzchni styku faz (adsorpcja fizyczna). Wydajno adsorpcji wzrasta ze wzrostem powierzchni wlaciwej sorbentu. Adsorpcja jest procesem egzotermicznym, wic wydajno ekstrakcji na membranie porowatej wzrasta wraz z obnieniem temperatury. Natomiast proces odwrotny, czyli desorpcja wymaga doprowadzenia energii. Mechanizm wykluczania polega na dyfuzji przez membran tych molekul, których rozmiary odpowiadaj rednicy porów. Udzial poszczególnych procesów zaley od wielkoci porów. W makroporach membran adsorpcja zachodzi w niewielkim stopniu, slu one glównie do transportu adsorbowanych substancji na powierzchni membrany do porów o mniejszych rednicach. Na powierzchni porów przejciowych zachodzi adsorpcja, a zaadsorbowane molekuly maj du mobilno, gdy sily adsorpcyjne wystpuj w niewielkiej odlegloci od cian porów. Adsorpcja na powierzchni mezoporów moe by mono- lub polimolekularna. Wewntrz porów przejciowych moliwa jest równie kondensacja kapilarna. Wykroplenie si skladnika w kapilarze jest etapem separacji od trwalych skladników gazowych. Membrany o mikroporach, porównywalnych z rozmiarami czsteczek maj najwiksz selektywno, wynikajc z moliwoci doboru rozmiarów porów i doboru ich charakteru chemicznego. Poza tym, w mikroporach zachodzi wiele zjawisk, jak: dyfuzja molekularna, dyfuzja Knudsena, dyfuzja powierzchniowa, kondensacja kapilarna, oddzialywania miedzy dyfundujcymi molekulami oraz wykluczanie molekul, dziki którym membrany mikroporowate osigaj wysok selektywno. Ogólny schemat dzialania membrany porowatej przedstawiono na rysunek 9. Rozdzielanie na membranie porowatej sklada si z trzech etapów:

· ·

·

wdrówka adsorbatu do zewntrznej powierzchni adsorbentu, polegajcy na dyfuzji czstek gazu w fazie gazowej ­ dyfuzja zewntrzna, dyfuzja adsorbatu w porach w kierunku powierzchni wewntrznej porów ­ dyfuzja wewntrzna (prdko dyfuzji w porach zaley w duej mierze od stosunku redniej rednicy porów (r) do redniej drogi swobodnej czsteczek adsorbatu () i równie decyduje o szybkoci calego procesu; gdy r >> , to transport wewntrz porów w fazie gazowej odbywa si w wyniku dyfuzji molekularnej, czyli swobodnych ruchów czsteczek, gdy >> r, szybko dyfuzji zaley o ciaru czsteczkowego gazu i rednicy porów i nosi nazw dyfuzji knudsenowskiej), kondensacja czsteczek adsorbatu na powierzchni porów ­ wlaciwy proces adsorpcji.

Czsteczki o odpowiednich rozmiarach, nieulegajce adsorpcji dyfunduj przez pory membrany w kierunku mniejszego stenia. Membrany porowate wykonuje si z polimerów organicznych, materialów ceramicznych, metali, szkla kwarcowego i rzadziej z wgla. Nowe technologie produkcji membran pozwalaj otrzymywa membrany w postaci cienkiej warstwy zeolitów, krzemionki, tlenku tytanu, wglika

41

krzemu i wgla, naniesionej na nieorganiczne membrany makro- i mezoporowate. Membrany mog mie ksztalt plaskiej folii, kapilary lub wydronego, porowatego wlókna kapilarnego.

Prdko dyfuzji Zasilanie, p1 Permeat, p2

Rozmiar porów

Grubo membrany Rysunek 9. Zasada dzialania membrany porowatej Ekstrakcja za pomoc adsorpcji na membranach porowatych umoliwia usuwanie z gazu wielu substancji jednoczenie, szczególnie organicznych oraz oczyszczanie duych strumieni gazów o malym steniu zanieczyszcze. 3.2.2. Mikroekstrakcja do fazy stalej Mikroekstrakcja do fazy stalej (ang. solid phase microextraction, SPME) polega na sorpcji mikroiloci zwizków organicznych w cienkiej, cylindrycznej warstwie fazy stacjonarnej, pokrywajcej wlókno szklane lub kwarcowe. SPME zostala zastosowana po raz pierwszy w Kanadzie w 1989 roku przez naszego rodaka Janusza Pawliszyna z Uniwersytetu w Waterloo. Mikroekstrakcja do fazy stalej znalazla szybko szerokie zastosowanie w analityce zwizków organicznych z próbek gazowych, cieklych lub ekstraktów z próbek stalych. Cztery lata póniej firma Supelco wprowadzila na rynek strzykawki do mikroekstrakcji do fazy stalej. Wlókno z sorbentem znajduje si w rurce ze stali nierdzewnej, a calo mieci si w igle umocowanej w uchwycie, przypominajcym strzykawk do chromatografii gazowej (rysunek 10a). Uchwyt umoliwia dwa poloenia wlókna: wewntrz i na zewntrz rurki. W trakcie ekstrakcji wlókno moe by umieszczone (zanurzone) bezporednio w cieklej próbce (ang. direct immersion, DI-SPME), lub w gazowej fazie nadpowierzchniowej nad ciekl lub stal próbk (ang. head space, HS-SPME), rysunek 10b i c. Po okrelonym czasie ekstrakcji, wlókno chowane jest do igly. Ekstrakt, po zamkniciu koca igly np. uszczelk chromatograficzn, moe by przechowywany na wlóknie do czasu analizy. Analiza chromatograficzna ekstraktu polega na wprowadzeniu igly przyrzdu do dozownika chromatografu gazowego i wysuniciu wlókna z sorbentem do przestrzeni dozownika, gdzie nastpuje desorpcja analitów do fazy gazowej. Gaz nony przenosi je nastpnie do kolumny chromatograficznej, gdzie

42

nastpuje proces rozdzielania. Technika SPME nie wymaga specjalnych desorberów termicznych i mona j stosowa w polczeniu z kadym chromatografem gazowym.

Prowadnica wlókna ruba blokujca poloenie wlókna Otwór do obserwacji wlókna

Ruch analitów Igla Wlókno z sorbentem Próbka

a)

b)

c)

Rysunek 10. Schemat przyrzdu do mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej, SPME (a) oraz sposoby ekstrakcji: bezporednio w próbce, DI-SPME (b) i w fazie nadpowierzchniowej, HS-SPME (c) Dla celów chromatografii cieczowej stosuje si ekstrakcj poprzez przepuszczanie próbki przez kapilar, pokryt od wewntrz sorbentem. Zatrzymane na sorbencie w kapilarze anality wymywa si bezporednio przez faz ruchom do kolumny HPLC lub rozpuszczalnikiem do naczynka chromatograficznego. Fazy stacjonarne stosowane w technice SPME maj róne wlaciwoci chemiczne. Sorpcja zwizków organicznych zaley od ich powinowactwa do zastosowanego rodzaju fazy stacjonarnej. Najpowszechniej stosowan grup faz s fazy silikonowe. S to polisiloksany, które dziki swym wlaciwociom fizykochemicznym, bardzo dobrze spelniaj wymogi faz stacjonarnych. Polisiloksany s stabilnymi termicznie i chemicznie cieczami, posiadajcymi odpowiedni lepko, nieznacznie zmieniajc si ze zmian temperatury. Fazy te mona modyfikowa chemicznie, poprzez dodatek rónych grup funkcyjnych, uzyskujc w ten sposób rón selektywno. Struktura polisiloksanów umoliwia szybk sorpcj analitów. Przykladem faz silikonowych jest np. polidimetylosiloksan (ang. polydimethylsiloxane, PDMS) lub mieszanina polidimetylosiloksanu i diwinylobenzenu PDMS/DVB (ang. divinylbenzene, DVB). Jako faz stal w SPME stosuje si równie poliakrylany (PA) oraz kopolimery np. carbowax/DVB, DVB/carboxenTM-PDMS i inne.

43

Podstawy metody Zaleno stenia analitu w fazie stacjonarnej od czasu ekstrakcji jest funkcj wykladnicz, któr przedstawia równanie: k (6) c s (t) = c w,0 1 ( 1 - e -k2t ) k2 gdzie: k1 i k2 - stale sorpcji i desorpcji analitu w fazie stacjonarnej, - pocztkowe stenie analitu w wodzie, - stenie analitu w fazie stacjonarnej w czasie t. Mechanizm ekstrakcji polega na podziale analitu midzy dwie fazy: matryc (woda) i sorbent(polimer, ciecz). W zwizku z tym ilo analitu w sorbencie (ms) zaley w glównej mierze od wartoci stalej podzialu analitu midzy dwie fazy: sorbent i wod . Stala podzialu jest ilorazem ste analitu w stanie równowagi w fazie sorpcyjnej(cs) i fazie wodnej (cw):

K s/w= cs m Vw = s cw m w Vs

(7)

gdzie: - objto fazy wodnej, - objto fazy ekstrahujcej, - masa analitu w fazie ekstrahujcej, - masa analitu w fazie wodnej. Po osigniciu stanu równowagi, bilans mas mona zapisa:

mw,0 = ms+mw

gdzie: - pocztkowa masa analitu w fazie wodnej. Przeksztalcajc wzory (7) i (8), otrzymuje si wzór na mas analitu w fazie ekstrahujcej,

(8)

ms =

m w, 0 K s / wVs K s / w + Vw

(9)

który po uwzgldnieniu pocztkowej masy analitu w fazie wodnej przyjmuje ostateczn posta zalenoci masy analitu w fazie ekstrahujcej:

ms =

c w, 0Vw K s / wVs K s / w + Vw

(10)

Mikroekstrakcja do fazy stalej jest technik równowagow, co oznacza, e zawsze masa analitu znajdujca si w sorbencie ekstrahujcym jest zalena od jego stenia pocztkowego w próbce. To, jaka pocztkowa cz analitu znajdzie si w sorbencie, zaley od stalej podzialu oraz od objtoci

44

fazy stacjonarnej i próbki. Przy bardzo duej objtoci próbek, stosunek wic równanie mona zapisa:

jest bliski jednoci, (11)

m s = K s / w c w, 0V s

co oznacza, e w takim przypadku ilo analitu ekstrahowana do fazy stacjonarnej jest niezalena od objtoci próbki. Umoliwia to pomiar stenia analitów w wysoce objtociowych próbkach, np. rzece czy w jeziorze, poprzez bezporednie zanurzenie wlókna do wody. Dla próbek gazowych, zaleno iloci analitu zaabsorbowana przez faz stacjonarn od stenia jego w próbce jest identyczna jak w przypadku próbek cieklych, przy czym stenie, objto oraz stala podzialu analitu dotyczy gazu:

m s = K s / g c g , 0Vs

gdzie: - pocztkowe stenie analitu w próbce gazowej, - objto fazy gazowej (próbki), - stala podzialu analitu midzy dwie fazy: sorbent i próbk gazow.

(12)

Jeli wlókno znajduje si w fazie nadpowierzchniowej nad próbk, w stanie równowagi midzy fazami, ilo analitu w fazie stacjonarnej zaley od stalej podzialu miedzy faz stacjonarn a gazow faz nadpowierzchniow, Ks/g oraz midzy gazow faz nadpowierzchniow a próbk, Kg/w. Zaleno t mona wyprowadzi jak poprzednio z bilansu mas w stanie równowagi, uwzgldniajc przejcie analitu z fazy gazowej do fazy stalej:

K s/g= cs cg = ms V g mg Vs

(13)

oraz przejcie analitu z fazy wodnej do fazy gazowej:

Kg/w = cg cw = m g Vw mw V g

(14)

gdzie: - objto fazy nadpowierzchniowej, - masa analitu w gazowej fazie nadpowierzchniowej. Bilans mas obejmuje wszystkie trzy fazy:

m w, 0 = ms + m w + m g

std masa analitu w fazie stacjonarnej wynosi:

K s / g K g / wV sVw c0 K s / g K g / wVs + K g / wV g + Vs

(15)

ms =

(16)

45

Ponadto, w przypadku próbek cieklych, stosunek stalej podzialu cialo stale/gaz i stalej podzialu gaz/woda jest równy stalej podzialu cialo stale/woda:

K s/ g K g / w = ms V g m g V w m g Vs m w V g = m s Vw m w Vs = Ks / w

(17)

Jeli ekstrahuje si anality, których stala podzialu faza nadpowierzchniowa/próbka, niska, to zmniejszajc objto fazy gazowej, zmniejsza si warto czynnika

jest , co

oznacza, e ilo analitu w fazie stacjonarnej bdzie prawie taka sama, jakby zanurzy sorbent w próbce. Jest to bardzo cenna cecha tej techniki, gdy transport analitów przez faz nadpowierzchniow jest znacznie szybszy ni w cieklej fazie (w próbce zawsze tworzy si cienka warstwa wody wokól wlókna, co spowalnia przenoszenie masy analitu). Ponadto, w fazie nadpowierzchniowej, jest znacznie mniejszy wplyw matrycy, co z kolei jest istotne w przypadku bardzo zloonych próbek.

Czas ekstrakcji zaley od czasu ustalania si równowagi midzy próbk a faz stacjonarn. Dyfuzj analitów z próbki do fazy stacjonarnej przyspiesza mieszanie. Idealne mieszanie umoliwia zastosowanie ultradwików, w innych przypadkach zawsze wokól wlókna znajduje si cienka warstwa wody ograniczajca dyfuzj do warstwy sorbentu i wydluajca czas ustalania równowagi. Poniewa warstwa sorbentu na wlóknie ma mal grubo (7 ­ 100 µm), stan równowagi ustala si szybko i w praktyce czas ekstrakcji wynosi zwykle od 2 do 30 min. Poza tym pojemno wlókna jest ograniczona i przedluanie czasu kontaktu z próbk (zwlaszcza w gazow) moe prowadzi do desorpcji i zmniejszenia wydajno ekstrakcji. Dobór wlókna z sorbentem opiera si najczciej na zasadzie stosowanej w chromatografii ,,podobne rozpuszcza podobne", charakter sorbentu (polarno) dobierany jest do polarnoci analitu. Czulo metody zatania technik SPME zalena jest od wartoci stalej podzialu analitu midzy substancj sorpcyjn (faz stacjonarn) a próbk. Jeli dobór wlókna jest utrudniony ze wzgldu na wlaciwoci analitu (obecno w matrycy znacznych iloci substancji o podobnej strukturze chemicznej), mona zastosowa jego derywatyzacj. Dobrym sposobem, jeli to jest moliwe, jest przeprowadzenie analitów w pochodne o innej strukturze chemicznej od pozostalych skladników matrycy. Pochodne analitów powinny mie inne wlaciwoci fizykochemiczne, np. nisz temperatur wrzenia lub inn polarno. Nisza temperatura wrzenia zwiksza ich lotno, a mniejsza polarno zwikszy stal podzialu na niepolarnej fazie stacjonarnej, co w rezultacie zwiksza wydajno ekstrakcji lub wrcz j umoliwia. Derywatyzacj próbki mona wykona przed ekstrakcj lub w trakcie. Jednym ze sposobów jednoczesnej ekstrakcji i derywatyzacji jest zanurzenie wlókna do odczynnika -reagenta a nastpnie zanurzenie do próbki lub umieszczenie w fazie gazowej nad próbk. Reakcja zachodzi na wlóknie, co znacznie skraca czas analizy. Niestety, nie kad reakcj mona w ten sposób wykona. Masa analitu w fazie stacjonarnej zaley równie od jej iloci. Dostpne s wlókna o nastpujcej gruboci warstwy sorbentu: 7, 10, 30, 50, 65, 70, 85 i 100 µm. Grube warstwy fazy odpowiednie s do 46

wikszych iloci analitów, ciesze stosowane s do mniejszych ste. Czas dyfuzji w fazie stacjonarnej zaley od jej gruboci i wielkoci molekuly analitu. Wlókna o wikszej gruboci warstwy, np. 100 µm, stosuje si do ekstrakcji niskomolekularnych i lotnych zwizków. Z kolei wlókna o gruboci warstwy mniejszej, np. 30, 10 lub 7 µm stosuj si do ekstrakcji zwizków o wyszych masach molekularnych i mniej lotnych. Grubo warstwy sorbentu naley równie wybiera biorc pod uwag proces desorpcji analitu. Substancje o wyszych temperaturach wrzenia szybciej desorbuj si z wlókna o cieszej warstwie fazy stacjonarnej. Na wydajno ekstrakcji maj wplyw objtoci fazy gazowej i próbki. Wydajno wzrasta przy minimalizacji objtoci fazy gazowej nadpowierzchniowej. Zwykle próbka ciekla zajmuje polow objtoci naczynka do ekstrakcji. Poza tym stan równowagi midzy faz gazow a ciekl osiga si szybciej w naczynku o mniejszej pojemnoci. Np. 3 razy szybciej osiga si stan równowagi w naczynku o pojemnoci 5 mL, z zawartoci próbki równ 1 mL ni w naczynku o pojemnoci 50 mL, z zawartoci próbki równ 10 mL. Stala podzialu substancji midzy faz gazow a próbk, Kg/w ronie ze wzrostem temperatury, wzrasta wic ilo analitu w fazie gazowej. Im wysze stenie analitu w fazie gazowej, tym szybsza jego sorpcja na wlóknie. Ale zbyt wysoka temperatura jest przyczyn desorpcji ich z wlókna, która nie powinna zachodzi w trakcie ekstrakcji. Optymaln temperatur naley wic dobra w zalenoci od skladu próbki i uytej fazy stacjonarnej. Temperatura i czas ekstrakcji s cile ze sob zwizane, wzrost temperatury pociga za sob skrócenie czasu ekstrakcji. Dla zwikszenia wydajnoci ekstrakcji czsto stosuje si proces wysalania. Wysalanie zwiksza sil jonow roztworu i zmniejsza rozpuszczalno organicznych analitów w próbce, tym samym zwikszajc ich ilo w fazie gazowej, co ulatwia sorpcj na wlóknie. Wysalanie czsto stosuje si przy oznaczaniu pestycydów i zwizków aromatycznych. Efekt wysalania zaley od rodzaju analitu i stenia soli w próbce. Zastosowanie selektywnych membran wokól wlókna (rysunek 11) zwiksza selektywno ekstrakcji i moe przedluy ywotno wlókna. Szczególne zainteresowanie wzbudzaj membrany wglowe.

Membrana Próbka Ruch analitu

Rysunek 11. Schemat mikroekstrakcji do fazy stalej przez membran 47

Warunki desorpcji s równie wane jak warunki ekstrakcji. Zwykle stosowana jest desorpcja termiczna i odbywa si w dozowniku chromatografu gazowego. SPME nie daje piku rozpuszczalnika w GC ale desorpcja analitu z wlókna zachodzi wolniej ni odparowanie rozpuszczalnika, czego rezultatem jest ogonowanie pików, dlatego czas desorpcji powinien by moliwie najkrótszy. Temperatura dozownika powinna by wysza ni temperatura wrzenia najwyej wrzcego skladnika, ale z drugiej strony musi by dopasowana do termicznej wytrzymaloci wlókna. W oznaczaniu nielotnych lub nietrwalych zwizków, technik SPME lepiej polczy z technik HPLC lub LC/MS. Technika SPME jest bezrozpuszczalnikow ekstrakcj. Rónorodno wlókien dostpnych komercyjnie umoliwia wiele zastosowa (tabela 2). SPME jest metod przygotowania próbek analizowanych technik chromatografii gazowej, wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub elektroforezy. Mona j stosowa do lotnych i nielotnych substancji. Ekstrakcja do fazy stalej moe si odbywa na bardzo selektywnych sorbentach, jakimi s przeciwciala lub polimery z molekularnym nadrukiem. Tabela 2. Przyklady zastosowa mikroekstrakcji do fazy stalej w analityce rodowiska (na podstawie Trends in solventless sample preparation techniques for environmental analysis, W. Wardencki, J. Curylo, J. Namienik, J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007)) Próbka Analit Typ sorbentu, grubo warstwy fazy stacjonarnej [µm] Woda Woda Pochodne benzenu Pestycydy PDMS, 100 PDMS, 7 PDMS/DVB, 65 Woda Gleba Gleba Gleba Ryby, woda rzeczna Woda Woda Lotne i redniolotne zwizki organiczne Chlorowcoorganiczne pestycydy Fungicydy Fosforoorganiczne pestycydy Metylort Fosforoorganiczne pestycydy Substancje wybuchowe PDMS PDMS, 100 PA, 85 PA, 85 PDMS, 100 PA, 85 CW/TPR, 50 PDMS/DVB, 60 PA, 85 Grunt i woda powierzchn. BTEX, naftalen, chlorowane alkany, chlorowane benzeny PDMS, 100 PA, 85 HS MCC/UV/IMS HS DI DI HS HS DI DI Typ ekstrakcji Analiza wlaciwa

DI DI

GC/IT/MS GC/NPD, GC/ECD GC/FID, GC/MS GC/ECD, GC/MS GC/MS GC/MS GC/MS SFE/HPLC HPLC/UV

48

Tabela 2. c.d. Próbka Analit Typ sorbentu, grubo warstwy fazy stacjonarnej [µm] Woda Woda BTEX N-nitrozoaminy PDMS/DVB, 65 CAR/PDMS Typ ekstrakcji Analiza wlaciwa

HS HS

GC/FID GC/NCD GC/NPD GC/MS

cieki przemyslowe Woda

Zwizki siarkowe Chlorek benzylu, dichlorek benzylu, trichlorek benzylu

PDMS/DVB PDMS/Carboxen Wlókno z wglem aktywowanym (ACF)

HS HS

GC/MS GC/MS

Powietrze

Chlorobenzeny

Carbowax/PDMS PDMS/DVD Carbowax /DVB

HS

GC/MS GC/ECD

49

4. Ekstrakcja próbek cieklych

4.1. Ekstrakcja w ukladzie ciecz ­ gaz Metoda ekstrakcji do fazy gazowej wykorzystywana jest glównie do oznaczania lotnych skladników organicznych w próbkach wodnych oraz stalych. Metod t stosuje si w przypadku próbek szczególnie trudnych do analizy, wymagajcych uciliwego i skomplikowanego oczyszczania oraz zagszczania. Ekstrakcja do fazy gazowej polega na przenoszeniu analitów do fazy gazowej nad powierzchni próbki (nadpowierzchniowej, ang. head space, HS) w ukladzie zamknitym lub do strumienia gazu przeplywajcego przez próbk. W obu technikach istotn rol odgrywa podwyszona temperatura, dziki której wspomagane s procesy desorpcji analitu z fazy cieklej lub stalej do gazowej. 4.1.1. Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej Podstaw statycznej metody ekstrakcji do gazowej fazy nadpowierzchniowej jest zmienno cinienia czstkowego substancji w fazie gazowej wraz ze zmian jej stenia w fazie cieklej. W ukladzie zamknitym, w stanie równowagi termodynamicznej zaleno cinienia czstkowego pi skladnika i w fazie gazowej nad próbk od jego stenia w cieklej mieszaninie, któr jest próbka, wyraa prawo Raoulta:

p i = xi p i0

gdzie: - ulamek molowy skladnika i w próbce cieklej, - prno pary nad czystym skladnikiem i.

(18)

Z prawa Raoulta wynika, e na podstawie stenia analitu w fazie gazowej mona okreli pierwotne jego stenie w próbce cieklej. W stanie równowagi termodynamicznej midzy faz gazow i ciekl, przy danym cinieniu i temperaturze, stosunek ste skladnika i w obu fazach jest wielkoci stal, której warto wyraa stala podzialu substancji i :

Ki = ciL c iG

(19)

gdzie: - stenie substancji i w fazie cieklej, - stenie substancji i w fazie gazowej. Stenie pocztkowe skladnika i w próbce ( ) mona obliczy z bilansu mas. W stanie równowagi termodynamicznej ilo skladnika i w fazie cieklej wynosi a w fazie gazowej . Suma iloci skladnika w obu fazach jest jego iloci w fazie cieklej (próbce) przed ekstrakcj :

0 c iLV L = ciG VG + c iLV L

(20)

Po uwzgldnieniu stalej podzialu otrzymuje si równanie wyraajce zwizek midzy steniem badanej substancji w próbce cieklej a jej steniem w fazie gazowej:

V 0 c iL = c iG G + K i VL

50

(21) Równanie (21) jest podstawow zalenoci stosowan w oznaczeniach ilociowych technik HS w polczeniu z chromatografi gazow. Stenie badanej substancji w próbce cieklej jest proporcjonalne do jej stenia w fazie gazowej, bdcej w stanie równowagi termodynamicznej z faz ciekl. Wyraenie jest wspólczynnikiem proporcjonalnoci, który naley

wyznaczy dowiadczalnie metod krzywej kalibracyjnej. Przy wykonywaniu pomiarów do krzywej kalibracyjnej naley nastrzykiwa na kolumn chromatograficzn, identyczn objto fazy gazowej jak w przypadku próbki badanej. Próbki do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej musz mie te same objtoci fazy cieklej i fazy gazowej , oraz niezmienn warto stalej podzialu Szczególnie trudny do zachowania jest warunek ostatni, tj. zachowanie tej samej wartoci stalej podzialu w próbkach wzorcowych i badanych, co si wie z zachowaniem takiego skladu jakociowego próbek wzorcowych jak próbek badanych. Innym sposobem wyznaczenia wartoci stenia skladnika w próbce jest eliminacja z oblicze stalej podzialu: rzeczywista i rachunkowa. Rzeczywist eliminacj mona osign przez ekstrakcj w temperaturze podwyszonej (takiej, by caly analit znajdowal si w stanie gazowym), wówczas = 0, wic i = 0, a zawarto w próbce oblicza si stosujc metod chromatograficzn. Nie jest to jednak metoda uniwersalna, mona j wykorzystywa do substancji lotnych i dobrze rozpuszczalnych w wodzie o malych stalych podzialu. Rachunkowo stal podzialu eliminuje si z oblicze w metodzie dodatku wzorca Najdogodniejszym sposobem tej metody jest wykonanie dwóch analiz równoleglych, jednej bez dodatku, drugiej z dodatkiem znanej iloci analitu. Zalet jest równie to, e mona go stosowa w automatycznych dozownikach chromatografów gazowych. Bilans mas substancji oznaczanej w pierwszym naczynku HS (bez dodatku wzorca, indeks dolny 1) mona zapisa nastpujco: VL c0 = VG c1G + V L c1L (22) Bilans mas substancji oznaczanej w drugim naczynku HS (z dodatkiem wzorca, indeks dolny 2) mona zapisa nastpujco: (23) V L c0 + m w = V G c2 G + V L c 2 L Do obu równa mona wprowadzi stal podzialu poniewa sklad jakociowy obu próbek jest taki sam: która jest identyczna w obu przypadkach,

c c (24) K i = 1L = 2L ciG c 2G Po odpowiednim podstawieniu otrzymuje si wzór na obliczenie nieznanego stenia pocztkowego w fazie cieklej (próbce) na podstawie ste analitu w fazie gazowej: c0 = mW c1G V L c2G - c1G

(25) 51

Poniewa wielko sygnalów chromatograficznych(A) jest wprost proporcjonalna do stenia analitu w gazie gazowej ( ), równanie mona zapisa w postaci praktycznej, a mianowicie: (26) Mnoc obie strony równania przez warto próbce: (27) Technik ,,headspace" mona wykonywa w dwóch ukladach ekstrakcyjnych: statycznym i dynamicznym. Statyczna metoda ekstrakcji do fazy nadpowierzchniowej (ang. static headspace, SHS) naley do metod równowagowych. W zamknitym naczyniu, zawierajcym próbk ciekl i gaz obojtny, w okrelonej temperaturze ustala si midzy fazami stan równowagi termodynamicznej, w którym stosunek ste analitów w obu fazach jest zgodny z ich stal podzialu. Po pobraniu okrelonej objtoci fazy gazowej i oznaczeniu jej skladu, uzyskuje si informacj o skladzie próbki. Ekstrakcj mona przeprowadza przy uyciu powietrza, pod warunkiem, e nie ma w nim analitów, a skladniki powietrza nie oddzialuj z substancjami oznaczanymi. Schemat postpowania w przypadku metody statycznej przedstawiony jest na rysunku 12. Po napelnieniu naczynka HS próbk (1) i faz gazow (2) naley je zamkn szczelnie za pomoc uszczelki (3) i kapsla metalowego (4) uywajc kapslownicy. Zamknite naczynko wstawia si do termostatu (5), gdzie w czasie t i temperaturze T ustala si stan równowagi. Optymalny czas i temperatur termostatowania naley ustali eksperymentalnie dla kadego analitu. Po ustaleniu si stanu równowagi ekstrakt gazowy (6) pobiera si gazoszczeln strzykawk (7), która byla termostatowana w tej samej temperaturze, co próbka. Ogrzanie strzykawki do tej samej temperatury, co próbka zapobiega wykraplaniu si analitów podczas pobierania ekstraktu gazowego oraz oczyszcza j przez odparowanie ewentualnych pozostaloci po poprzednim uyciu. W automatycznych urzdzeniach (przystawkach do chromatografu gazowego) ogólny schemat postpowania jest podobny do schematu przedstawionego na rysunku 12. Termostat Kapsel metalowy Uszczelka Faza gazowa Próbka Ekstrakt gazowy Strzykawka gazoszczelna otrzymuje si wzór na mas analitu w badanej

Rysunek 12. Schemat postpowania w statycznej ekstrakcji do fazy gazowej

52

Dynamiczna metoda ekstrakcji do gazowej fazy nadpowierzchniowej (ang. dynamic headspace, DHS) naley do technik nierównowagowych i polega na przeplywie strumienia gazu ekstrahujcego nad powierzchni ogrzanej próbki. Ekstrakcja dynamiczna jest bardziej wydajna ni statyczna, gdy kolejne porcje gazu porywaj wydzielajce si do fazy nadpowierzchniowej anality. Stosuje si j w przypadku niskiego stenia oznaczanych zwizków w matrycy lub z powodu malych wartoci stalej podzialu. Poza tym jest to dogodna metoda izolacji substancji z silnie pienicych si cieczy. Wad jest natomiast due zuycie gazu i konieczno izolowania analitów z fazy gazowej, gdy duej objtoci gazu nie da si wprowadzi do dozownika chromatografu gazowego. Sposobem na zwikszenie powierzchni kontaktu przeplywajcego gazu z próbk jest ekstrakcja do fazy gazowej przeplywajcej nad cienk warstw (filmem) cieklej próbki. Metoda ta nosi nazw angielsk thin layer headspace, TLHS. Due rozwinicie powierzchni kontaktu wystpuje w przypadku rozprysku próbki cieklej w fazie gazowej.

4.1.2. Ekstrakcja strumieniem gazu przeplywajcym przez próbk Odrbn nierównowagow metod izolacji analitów jest technika wymywania i wychwytywania (purge and trap, PT), która moe by wykonywana w ukladzie zamknitym i otwartym. Polega ona na wymywaniu analitu przez gaz ekstrahujcy, przepuszczany przez warstw próbki cieklej a nastpnie usuwaniu analitu z gazu. W czasie przechodzenia kolejnych objtoci gazu przez próbk nastpuje zmniejszanie si w niej zawartoci analitu. Stenie analitu w próbce zmienia si wraz ze zmiennoci objtoci gazu (w danej temperaturze) wg funkcji wykladniczej:

H VG - RT V L 0 c iL = c iL e

(28)

gdzie: H - stala Henry'ego, R ­ stala gazowa, - stenie analitu i w próbce cieklej o objtoci gazu , - pocztkowe stenie analitu w próbce.

po przepuszczeniu przez ni objtoci

W technice PT wymywanie i wychwytywanie analitów jest prowadzone w tym samym czasie, przy otwartym obiegu gazu ekstrahujcego, którym najczciej jest hel. Schemat i zasad dzialania takiego zestawu przedstawiono na rysunku 13. Próbk umieszcza si w specjalnym, szczelnym naczynku (1), do którego doprowadzany jest gaz obojtny (2) przewodem (3), zakoczonym belkotk (4). Przeplyw gazu ekstrahujcego przez próbk i pulapk wymuszany jest cinieniem gazu w butli (2). Ekstrahent nie moe wprowadza zanieczyszcze do próbki, dlatego gaz przepuszczany jest przez filtr (5), dla usunicia ewentualnych niepodanych substancji. Gaz, przeplywajc przez próbk w postaci rozproszonych pcherzyków, zabiera ze sob lotne substancje, które nastpnie s zatrzymywane przez sorbent znajdujcy si w pulapce (6). Objto badanej próbki zaley od stenia oznaczanych w niej zwizków chemicznych, zwykle wynosi kilka lub kilkanacie mL. Czas i objto przepuszczanego gazu naley dostosowa do wartoci stalej podzialu analitu. Najczciej gaz przepuszczany jest przez próbk przez kilka do kilkudziesiciu minut z prdkoci od 10 do 40 53

mL/min. Dla zwizków lotnych, o duej wartoci stalej podzialu, wystarczajce stenie analitu w fazie gazowej mona osign ju w temperaturze pokojowej. Dla zwizków redniolotnych lub trudnolotnych naley stosowa podwyszon temperatur ekstrakcji, by zwikszy ich lotno. Zwizki polarne ulegaj solwatacji w roztworach próbek, co zmniejsza ich lotno (nastpuje przesunicie równowagi w kierunku fazy cieklej). Na wydajno ekstrakcji ma równie wplyw sila jonowa roztworu próbki. Im wiksza sila jonowa próbki, tym mniejsza rozpuszczalno w niej skladników organicznych, std wysalanie próbki zwiksza wydajno ekstrakcji. Wydajno ekstrakcji do fazy gazowej jest to stosunek iloci analitu, jaka przeszla do fazy gazowej do iloci pocztkowej w próbce, wyraony w % (patrz (1) i (2), rozdz. II.1):

E=

0 c iL - c iL 0 c iL

100%

(32)

W zestawie do ekstrakcji w ukladzie zamknitym gaz doprowadzany jest do próbki i pulapki za pomoc pompy. Oczyszczony z analitu gaz po wyjciu z pulapki zawracany jest do ekstrakcji.

Filtr (5) Butla ze spronym gazem Przewody Wylot Zloe sorbenta stalego do wychwytywania analitów (6) Termostat (7) Naczynko z próbk (1) Belkotka

Rysunek 13. Schemat zestawu do ekstrakcji przez wymywanie i wychwytywanie (PT) w ukladzie otwartym W dynamicznych metodach ekstrahowane zwizki trzeba izolowa z fazy gazowej, poniewa znajduj si w duej jej objtoci. Pulapki powinny zapewnia ilociowe wychwycenie skladników oraz ilociowe i latwe uwolnienie analitów. W zalenoci od wlaciwoci fizyko-chemicznych analitów, wychwytywanie mona stosowa poprzez adsorpcj na sorbentach stalych, absorpcj w roztworach lub fazach cieklych osadzonych na noniku lub przez wymraanie. Sorbenty stale powinny si charakteryzowa okrelon wytrzymaloci termiczn i powierzchni wlaciw. Najczciej stosowanymi sorbentami stalymi s sorbenty wglowe, takie jak: grafityzowana sadza wglowa (Carbotrap B lub C), wglowe sita molekularne (Carboxen, Carbosieve S-II i S-III) oraz polimery syntetyczne, jak politlenek 2,6-difenylo-p-fenylenowy znany pod nazw Tenax GC, Tenax TA czy lczony z grafitem Tenax GR. Stosowane s równie ele krzemionkowe i wgiel aktywny. Najwiksz wytrzymalo termiczn posiada wgiel aktywny - pow. 700°C, najnisz el krzemionkowy - 300°C. Syntetyczne sorbenty wytrzymuj temperatur 400 °C. Najwiksz 54

powierzchni wlaciw posiadaj: wgiel aktywny, Carbosieve S-III i S-II, Carboxen i el krzemionkowy (od 300 do 1000 m2/g), mniejsz Tenax (18 m2/g) i Carbotrap C i B - odpowiednio 10 i 90 m2/g. Wymienione sorbenty stale, poza elem krzemionkowym, maj charakter hydrofobowy. Zakres zastosowania sorbentów stalych uywanych w technice wymywania i wychwytywania przedstawiono w tabeli 3. Tabela 3. Sorbenty stale stosowane w technice wymywania i wychwytywania(PT) (na podstawie Namienik J., Jamrógiewicz Z., red., Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszcze rodowiska, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, 1998) L.p. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Typ sorbentu Carbotrap B Carbotrap C Carbosieve S-II Carbosieve SIII Carboxen Tenax GC, Tenax TA Tenax GR Wgiel aktywny el krzemionkowy Wglowodory C4 ­ C8 Wglowodory od C4 do bifenyli Bardzo lotne zwizki organiczne Bardzo lotne zwizki typu chlorometan, chlorek winylu Lotne zwizki organiczne Wglowodory alifatyczne od C6, wglowodory aromatyczne, policykliczne, aldehydy, fenole, aminy aromatyczne, nitrozwizki i in. 7. 8. 9. Wlaciwoci lepsze ni Tenax TA Bardzo lotne zwizki organiczne Zwizki wysokowrzce Zastosowanie

Pulapka kriogeniczna (wymraajca) jest to niewielki odcinek kapilary ze spiekanej krzemionki, pusty lub pokryty faz ciekl, umieszczony w termostacie. Termostat mona schlodzi do temperatury 196°C a nastpnie gwaltownie ogrza do temperatury 300°C z szybkoci 1200°C/min.

Ekstrakty gazowe, które maj by przepuszczane przez pulapki kriogeniczne nie mog zawiera wody. Dynamiczn form ekstrakcji do fazy gazowej jest mikroekstrakcja przez porowate wlókno polimerowe, która moe by realizowana w dwóch wersjach, przedstawionych na rysunku 14a i b. Pierwszy sposób polega na omywaniu próbk porowatego wlókna, przez które plynie w przeciwprdzie gaz ekstrahujcy, w drugim sposobie gaz ekstrahujcy omywa porowate wlókno, przez które przeplywa próbka. Jak w kadej metodzie dynamicznej, analit musi by z fazy gazowej izolowany. Ekstrakcj do fazy gazowej stosuje si powszechnie do izolacji i oznaczania lotnych skladników organicznych w próbkach o zloonej matrycy, mogcej interferowa z oznaczanymi zwizkami. Takimi 55

próbkami s: produkty spoywcze(owoce, miód, wino, moszcz) material biologiczny (np. krew, plyny ustrojowe, mleko ludzkie), material rolinny (olejki eteryczne, ziola, roliny lecznicze), wody naturalne, cieki, osady i gleba. ,,Headspace" stosuje si do izolacji pozostaloci rozpuszczalników w rónych produktach, np. olejach, rodkach farmaceutycznych oraz monomerów rozpuszczonych w polimerach. Wylot gazu Wylot próbki

Wlot próbki

Wlot gazu

a)

b)

Wylot próbki

Wylot gazu

Wlot gazu

Wlot próbki

Rysunek 14. Mikroekstrakcja do fazy gazowej przez porowate wlókno 4.2. Ekstrakcja w ukladzie ciecz-ciecz Proces przenoszenia substancji rozpuszczonej w jednej fazie cieklej do drugiej fazy cieklej, niemieszajcej si z pierwsz, nazywa si ekstrakcj w ukladzie ciecz ­ ciecz (ang. liquid ­ liquid extraction, LLE). Ruch materii przez granic faz opisuje regula faz Gibbsa:

f + s = + 2

gdzie:

(33)

f ­ liczba faz, s ­ zmienno lub liczba stopni swobody, - ilo skladników. W ukladzie dwóch niemieszajcych si cieczy oraz jednego skladnika, rozpuszczonego i ulegajcego podzialowi miedzy nie, liczba stopni swobody wynosi:

s = + 2 - f = 3+ 2- 2= 3

(34)

56

W ekstrakcji, pod stalym cinieniem i w stalej temperaturze, pozostaje jeden stopie swobody ­ stenie skladnika, co oznacza, e stenie skladnika w jednej fazie cieklej odpowiada cile okrelonemu jego steniu w drugiej fazie cieklej, niezalenie od calkowitej jego zawartoci. Zaleno stenia substancji w jednej fazie od jej stenia w drugiej fazie, w stanie równowagi i w stalej temperaturze i cinieniu jest staly co ilociowo opisuje prawo podzialu Nernsta definiujce stal podzialu K (por. rozdz. I.2.2, (26)) Jeli substancja ekstrahowana ulega rónym procesom chemicznym w jednej z faz, podzial substancji ekstrahowanej midzy dwie fazy okrela wspólczynnik ekstrakcji - D, uwzgldniajcy stenia wszystkich form substancji wystpujcych w matrycy odbierajcej [(cA)] i w matrycy pierwotnej [(cA)]: (c A ) (35) D= (c A )

Znajomo wartoci stalej podzialu K czy wspólczynnika ekstrakcji D substancji izolowanej lub jej homologu, umoliwia ustalenie warunków ekstrakcji, jak objto fazy ekstrahujcej oraz krotno ekstrakcji, aby zapewni wystarczajc wydajno procesu. Dla wartoci K>>1 wystarczajc jest jednostopniowa ekstrakcja, wielostopniow ekstrakcj naley stosowa, jeli warto K jest znacznie mniejsza, gdy K jest równe jednoci ­ rozdzielenie jest niemoliwe.

Zaleno midzy wydajnoci ekstrakcji a wspólczynnikiem ekstrakcji przedstawia równanie:

%E = D

gdzie:

v v

100

(36)

v, v ­ objtoci odpowiednio matrycy odbierajcej i matrycy pierwotnej. Z równania wynika, e wydajno ekstrakcji jest tym wiksza, im wiksza jest warto wspólczynnika ekstrakcji D i wiksza warto stosunku v/v, czyli im wiksza objto matrycy odbierajcej. Zwikszenie objtoci matrycy odbierajcej powoduje rozcieczenie analitu, co ,,klóci si" z podstawowym celem ekstrakcji, jakim jest zatanie, dlatego aby osign podan wydajno, naley stosowa kilkakrotn ekstrakcj mniejszymi porcjami rozpuszczalnika. Zmiany stenia substancji ekstrahowanej w dwóch fazach, podczas osigania stanu równowagi w kolejnych ekstrakcjach tak sam porcj rozpuszczalnika , mona zapisa, korzystajc ze wspólczynnika ekstrakcji. Po pierwszej ekstrakcji wspólczynnik ten wynosi:

D=

[ ( A)

0

-

( A)

( A) ]/ v

1 1

(37)

/ v

wynosi:

Po przeksztalceniu, masa substancji pozostala w matrycy pierwotnej (

57

gdzie:

( A) 1 =

v ( A) 0 Dv + v

(38)

stenie substancji w matrycy odbierajcej po pierwszej ekstrakcji, - masa pocztkowa substancji w matrycy pierwotnej, - stenie substancji pozostalej w matrycy pierwotnej po pierwszej ekstrakcji. Jeli matryca pierwotna bdzie ekstrahowana kolejn porcj niej masa substancji ekstrahowanej: matrycy odbierajcej, pozostanie w

2

( A) =

2

v ( A) 1 Dv + v

=

v ( A) 0 Dv + v

(39)

Po wielu (n) ekstrakcjach tak sam porcj matrycy odbierajcej masa substancji ekstrahowanej równa:

w matrycy pierwotnej pozostanie

n

( A) =

n

v ( A) 0 Dv + v

(40)

Aby wyekstrahowa substancj ilociowo naley zastosowa n-krotn ekstrakcj, moliwie malymi porcjami matrycy odbierajcej.

Powysze równanie jest spelnione dla dwu niemieszajcych si cieczy, natomiast jeli ekstrahent miesza si w niewielkim stopniu z roztworem próbki, zaleno ta jest przybliona. Warto wspólczynnika ekstrakcji substancji midzy dwie niemieszajce si ciecze mona oszacowa na podstawie jej rozpuszczalnoci w tych cieczach. Naley równie podkreli, e powysze zalenoci spelniane s dla niskich ste. Ekstrakcja ciecz ­ ciecz jest procesem dwufazowym, w którym w celu przyspieszenia osignicia stanu równowagi wymagane jest rozwinicie powierzchni zetknicia faz. Po osigniciu stanu równowagi, fazy (warstwy cieczy) naley rozdzieli w moliwie krótkim czasie. Szybkie rozdzielanie si warstw ulatwia zastosowanie wlaciwego rozpuszczalnika do ekstrakcji, który poza zdolnoci rozpuszczania analitu, ma odpowiedni gsto, lepko i napicie powierzchniowe. Inne wlaciwoci odpowiednio dobranego rozpuszczalnika to: bardzo slaba rozpuszczalno w matrycy pierwotnej, odpowiednia lotno, umoliwiajca latwe odparowanie z ekstraktu bez strat analitów oraz dua czysto. Rozpuszczajc si w matrycy pierwotnej, ekstrahent zwiksza w niej rozpuszczalno substancji wyodrbnianej, przez co zmniejsza si warto stalej podzialu i wydajno ekstrakcji. Zatony rozpuszczalnik moe by ródlem zanieczyszcze próbki kocowej - minimalna obecno substancji zanieczyszczajcej w rozpuszczalniku (a istnieje niewiele substancji nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych na poziomie ppb) powoduje po jego zateniu (np. stukrotnym) pojawienie si sygnalu mogcego zdecydowanie zmieni interpretacj wyników oznacze.

58

Ekstrakcja w ukladzie ciecz-ciecz moe by stosowana w temperaturze pokojowej lub niszej, dlatego nadaje si do izolacji substancji nietrwalych. Ze wzgldu na konieczno i sposób usuwania rozpuszczalnika (odparowanie), ekstrakcj w ukladzie ciecz ­ ciecz mona stosowa do izolacji rednio- i trudnolotnych substancji.

4.2.1. Ekstrakcja zwizków organicznych Ekstrakcja w ukladzie ciecz ­ ciecz jest najstarszym typem ekstrakcji i nadal jest stosowana, zwlaszcza do wyodrbniania zwizków organicznych z próbek wodnych. Zwizki organiczne hydrofobowe, których czsteczki zbudowane s glównie z lacuchów czy piercieni wglowodorowych, (nasyconych, nienasyconych, aromatycznych), rozpuszczaj si lepiej w rozpuszczalnikach o malej stalej dielektrycznej (niepolarnych). Zwizki organiczne hydrofilowe, zawierajce w swej budowie ugrupowania polarne takie jak grupy hydroksylowe, aminowe, karboksylowe lepiej rozpuszczaj si w rozpuszczalnikach o duej stalej dielektrycznej (polarnych). W skrócie, podstaw doboru rozpuszczalnika do ekstrakcji okrela zasada ,,podobne rozpuszcza podobne". Jeli nie ma przeslanek, jakiego rozpuszczalnika naley uy do ekstrakcji (np. brak danych o rozpuszczalnoci analitu w rozpuszczalnikach matrycy pierwotnej i odbierajcej), wyboru dokonuje si na podstawie wyników kilku ekstrakcji wykonywanych na mal skal rónymi rozpuszczalnikami. Do naczynia (np. probówki) wlewa si jednakowe, kilkumililitrowe, objtoci próbki i testowanego rozpuszczalnika, po wytrzniciu i odstaniu warstw rozpuszczalnika przenosi na szkielko zegarkowe i pozostawia do odparowania, by stwierdzi obecno substancji. W tabeli 4 podano wlaciwoci fizyczne niektórych, czsto stosowanych do ekstrakcji, rozpuszczalników. Do ekstrakcji stosuje si równie mieszaniny rozpuszczalników, których wlaciwoci ekstrakcyjne mog by lepsze ni dla kadego rozpuszczalnika osobno. W przypadku bardzo zloonych próbek stosuje si ekstrakcj sekwencyjn, polegajc na traktowaniu kolejno, tej samej próbki rozpuszczalnikami o coraz wikszej polarnoci. Mona uzyska wtedy róne frakcje ekstraktu, z których kada bdzie wzbogacona o inny analit lub grup analitów. Gsto rozpuszczalnika ma due znaczenie na etapie rozwarstwiania cieczy, im wiksza rónica w gstoci midzy rozpuszczalnikiem a próbk, tym szybsze i dokladniejsze rozdzielenie warstw. Niestety w praktyce niejednokrotnie otrzymuje si ekstrakty mtne, co jest spowodowane tworzeniem si emulsji na granicy faz. Emulsje tworz si latwo, gdy próbka ma odczyn zasadowy. Niektóre rozpuszczalniki, np. chloroform, latwo tworz emulsje z roztworami wodnymi. Stosujc wielostopniow ekstrakcj w rozdzielaczu, korzystnie jest uywa rozpuszczalnika o wikszej gstoci ni próbka. W taki przypadku ekstrakt bdzie tworzyl doln warstw, któr mona bezporednio przela do zbiornika ekstraktu. Gdy do ekstrakcji uywany jest rozpuszczalnik o mniejszej gstoci ni próbka, mona doda do niego takiego rozpuszczalnika, by ich mieszanina byla cisza od próbki, co bardzo ulatwia wykonywanie czynnoci przy wielostopniowej ekstrakcji. Mieszanin rozpuszczalników stosuje si te by zwikszy wlaciwoci ekstrakcyjne, które mog by dla mieszaniny lepsze ni dla kadego rozpuszczalnika oddzielnie. Jeli próbka jest roztworem wodnym, dla ulatwienia ekstrakcji mona zastosowa dodatek soli, np. chlorku sodu, chlorku wapnia. Zwikszenie sily jonowej roztworu zmniejszy rozpuszczalno w nim zwizku organicznego i ulatwi jego ekstrakcj. Proces taki nazywa si wysalaniem. Wysalanie jest równie korzystne w przypadku stosowania rozpuszczalnika czciowo mieszajcego si z wod, gdy zmniejsza 59

jego rozpuszczalno w wodzie. Dla zwizków organicznych o wysokiej lotnoci, wzrost iloci soli w próbce zwykle zwiksza wydajno ekstrakcji do rozpuszczalnika organicznego. Z kolei mniej lotne substancje mog wykazywa optimum wydajnoci ekstrakcji przy okrelonej zawartoci soli w próbce. Ilo dodawanej soli do próbki naley wyznaczy eksperymentalnie. Tabela 4. Wlaciwoci fizyczne wybranych rozpuszczalników organicznych Rozpuszczalnik Gsto [g ml-1] Aceton Alkohol n-pentylowy Alkohol n-butylowy Alkohol etylowy Alkohol metylowy Chloroform Cykloheksan Dichlorometan Dioksan Disiarczek wgla Eter dietylowy Eter diizopropylowy Heksan Nitrobenzen Octan etylu Pirydyna Toluen Trichloroetylen 0,891 0,814 0,813 0,789 0,796 1,498 0,783 1,326 1,034 1,263 0,719 0,728 0,660 1,198 0,901 0,988 0,866 1,456 Temperatura wrzenia[°C] Wzgldna przenikalno dielektryczna 20,7 13,8 17,1 24,3 32,6 4,8 2,0 8,93 2,2 2,6 4,3 3,9 1,9 34,8 6,0 12,3 2,4 3,4 8,6 nieograniczona 0,05 0,1 Rozpuszczalno w wodzie [%]

56,5 138,1 117,7 78,3 64,7 61,3 80,7 40,2 101,3 46,3 34,5 67,2 69,0 211 77,2 115,3 110,8 87

nieograniczona 2,2 7,9 nieograniczona nieograniczona 1 0,01 1,6 nieograniczona 0,22 7,4 0,7 0,02

Rozpuszczalniki, które maj nisk temperatur wrzenia s korzystne na etapie usuwania ich z ekstraktu, ale nie w trakcie ekstrakcji. Lotne rozpuszczalniki latwo przechodz w stan pary, wdychane lub w kontakcie ze skór stanowi zagroenie dla zdrowia czlowieka. Z kolei palne rozpuszczalniki stwarzaj niebezpieczestwo zaplonu. Rozpuszczalnikami organicznymi mona te ekstrahowa niektóre elektrolity organiczne. Ekstrakcj umoliwia wlaciwy dobór pH próbki, co wykorzystuje si np. do izolacji lub oczyszczania alkaloidów za pomoc chloroformu.

60

Jest kilka sposobów, które mona zastosowa dla przyspieszenia rozwarstwienia cieczy:

· · · · · ·

· ·

delikatny ruch wirowy zawartoci rozdzielacza, przesczenie przez cisl warstw waty szklanej, jeli ekstrakt jest mtny z powodu emulsji rozpuszczalnika z wod, mona go przesczy przez suchy sczek; woda z emulsji zatrzyma si na sczku, mona doda niewielk ilo innego rozpuszczalnika (w przypadku próbek wodnych, np. alkoholu etylowego), dodatek soli, np. chlorku czy siarczanu sodu, wglanu potasu, w przypadku ekstrakcji roztworów alkalicznych mona zmniejszy pH przez dodanie rozcieczonego kwasu, pod warunkiem, e roztwór pozostanie nadal alkaliczny a skladniki próbki nie zmieni swoich wlaciwoci, wstawienie na chwil naczynia z ekstraktem do cieplej wody, pozostawienie do odstania.

4.2.2. Ekstrakcja zwizków nieorganicznych Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi jest czsto stosowana w analizie nieorganicznej. Wykorzystuje si j do oczyszczania odczynników do analiz ladowych, wydzielania substancji, usuwania skladników przeszkadzajcych oraz zatania. Bardzo czsto jest stosowana w analizie jakociowej i ilociowej do wydzielania lub rozdzielania malych i ladowych iloci kationów metali. Kationy metali w roztworach wodnych wystpuj w postaci kompleksów z wod i takiej postaci nie bd si rozpuszczaly w rozpuszczalnikach organicznych. Aby umoliwi przejcie kationu do warstwy organicznej i uzyska selektywno rozdzielania, naley zastosowa odpowiedni odczynnik, który zastpi czsteczki wody w kompleksie kationu innym ligandem i wyeliminuje ladunek elektryczny. Wybór sposobu ekstrakcji pierwiastka lub zwizku zaley od tego, w jakiej postaci ma lub moe by ekstrahowany. Dla zwizków niejonowych, stosuje si ekstrakcj niepolarnymi rozpuszczalnikami organicznymi. W ten sposób mona ekstrahowa np. AsCl3 czy HgCl2 benzenem, toluenem czy chloroformem i jest to ekstrakcja niejonowych czsteczek kowalencyjnych. 4.2.2.1. Ekstrakcja kompleksów chelatowych Innym sposobem wyodrbniania kationów jest ekstrakcja kompleksów chelatowych. Niektóre ligandy tworz z kationem metalu struktur piercieniow, a uzyskane polczenie nazywa si kompleksem chelatowym (chelatem) i jest czsto wykorzystywane w analizie chemicznej, poniewa jest znacznie trwalsze od polcze kompleksów prostych. Najczciej stosowanymi zwizkami chelatujcymi s: diketony, dioksymy, ditiokarbaminiany, 8-hydroksychinolina, kwasy alkilo- i arylofosforowe, kwasy alkilo- i arylotiofosforowe. Kompleksy chelatowe trudno rozpuszczaj si w wodzie, natomiast rozpuszczaj si w organicznych rozpuszczalnikach niepolarnych. Ekstrakcj przeprowadza si roztworem wybranego zwizku chelatujcego w rozpuszczalniku organicznym. W czasie ekstrakcji zachodzi reakcja:

61

gdzie: - jon metalu, - odczynnik kompleksujcy w fazie organicznej, - kompleks w fazie organicznej. Wydajno ekstrakcji zaley od stenia odczynnika kompleksujcego w fazie organicznej i stenia jonów wodorowych w fazie wodnej. Im wysze pH fazy wodnej, tym wydajno jest wysza, a zaleno ta jest róna dla rónych wartociowoci kationu. Wydajno ekstrakcji zaley od wlaciwoci uytego odczynnika chelatujcego, czyli od wlaciwoci kompleksu (trwalo czy rozpuszczalno w rozpuszczalniku organicznym) i wzrasta wraz ze wzrostem jego stenia w fazie organicznej. Wybór rozpuszczalnika organicznego zaley od wlaciwoci chelatu. Jeli kompleks ma wolne miejsca koordynacyjne, zostaj one obsadzone czsteczkami wody, w takim przypadku wiksz wydajno ekstrakcji uzyska si stosujc bardziej polarny rozpuszczalnik. Ekstrakcj kationów w postaci chelatów prowadzi si w temperaturze pokojowej, a trwalo kompleksu zmniejsza si ze ze wzrostem temperatury. 4.2.2.2. Ekstrakcja jonów metali w postaci kompleksów jonowo-asocjacyjnych W stonych roztworach elektrolitów jony maj mniejszy dostp do czsteczek wody gdy warstwa hydratacyjna poszczególnego kationu zostaje zmniejszona. Mog pojawi si wic oddzialywania bezporednie midzy jonami. W wyniku elektrostatycznego oddzialywania przeciwnie naladowanych jonów tworz si asocjaty ­ pary lub tryplety jonów, zachowujce si jak pojedynczy jon. Kompleksy jonowoasocjacyjne powstaj zwlaszcza wtedy, gdy przynajmniej jeden z jonów ma du mas. Na tworzenie si asocjatów ma take wplyw uyty rozpuszczalnik organiczny, który czciowo rozpuszczajc si w wodzie, ogranicza dostp jonów do jej czsteczek. Ekstrakcj jonów metali w postaci kompleksów jonowo-asocjacyjnych dzieli si na kilka grup, ze wzgldu na rodzaj stosowanego odczynnika kompleksujcego. Jedn z grup zwizków tworzcych asocjaty z jonami metali wielowartociowych s halogenkowe kwasy: chlorowodorowy, bromowodorowy, jodowodorowy i tiocyjanowodorowy. Kompleks powstaje poprzez solwatacj protonu czsteczkami rozpuszczalnika. Schemat ekstrakcji jonów metalu trójwartociowego eterem dietylowym w obecnoci duych iloci kwasu chlorowodorowego przedstawiono na rysunku 15. Inn grup pozwalajc ekstrahowa jony metali oraz kwasy organiczne i nieorganiczne s aminy o duych masach czsteczkowych, np. tributyloamina (TBA), tri-n-oktyloamina (TOA) czy metylo-di-noktyloamina (MDOA). Ich roztwory w benzenie, ksylenie, chloroformie czy alkoholu amylowym umoliwiaj ekstrakcj z kwasowych roztworów jonów metali, kwasów (np. HNO3, HClO4) oraz heteropolikwasów (np. kwasu molibdenokrzemowego

62

ETAP I (powstawanie uwodnionego anionu)

ETAP II (wymiana czsteczek wody, solwatujcych anion i kation

wodorowy, na czsteczki eteru dietylowego)

ETAP III (tworzenie i polimeryzacja asocjatu)

xn

Rysunek 15. Schemat ekstrakcji jonów metalu trójwartociowego eterem dietylowym w obecnoci duych iloci kwasu chlorowodorowego

Azotany wielowartociowych metali mona ekstrahowa ze rodowiska kwanego jako asocjaty z eterem dietylowym, ketonem metylowo-izobutylowym, fosforanem tri-n-butylowym (TBP), fosforanem tri-noktyloaminy (TOPO) i in. w obecnoci jonów azotanowych w duym steniu, pochodzcych od takich soli, jak: Al(NO3)3, Ca(NO3)2 czy NH4NO3. Asocjaty te, jak np. Ce(NO3)4 4TBP czy Zr(NO3)4 2TOPO, mona ekstrahowa rozpuszczalnikami organicznymi. Due kationy organiczne, jak jon tetrafenyloarsoniowy [As(C6H5)4]+ czy jon tetrafenylofosfoniowy [P(C6H5)4]+ nie wymagaj solwatacji aby utworzy asocjaty z anionami ( Asocjaty te ekstrahuje si niepolarnymi rozpuszczalnikami. W tabeli 5 podano przyklady ekstrakcji jonów metali za pomoc odczynników kompleksujcych. Podstawowym celem analizy specjacyjnej jest okrelenie toksycznego i ekotoksycznego dzialania poszczególnych pierwiastków. Sposób oddzialywania pierwiastków na wod, gleb, osady oraz na ludzi, zwierzta i roliny jest bardzo zaleny od ich formy chemicznej. Dzialanie toksyczne np. metali jest silniej zwizane z ich form chemiczn ni z calkowitym steniem. Na bioprzyswajalno rónych form pierwiastków wplywa równie ich rozmieszczenie w poszczególnych elementach rodowiska naturalnego. Analiz specjacyjn wykonuje si w kontroli produktów ywnociowych, badaniu leków i innych produktów farmaceutycznych, w kontroli procesów technologicznych, kontroli stanowisk pracy i in. Badania specjacji s wykonywane równie dla poznania pelnych cykli biogeochemicznych poszczególnych pierwiastków.

63

Tabela 5. Zastosowanie odczynników kompleksujcych do ekstrakcji jonów niektórych pierwiastków Pierwiastek Nikiel Odczynnik kompleksujcy Dimetyloglioksym Rozpuszczalnik Chloroform Warunki ekstrakcji Zasadowe lub obojtne Uwagi Oddziela si jony niklu od jonów miedzi, elaza, kobaltu, chromu, manganu i in. Usuwanie elaza przeszkadzajcego w oznaczaniu innych pierwiastków Oddziela si jony kobaltu od jonów elaza(III), miedzi(II) i innych Do oznaczania domieszek kobaltu w niklu Przeszkadzaj fosfor(V), arsen(V) i german(IV) Przy wyszej kwasowoci ekstrahuj si jony ceru(IV), toru i cyrkonu

elazo(III)

Kwas solny

Eter dietylowy, wysze ketony, etery i estry Keton metylowoizobutylowy Tetrachlorek wgla (tylko do rozcieczenia) Alkohol izopentylowy Toluen (tylko do rozcieczenia)

Kwas solny 6 mol L

-1

Kobalt

Izotiocyjanian

Slabo kwane

Kobalt

Tri-n-oktyloamina

Kwas solny 1:1

Krzem Uran(VI)

Molibdenian(VI) amonu Kompleks azotanowy sol watowany tri-nbutylofosoranem

Kwane Kwas azotowy 0,1-1 mol L-1 oraz due stenie azotanu(V) Zmienne pH

Róne metale

8-Hydroksychinolina, Chloroform dietyloditiokarbaminian i ditizon

Stosowane do analizy ladowej wody

W oznaczaniu calkowitej zawartoci metali skladniki próbki s przewanie niszczone, a mierzone s tylko oznaczane pierwiastki, natomiast analiza specjacyjna nastrcza znacznie wicej trudnoci. Pierwszym problemem jest stenie metali. Ju calkowite bywa czsto bliskie progu detekcji, a analiza specjacyjna pwoduje dodatkowe jego zmniejszane poprzez podzial na frakcje. Poza tym niektóre formy pierwiastków pozostaj w równowadze z innymi, obecnymi w próbce, dlatego warunki ekstrakcji musz by takie, aby nie naruszy ogólnej równowagi lub naruszy j przynajmniej w nieznacznym stopniu. W zalenoci od celu przeprowadzania, metody analizy specjacyjnej s dzielone w róny sposób. Wg najbardziej podstawowego podzialu, specjacj dzieli si na funkcjonaln, uytkow lub chemiczn. Analiza specjacyjna funkcjonalna sluy do oznaczania analitów wg roli, jak pelni w elemencie rodowiska, z którego zostaly pobrane. Przykladem moe by oznaczanie rtci, która moe by pobierana przez roliny lub elaza, które moe by przyswajane z farmaceutyków.

64

Analiza specjacyjna uytkowa (operacyjna) okrela rodzaj analitów ekstrahowanych dana metod, np. metale ekstrahowane z gleby buforem octanowym lub olów obecny w pyle o rednicy niszej ni 10 µm, frakcje rozpuszczalne lub nierozpuszczalne i in. Analiza specjacyjna chemiczna sluy do oznaczania poszczególnych analitów lub grup analitów, np. stopie utlenienia chromu wystpujcego w danej próbce lub zawarto monometylo- lub dimetylopochodnych. W analizie specjacyjnej chemicznej wyrónia si nastpujce typy:

· · ·

·

analiza specjacyjna przesiewowa, w celu wykrycia i oznaczenia tylko jednej formy analitu, analiza specjacyjna grupowa,w celu oznaczenia okrelonej grupy zwizków w próbce, analiza specjacyjna dystrybucyjna (dotyczy glównie próbek biologicznych), w celu oznaczenia zawartoci analitu w poszczególnych czciach badanego obiektu (roliny, tkankach zwierzcych), analiza specjacyjna indywidualna (najtrudniejsza), w celu rozrónienia i oznaczenia wszystkich indywiduów chemicznych, zawierajcych w swoim skladzie dany pierwiastek.

W analizie specjacyjnej wykorzystuje si wszystkie dostpne techniki rozdzielania, w tym techniki ekstrakcyjne. Do izolacji rónych form pierwiastków stosuje si ekstrakcj chemiczn, polegajc na traktowaniu próbki odczynnikiem lub odczynnikami symulujcymi warunki rodowiskowe naturalne lub zmienione antropogenicznie Ekstrakcja moe by jednoetapowa lub wieloetapowa.

Ekstrakcj jednoetapow przeprowadza si odczynnikiem, który podobnie jak w naturze, umoliwia przechodzenie metali do gleby, wód czy rolin. S to najczciej roztwory o odczynie obojtnym, o duej sile jonowej lub kompleksujce, powodujce uwalnianie zaadsorbowanych skladników:

· · ·

niezbuforowane roztwory soli (CaCl2, NaNO3, NH4NO3, BaCl2), roztwory buforowe (NH4OAc/AcOH), roztwory zwizków kompleksujcych (kwas etylenodiaminotetraoctowy EDTA, kwas dietylenotriaminopentaoctowy DTPA, EDTA-AcOH/NH4OAc, DTPA + trietanoloamina TEA).

Ekstrakcja wieloetapowa polega na kolejnych ekstrakcjach roztworami o wzrastajcej sile lugowania i moe by prowadzona równolegle oraz sekwencyjnie. Ekstrakcje równolegle prowadzi si, aby wyeliminowa wplyw innych odczynników.

Ekstrakcja sekwencyjna polega na roztwarzaniu i lugowaniu tej samej próbki kolejno rónymi odczynnikami, którymi najczciej s, stosowane w kolejnoci:

· · · · ·

niezbuforowane roztwory soli, roztwory buforowe lub roztwory slabych kwasów, roztwory zwizków redukujcych, roztwory zwizków utleniajcych, mocne kwasy.

65

Ekstrakcje wieloetapowe przeprowadzane s wg rónorodnych procedur i z zastosowaniem rónych odczynników. Najczciej, za podstawow metod przyjmuje si procedur opracowan w 1979 r. przez A. Tessiera, P. Campbella i M. Bisona, która umoliwia oznaczanie piciu frakcji. Schemat tej ekstrakcji przedstawiono na rysunku 16.

1 mol/dm3 MgCl2, pH 7,0 lub 1 mol/dm3 NaOAc, pH 8,2

Próbka Frakcja jonowymienna, metale zaadsorbowane na powierzchni cial stalych Pozostalo Frakcja wglanowa, metale zwizane z wglanami Pozostalo Frakcja tlenkowa, metale zwizane z uwodnionymi tlenkami elaza i manganu Pozostalo Frakcja organiczna i siarczkowa, metale zwizane lub zaadsorbowane na powierzchni materii Frakcja pozostala, metale trwale zwizane z mineralami, wbudowane w sie krystaliczn

1 mol/dm3 NaOAc, pH 0,04 mol/dm3 NH2OH·HCl/25%AcOH lub0,3 mol/dm3 Na2S2O4/ 0,175 mol/dm3 cytrynian trisodu/ 0,025 mol/dm3 kwas cytrynowy a)0,02 mol/dm3 HNO3+30%H2O2pH 2 b)30%H2O2pH 2 (HNO3) c)3,2 mol/dm3 NH4AcOH /20%HNO3 HF + HClO4

Pozostalo

Rysunek 16. Schemat ekstrakcji sekwencyjnej wg A. Tessiera i wsp. Dla umoliwienia porównywania wyników w Krajach Unii Europejskiej w ramach Programu Pomiarów i Testowania (Standard Measurement and Testing Programme, SM&T) przyjto wspólne procedury ekstrakcji metali cikich z gleb mineralnych, zarówno dla metody jednoetapowej jak i sekwencyjnej. Do izolacji Cd, Pb, Cr, Ni, Cu, i Zn zatwierdzono 0,43 M kwas octowy i 0,005 M EDTA. Zatwierdzone przez SM&T warunki ekstrakcji sekwencyjnej przedstawiono w tabeli 6.

66

Tabela 6. Schemat procedury analizy sekwencyjnej wg europejskiego programu standaryzacji SM&T Etap 1 2 3 Frakcja metali (ladów) Jonowymienna i wglanowa Tlenkowa Organiczna i siarczkowa Sklad wodnego roztworu ekstrahujcego c[mol L-1] CH3COOH (0,11 ) NH2OH·HCl (0,1) przy pH 2 (HNO3) H2O2 (8,8) przy pH 2(HNO3); CH3COONH4 (1.0), pH 2

4.2.3. Klasyczna technika ekstrakcji ciecz ­ ciecz Najprostszym sposobem ekstrakcji ciecz ­ ciecz jest ekstrakcja w rozdzielaczu zwana periodyczn. Próbk ciekl umieszcza si w rozdzielaczu (rysunek 17a), dodaje rozpuszczalnika ekstrahujcego i wytrzsa rcznie lub mechanicznie. Nastpnie pozostawia do rozdzielenia warstw. Ekstrakcj powtarza si wielokrotnie a polczone ekstrakty przemywa czyst ciecz, w której byla rozpuszczona próbka. W przypadku próbek wodnych, ekstrakty przemywa si wod lub roztworem wodnym zawierajcym odczynniki, jeli byly one dodane do próbki przed ekstrakcj. Odmyty z domieszek ekstrakt naley wysuszy rodkiem suszcym, np. bezwodnym siarczanem(VI) sodu i odparowa.

chlodnica wodna

naczynie ekstrakcyjne

rozpuszczalnik

próbka

ekstrakt belkotka

ekstrakt

próbka grzanie

rozpuszczalnik grzanie

a)

b)

c)

Rysunek 17. Rozdzielacz gruszkowy (a) i zestawy do ekstrakcji ciglej (b i c) 4.2.4. Ekstrakcja cigla Nie zawsze mona dobra rozpuszczalnik, dla którego stala podzialu ekstrahowanej substancji bdzie miala du warto. W takich przypadkach, by ograniczy iloci zuywanego do ekstrakcji rozpuszczalnika, stosuje si ekstrakcj cigl (ang. liquid-liquid extraction, CLLE). Budowa aparatów 67

do ekstrakcji ciglej ciecz ­ ciecz próbek wodnych zaley od tego, czy rozpuszczalnik jest lejszy czy ciszy od wody. Budow ich przedstawiono na rysunkach 17b i 17c. Ekstrakcja prowadzona jest cigle wie porcj rozpuszczalnika. Na rys. 17b przedstawiono schemat ekstrakcji rozpuszczalnikiem lejszym od wody. Rozpuszczalnik splywa z chlodnicy rurk na dno i przez belkotk zatopion na kocu rurki przenosi si w postaci drobnych kropelek przez próbk, ekstrahujc j. Belkotka umoliwia rozwiniecie powierzchni styku faz i zwikszenie wydajnoci ekstrakcji. Ekstrakt zbiera si nad wod, nastpnie przelewa rurk boczn do odbieralnika ogrzewanego, skd rozpuszczalnik odparowuje i skrapla si w chlodnicy a w odbieralniku zagszcza si ekstrakt. Na rysunku 17c przedstawiono schemat ekstrakcji rozpuszczalnikiem ciszym od wody. Ekstrakcja przebiega podobnie, a substancja ekstrahowana gromadzi si w odbieralniku. Poniej podano kilka warunków ekstrakcji, ulatwiajcych jej wykonanie:

·

rozdzielacz powinien mie szczelne zamknicia, szlifów nie mona smarowa smarami, poniewa rozpuszczaj si w wikszoci rozpuszczalników,

· ·

rozdzielacze w ksztalcie gruszki (rysunek 17a) ulatwiaj rozdzielenie warstw, pojemno rozdzielacza powinna by dwukrotnie wiksza od objtoci ekstrahowanej próbki,

·

ilo rozpuszczalnika ekstrahujcego nie powinna by zbyt mala, zwykle stosuje si ilo stanowic ok. 1/3 objtoci roztworu próbki,

·

na pocztku ekstrakcji wytrzsanie naley przeprowadza bardzo delikatnie, by nie doprowadzi do gwaltownego wzrostu cinienia i czsto otwiera kran dla wyrównania cinienia,

·

po ustaleniu si cinienia w rozdzielaczu, wytrzsanie mona wykonywa energicznie przez kilka minut,

·

gdy rozpuszczalnik jest lejszy od roztworu próbki, ekstrakt stanowi górn warstw; w takim ukladzie, by unikn zanieczyszczenia ekstraktu roztworem próbki, doln warstw spuszcza si przez kran a ekstrakt (górna warstwa) wylewa si z rozdzielacza górnym otworem,

·

najczciej wykonuje si trzykrotn ekstrakcj, dla sprawdzenia czy substancja zostala wyekstrahowana, pobiera si mal objto ostatniej porcji ekstraktu, odparowuje rozpuszczalnik i sprawdza ilo suchej pozostaloci,

·

ekstrahowanej próbki nie wylewa si dopóki nie zostanie wyizolowany czysty produkt (mona wtedy naprawi ewentualne bldy).

Do rozdzielania mieszaniny substancji o zblionych wartociach stalych podzialu stosuje si ekstrakcj przeciwprdow, któr przeprowadza si w specjalnych aparatach, np. aparacie Craiga. Aparat taki sklada si z wielu elementów (np. 120). Do jednego lub kilku elementów wprowadza si próbk, pozostale napelnia faz ekstrahujc. Na ekstrakcj sklada si kilka etapów:

68

wytrzsanie (wszystkie elementy poruszaj si i w elementach z próbk nastpuje wymieszanie faz), · stan spoczynku, w którym nastpuje rozdzielenie si warstw, · etap przenoszenia fazy; aparat jest tak zbudowany, e umoliwia przelewanie si fazy górnej do kolejnego elementu (daje to efekt ,,poruszania si faz w przeciwprdzie"), · etapy jednostkowe przeprowadzane s wielokrotnie. Czas mieszania i odstawania oraz ilo pojedynczych procesów ustala si dowiadczalnie w zalenoci od skladu próbki i wlaciwoci ekstrahenta. Ekstrakcja przeciwprdowa umoliwia rozdzielanie skomplikowanych mieszanin nawet, gdy rónice w zawartoci poszczególnych skladników s due. Pozwala take na wydzielanie skladników w bardzo czystym stanie i okrelanie ich stosunku ilociowego w mieszaninie. Ekstrakcja przeciwprdowa stosowana jest do celów analitycznych i preparatywnych. 4.2.5. Mikroekstrakcja Techniki mikroekstrakcji w ukladzie ciecz ­ ciecz (ang. liquid-liquid microextraction, LLME) charakteryzuj si malym zuyciem rozpuszczalników, co jest korzystne dla rodowiska naturalnego i zdrowia. Stosowanie niewielkich iloci rozpuszczalników ogranicza te zdecydowanie liczb operacji wykonywanych podczas ekstrakcji. 4.2.5.1 Mikroekstrakcja do rozpuszczalnika Mikroekstrakcja do rozpuszczalnika (ang. microscale solvent extraction, MSE) zostala zastosowana we wstrzykowej analizie przeplywowej. Metoda ta polega na wstrzykiwaniu plynnej próbki do strumienia cieczy nonej, przeplywajcej przez rurk o malej, stalej rednicy, w której znajduje si odczynnik reagujcy z analitem. Rozmiary rurki i prdko przeplywu cieczy nonej jest dostosowana do szybkoci zachodzenia reakcji chemicznej (ta cz rurki, w której zachodzi reakcja jest w postaci spirali). Wstrzyknita próbka tworzy w strumieniu nonym odpowiedni stref przemieszczajc si do detetektora. Jeli do strumienia cieczy nonej, w miejscu, w którym próbka jest ju spochodniona, doprowadzi si rozpuszczalnik, calo wymiesza si i nastpi ekstrakcja analitu do fazy organicznej (w spirali ekstrakcyjnej). Mieszanina wplywa nastpnie do separatora grawitacyjnego lub membranowego, gdzie faza organiczna jest oddzielona i kierowana do detektora. W metodzie tej zuycie rozpuszczalników jest zdecydowanie mniejsze w porównaniu do iloci zuywanych w metodach tradycyjnych (np. 1 mL na 1L próbki), poza tym ekstrakcja zachodzi w ukladzie zamknitym i rozpuszczalnik nie odparowuje do atmosfery. 4.2.5.2. Mikroekstrakcja do kropli Mikroekstrakcja do kropli (ang. single-drop microextraction, SDME) jest kolejn technik zmniejszajc w sposób radykalny zuycie rozpuszczalników. Ekstrakcja nastpuje przez rozpuszczanie si skladników próbki w kropli cieczy zawieszonej na kocu igly strzykawki i zanurzonej w próbce. Warunkiem przeprowadzenia ekstrakcji jest wiksza rozpuszczalno analitu w rozpuszczalniku ekstrahujcym ni w próbce. W mikroekstrakcji do kropli wystpuje uklad trójfazowy, gdzie analit ulega podzialowi midzy próbk a faz gazow nad próbk oraz miedzy próbk a ciekl faz organiczn, któr jest kropla. Po osigniciu stanu równowagi, ilo wyekstrahowanego do kropli analitu (m) opisuje równanie:

·

69

m=

gdzie:

K odwVd C 0V s K odwVd + K hsVh + Vs

(42)

Kodw - stala podzialu analitu midzy faz organiczn (kropl) a faz ciekl próbki, Khs - stala podzialu analitu midzy faz gazow nad powierzchni próbki a faz ciekl próbki, Co - steniem pocztkowym analitu w próbce, Vs, Vh i Vd - objtoci odpowiednio próbki, fazy gazowej nad próbk i kropli. Ilo wyekstrahowanego analitu nie zaley od lokalizacji kropli w ukladzie ekstrakcyjnym (bezporednio w roztworze próbki czy w fazie gazowej nadpowierzchniowej nad próbk) pod warunkiem, e objtoci próbki, kropli i fazy gazowej nie zmieniaj si. Metod SDME mona stosowa do próbek cieklych i gazowych. W przypadku próbek cieklych rozpuszczalnik ekstrahujcy nie moe miesza si z próbk lub miesza si w bardzo ograniczonym stosunku. Zestawy do mikroekstrakcji do kropli z próbek cieklych pokazano na rysunku 18. Jeli kropla rozpuszczalnika jest bezporednio zanurzona w próbce (ang. direct immersion single drop microextraction, DI-SDME), (rysunek 18a), ekstrakcja nastpuje przez podzial analitu midzy dwie ciekle fazy. W drugim przypadku (rysunek 18b), lotne anality z próbki cieklej znajdujce si w fazie gazowej rozpuszczaj si w kropli rozpuszczalnika umieszczonej nad powierzchni próbki (ang. headspace single drop microextraction, HS-SDME). Po odpowiednim czasie ekstrakcji, kropla rozpuszczalnika ekstrahujcego ,,wcigana" jest do strzykawki i przenoszona np. do dozownika chromatografu. Do ekstrakcji mona stosowa pojedynczy rozpuszczalnik lub mieszanin rozpuszczalników w celu uzyskania wikszej selektywnoci. Do ekstrakcji jonów metali stosuje si odczynniki chelatujce, rozpuszczone w organicznym rozpuszczalniku.

mikrostrzykawka

kropla ekstrahujcej cieczy

b

próbka

a)

b)

Rysunek 18. Mikroekstrakcji do kropli, a ­ kropla zanurzona bezporednio w próbce(DI-SDME), bkropla w fazie gazowej nad powierzchni próbki (HS-SDME) 70

W ekstrakcji do kropli znalazly równie zastosowanie ciecze jonowe (por roz II. 4.2.6). Przy wyborze rozpuszczalnika do ekstrakcji naley równie uwzgldni rodzaj techniki stosowanej do oznaczania analitu. W przypadku stosowania chromatografii gazowej w kocowym oznaczaniu, rozpuszczalnik do ekstrakcji musi by tak dobrany, by jego sygnal chromatograficzny nie nakladal si na sygnal analitu.

Wydajno estrakcji zaley glównie od wartoci stalej podzialu K analitu midzy próbk a ekstrahentem oraz od warunków ekstrakcji, takich jak: czas ekstrakcji, intensywno mieszania próbki, wielko kropli oraz pH próbki, zwlaszcza, gdy ekstrahentem jest odczynnik chelatujcy.

Wydluanie czasu ekstrakcji zwiksza jej wydajno, ale tylko do pewnego momentu. Szybki wzrost stenia analitu w kropli obserwuje si w pocztkowej fazie ekstrakcji, dalsze wydluanie czasu daje minimalne przyrosty stenia. Poza tym dlugi czas ekstrakcji moe powodowa niestabilno kropli (rozpuszczanie lub ,,zerwanie"). Zwykle ekstrakcja trwa kilka do kilkanacie minut. Poniewa powierzchnia styku dwóch faz jest bardzo mala, próbk naley miesza mieszadelkiem magnetycznym, umoliwiajc kontakt kropli z kolejn warstw próbki. Mieszanie próbki skraca czas i zwiksza wydajno ekstrakcji. Zwikszanie szybkoci mieszania daje pocztkowo duy wzrost wydajnoci, po czym dalszy wzrost szybkoci mieszania nie daje ju wyranej poprawy, za to staje si niekorzystne dla stabilnoci kropli i powtarzalnoci oznaczania. Objto kropli zaley od gstoci i napicia powierzchniowego rozpuszczalnika ekstrahujcego oraz rozmiarów igly i moe wynosi 1­10 µL, najczciej jednak nie przekracza objtoci 5 µL. Wielko kropli równie wplywa na wydajno ekstrakcji. Optymalne warunki ekstrakcji naley dobra eksperymentalnie dla kadego oznaczenia. Opisana powyej metoda ekstrakcji do kropli jest wersj statyczn. W wersji dynamicznej kropl stanowi niewielki slup cieczy ekstrahujcej, znajdujcy si w czasie ekstrakcji przez caly czas w mikrostrzykawce. Próbk wprowadza si do mikrostrzykawki i pozostawia na kilka sekund, w tym czasie anality z próbki rozpuszczaj si w slupie rozpuszczalnika i jego warstwie przylegajcej do wewntrznej ciany korpusu strzykawki. Tak operacj powtarza si wielokrotnie, uzyskujc kontakt ekstrahenta z kolejnymi, wieymi porcjami próbki. Wzbogacony w analit rozpuszczalnik ze strzykawki wykorzystuje si bezporednio do oznaczenia stosowan technik analityczn. W technice SDME zastosowanie powszechnie stosowanych sposobów wspomagania ekstrakcji jest ograniczone trwaloci kropli. Wspomaganie energi ultradwików czy intensywne mieszanie niszczy kropl. Przy ekstrakcji zwizków organicznych z roztworów wodnych skuteczne jest wysalanie. Metod mikroekstrakcji do kropli po raz pierwszy zastosowano w 1996 roku do ekstrakcji z próbek wodnych rozpuszczalnikami niemieszajcymi si z wod. Przyklady zastosowania SDME podano w tabeli 7. Najczciej stosowanymi rozpuszczalnikami do ekstrakcji próbek wodnych s proste wglowodory, oktanol oraz alkohol benzylowy. Zastosowanie do ekstrakcji znalazly równie ciecze jonowe, np. do ekstrakcji podstawionych fenoli wykorzystano krople heksafluorofosforanu 1-oktylo-3metyloimidazoliowego. Jony metali mona ekstrahowa rozpuszczalnikami organicznymi z roztworów wodnych, stosujc odczynniki kompleksujce. Do wydzielania jonów olowiu z próbek biologicznych (wlosów ludzkich, lici herbaty, mki ryowej) zastosowano odczynnik chelatujcy - 1-fenylo-371

metylo-4-benzoilo-5-pirazolon (PMBP), rozpuszczony w benzenie, nastpnie kropl z chelatem olowiu umieszczano w kuwecie grafitowej i oznaczano metod elektrotermicznej atomowej spektroskopii absorpcyjnej (ET-ASA). Kompleksowanie z O,O-dietyloditiofosforanem oraz technik SDME, z zastosowaniem chloroformu, wykorzystano do oznaczania jonów olowiu metod ET-ASA.

Tabela 7. Niektóre przyklady zastosowania mikroekstrakcji do kropli Analit Lotne zwizki organiczne Chloroorganiczne pestycydy Chlorobenzeny Fosforoorganiczne pestycydy Fosforoorganiczne insektycydy Herbicydy sulfonamidowe BTEX Woda Heksan DI SDME Próbka Rozpuszczalnik ekstrahujcy Sposób ekstrakcji

Woda Woda, soki owocowe Woda Ekstrakty wodne z gleby Woda

Izooktan Toluen Toluen Octan etylu, chlorek metylenu 1-Oktanol, n-heksadekan

DI SDME DI SDME DI SDME DI SDME HS SDME

Zwizki aktywne biologicznie BTEX Zwizki terpenowe aktywne biologicznie Pozostaloci rozpuszczalników

Ekstrakty wodne z rolin Zuyty olej silnikowy Olejki eteryczne Olej rolinny

1-Oktanol n-Heksadekan p-Ksylen Alkohol benzylowy

HS-SDME HS SDME HS-SDME HS-SDME

Przeprowadzanie analitu w odpowiedni do analizy kocowej pochodn moe si odbywa podczas jednej operacji, równoczenie z ekstrakcj i zataniem, jeli kropla rozpuszczalnika ekstrahujcego bdzie zawiera odpowiedni reagent. Ten sposób mona wykorzysta w technice HS-SDME, w której kropla ekstrahenta umieszczona jest w fazie gazowej nad powierzchni próbki. 4.2.5.3. Mikroekstrakcja poprzez membran do fazy cieklej Mikroekstrakcja do kropli obarczona jest ryzykiem jej zniszczenia. Ciecz ekstrahujc mona unieruchomi w porowatym wlóknie (drenie), co zostalo wykorzystane w mikroekstrakcji poprzez membran do fazy cieklej (ang. hollow fibre liquid phase microextraction, HF-LPME). Jest to ekstrakcja w ukladzie ciecz ­ ciecz, gdzie ciecz ekstrahujca znajduje si w przestrzeniach porowatego wlókna zamocowanego na kocach igiel dwóch mikrostrzykawek (rys.19a) lub na kocu igly jednej mikrostrzykawki (rysunek 19b) i zanurzonego w roztworze próbki. Po skoczonej ekstrakcji ekstrakt z 72

drenu zasysany jest do strzykawki. Technika ta umoliwia du selektywno procesu poprzez due moliwoci doboru odpowiedniej cieczy ekstrahujcej oraz rodzaju porowatego wlókna. Due zastosowanie w tej technice znalazl porowaty polipropylen. Poza zabezpieczeniem cieczy ekstrahujcej, male pory wlókna uniemoliwiaj przedostanie sie do niej duych molekul, co jest podane zwlaszcza w analityce plynów biologicznych. Na wydajno ekstrakcji, podobnie jak w technice SDME, wplyw maj takie warunki ekstrakcji, jak: objto próbki i ekstrahenta, intensywno mieszania, czas ekstrakcji, wysalanie oraz pH próbki. Technik t zastosowano do ekstrakcji z roztworów wodnych takich analitów jak np.: aminy aromatyczne, leki o charakterze kwanym lub zasadowym oraz estrogeny.

igly strzykawek

próbka

a)

wlókno polipropylenowe z ekstrahentem

b)

Rysunek 19. Zestawy do mikroekstrakcji przez membran do fazy cieklej, HF-LPME

4.2.6. Ekstrakcja cieczami jonowymi Zastosowanie do mikroekstrakcji, zwlaszcza do mikroekstrakcji do kropli (SDME) znalazly ciecze jonowe. W odrónieniu od konwencjonalnych rozpuszczalników, ciecze jonowe umoliwiaj tworzenie wikszych i stabilniejszych kropli, które nie odparowuj i nie rozpuszczaj si w próbce wodnej. Te korzystne cechy wynikaj ze struktury chemicznej cieczy jonowych, które s solami o niskiej temperaturze topnienia. Wg ogólnie przyjtej definicji ciecze jonowe s to sole organiczne o temperaturach topnienia poniej 100°C i stabilne w powietrzu w szerokim zakresie temperatur. Sporód nich wyróniaj si te, które maj temperatur topnienia równ lub nisz od temperatury pokojowej (ang. room temperature ionic liquids, RTIL). S to nowe rozpuszczalniki o dobrych wlaciwociach rozpuszczajcych dla szerokiego zakresu substancji i korzystnych fizycznych wlaciwociach. RTIL znajduj coraz szersze zastosowanie w technikach separacyjnych. Ciecze jonowe ciekle w temperaturze pokojowej s bardzo interesujcymi rozpuszczalnikami ekstrahujcymi. Znanych jest ponad dwiecie RTIL a liczba dostpnych komercyjnie zwizków wci wzrasta. Glównymi typami cieklych w temperaturze pokojowej cieczy s sole zawierajce w swej strukturze kationy takie jak: alkiloimidazoliowe, alkiloamoniowe, alkilofosfoniowych, alkilopirydyniowe oraz alkilopirolidyniowe. Z kolei najczeciej stosowane aniony to slabe nukleofile takie jak: bis(trifluorometanosulfonylo)imidek, heksafluorofosforan, tetrafluoroboran, perfluoroalkilosulfonian i 73

in. Struktur chemiczn czsto stosowanych, cieklych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych przedstawiono w Tabeli 8. Niska temperatura topnienia cieczy jonowych tlumaczona jest mal symetri czsteczki i delokalizacj ladunku, przeslanianiem jednego lub obu jonów oraz slabym wizaniem wodorowym midzy jonami. Mala symetria czsteczki i delokalizacja ladunku daj du swobod drga, które zwikszaj odlegloci midzyladunkowe i obniaj w ten sposób stabilno sieci krystalicznej i temperatur topnienia. Temperatury parowania cieczy jonowych s wysokie, gdy przed przejciem do fazy gazowej chroni, dzialajce na znaczne odlegloci, oddzialywania kulombowskie.

Tabela 8. Typowe ciecze jonowe Kation Struktura

R4

Kation

Struktura

Alkiloamoniowy

R3

N+ R2 R1

X-

Alkilopirydyniowy

+

N X-

R1

R4

Alkilfosfoniowy

R3

P+ R2 R1

X-

Alkilopirolidyniowy

+ X-

R2 N R1

R1

R2 + N XR4 R3

R4

Alkilosulfoniowy

R3

S+ R1

X-

Alkilotioazoliowy

S

R1 N

R2 + N XR4

Alkiloimidazoliowy

N R2

+ X-

N R1

Alkilotriazoliowy

N R5

Anion X: BF4, PF6, AlCl4, SbF6, CF3SO3, (CF3SO2)2N i in.

Rx: od -CH3 do -C9H19

Niska prno par cieczy jonowych wystpuje w szerokim zakresie temperatur. Termiczn trwalo cieczy jonowej najczciej okrela si przez temperatur pocztku rozpadu. Ciecze jonowe ze slabozasadowymi anionami wykazuj wyjtkow termiczn stabilno w obojtnej atmosferze, pozwalajc na stosowanie w temperaturze powyej 250°C (np. w chromatografii gazowej). Gsto cieczy jonowych RTIL jest przewanie wiksza od gstoci wody (dla najczciej stosowanych wynosi od 0,964 do 1,470 g/mL, w 25°C) i zwykle zmniejsza si wraz ze wzrostem rozmiaru jonów. Ciekle w temperaturze pokojowej ciecze jonowe maj 74

relatywnie nisk lepko, relatywnie naley podkreli, bo wikszo z nich ma lepko powyej 30 cP (lepko wody w temp. 25°C wynosi 0,8937 cP). Lepko cieczy jonowych zwizana jest z rozmiarem anionu, male aniony z rozmytym ladunkiem ujemnym i ograniczon zdolnoci do wizania wodoru obniaj lepko. Ciecze jonowe s ogólnie trudnopalne, a temperatury zaplonu s przynajmniej o 100°C wysze ni temperatury zaplonu konwencjonalnych rozpuszczalników organicznych. Zdolno do solwatacji oraz wlaciwoci fizyczne cieklych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych, takie jak: niska prno par i wysoka gsto, s korzystne w procesie ekstrakcji.

Zdolno do solwatacji jest ogólnie charakteryzowana przez polarno rozpuszczalnika, czyli zdolno rozpuszczalnika do oddzialywa midzyczsteczkowych ze skladnikami rozpuszczonymi, ale nieskutkujca reakcjami chemicznymi. Jest to wypadkowa wszystkich oddzialywa (o polarnoci rozpuszczalnika nie mona mówi w kontekcie pojedynczych czsteczek). Np. azotany i tiocyjaniany alkiloamoniowe maj polarno podobn do wody, z kolei sole alkiloimidazoliowe maj polarno mniejsz ni woda, porównywaln z rozpuszczalnikami polarnymi, jak: dimetylosulfotlenek, krótkolacuchowe alkohole alifatyczne i in. Wszystkie ciecze jonowe s dipolarne/polaryzowalne i posiadaj wlaciwoci tworzenia wiza wodorowych, co powoduje ich dobre wlaciwoci solwatacyjne i dobr rozpuszczalno szerokiego zakresu zwizków organicznych i nieorganicznych a take rónych biomolekul w tym enzymów i biopolimerów, takich jak np. celuloza. Poprzez odpowiedni dobór kationu i anionu cieczy jonowej mona z powodzeniem manipulowa takimi cechami fizykochemicznymi jak lepko, gsto, rozpuszczalno z

odpowiednimi rozpuszczalnikami i In. Wikszo z dostpnych wspólczenie cieczy jonowych moe calkowicie lub czciowo miesza si z polarnymi rozpuszczalnikami organicznymi (np. metanolem, acetonitrilem, tetrahydrofuranem, dichlorometanem, acetonem, i in.). Ciecze mog te tworzy wydajne dwufazowe uklady z organicznymi rozpuszczalnikami o niskiej polarnoci (np. heksanem, toluenem, eterami alkilowymi) lub z wod. Rozpuszczalno w wodzie zaley bardziej od rodzaju anionu ni kationu. Sole alkiloimidazoliowe z anionami halogenkowymi, etanolanowym, azotanowym i trifluorooctowym calkowicie mieszaj si z wod. Sole z anionami heksafluorofosforanowymi oraz bis(trifluorometanosulfonylo)imidkowymi ogólnie nie mieszaj si z wod, natomiast sole anionów tetrafluoroboranowych i trifluorosulfonianowych mieszaj si calkowicie lub wcale, w zalenoci od dlugoci lacucha alkilowego w strukturze kationu. Wszystkie tetrafluoroborany alkiloimidazoliowe s ogólnie rozpuszczalne w acetonie i dichlorometanie. Z kolei dicyjanoimidki 1-etylo-3metyloimidazoliowe, N,N-dialkilopirolidyniowe i tetralkiloamoniowe mieszaj si bez ogranicze z wod i wikszoci rozpuszczalników organicznych, z wyjtkiem heksanu i toluenu; metanosulfonian i etanosulfonian 1,3-dialkiloimidazoliowy mieszaj si z wod i z wikszoci zwyklych, polarnych rozpuszczalników organicznych. W wikszoci zastosowa cieklych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych w technikach separacyjnych, dwie wlaciwoci odróniaj je na korzy od konwencjonalnych

rozpuszczalników: wysoka termiczna trwalo i pomijalna prno par w szerokim zakresie temperatur. 75

Gsto cieklych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych, które tworz uklady dwufazowe z wod lub rozpuszczalnikami organicznymi, umoliwia szybkie rozdzielenie faz, co jest korzystne w przypadku ich stosowania w metodach ekstrakcyjnych. Niepodan cech w porównaniu z konwencjonalnymi rozpuszczalnikami jest wysoka lepko. Procedury przygotowania próbek, polegajce na pompowaniu cieczy jonowej wymagaj dla normalnej pracy aparatu lepkoci poniej 5 cP. Lepko RTIL moe by obniana do podanego zakresu przez podwyszenie temperatury lub przez rozcieczenie z mieszajcym si rozpuszczalnikiem organicznym. Pomijalna prno par minimalizuje zanieczyszczenie rodowiska naturalnego poprzez odparowanie, co jest glównym problemem w przypadku stosowania konwencjonalnych rozpuszczalników organicznych oraz pozwala na stosowanie ukladów próniowych bez istotnych strat. W technikach separacyjnych najwiksze zastosowanie ciekle w temperaturze pokojowej ciecze jonowe znalazly w ekstrakcji próbek wodnych, do izolacji zarówno zwizków organicznych jak i nieorganicznych. Jeli analiza wlaciwa analitu jest przeprowadzana technik uniemoliwiajc bezporednie zastosowanie cieczy jonowej (np. za pomoc chromatografii gazowej) konieczna jest zamiana tego medium na inn matryc. Odzyskanie ekstrahowanych substancji mona przeprowadzi przez destylacj, sublimacj lub ekstrakcj rozpuszczalnikiem organicznym (ewentualnie po derywatyzacji). RTIL nie mona wprowadza bezporednio do chromatografu gazowego z powodu ich niskiej lotnoci, co moe powodowa ich kumulacj w dozowniku i na kolumnie chromatograficznej, obniajc sprawno separacji. Przyklady zastosowania cieklych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych w ekstrakcji zwizków organicznych i nieorganicznych przedstawiono w Tabeli 9. Cieczami jonowymi mona ekstrahowa zwizki wystpujce w formie obojtnej lub jonowej. Jeli zwizek jest w formie jonowej, np. fenol - jako anion fenolanowy, ekstrakcja zachodzi wg mechanizmu wymiany jonowej, czyli taka sama ilo anionów cieczy jonowej musi przej do fazy wodnej, ile anionów fenolanowych przechodzi do cieczy jonowej. Fenole mog by ekstrahowane w formie obojtnej i formie anionowej, a wydajno ekstrakcji zaley od rodzaju cieczy jonowej. Dla niektórych fenoli ekstrakcja byla wydajniejsza w warunkach, gdy fenol byl w formie zjonizowanej. Wydajno ekstrakcji fenoli z wody za pomoc RTIL moe by 10 razy wiksza ni dla dichlorometanu. Zastosowanie cieczy cieklych w temperaturze pokojowej w technikach mikroekstrakcji, jak ekstrakcja do pojedynczej kropli w fazie nadpowierzchniowej (HS-SDME) i cieklej (DI-SDME), mikroekstrakcja poprzez membran do fazy cieklej (HF-LPME) oraz mikroekstrakcji do fazy stalej (SPME), wynikaj glównie z ich wlaciwoci fizycznych. Stosowane w SDME ciecze jonowe daj wiksze i stabilniejsze krople, co umoliwia szybsze mieszanie próbki i dluszy czas ekstrakcji. RTIL z kationem 1,3dialkiloimidazoliowym daj wspólczynnik wzbogacenia od 5 do 200 dla typowych niskomolekularnych substancji. Technika SDME czy HF-LPME przy uyciu cieczy jonowych cieklych w temperaturze pokojowej moe by bezporednio lczona z chromatografi cieczow w ukladzie odwróconych faz z wodnymi fazami ruchomymi. W przypadku analizy technik chromatografii gazowej, wymagany jest dozownik z wyjmowan wkladk, z której lotne skladniki s odparowywane w temperaturze pokojowej, a usuwanie wkladki zapobiega kumulowaniu si cieczy jonowej w dozowniku i na kolumnie. Przyklady zastosowa cieczy jonowych w mikroekstrakcji przedstawiono w Tabeli 10.

76

Tabela 9. Przyklady zastosowania cieklych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych (RTIL), jako cieczy ekstrahujcych Analit Próbka Ciekla w temperaturze pokojowej ciecz jonowa (RTIL) heksafluorofosforan 1-butylo -3metyloimidazoliowy Wspólczynnik podzialu 1 ÷ 97

Benzenowe lub naftalenowe pochodne z pojedyncz grup fenolow Fenol, tyrozol, kwas phydroksybezoesowy, bisfenol A, pentachlorofenol, 4-oktylofenol, 4-nonylofenol Benzen

Woda

Woda

tetrafluoroboran 1-alkilo-3metyloimidazoliowy

Porównywalny z n-oktanol/woda

Woda

heksafluorofosforan 1-butylo-3metyloimidazoliowy mrówczan 3-(dimetyloamino) -1propyloamoniowy heksafluorofosforan 1-butylo -3trimetylosililoimidazoliowy etylosulfonian 1-etylo-3metylopirydyniowy heksafluorofosforan 1-butylo -3metyloimidazoliowy heksafluorofosforan 1-alkilo-3metyloimidazoliowy Róne RTIL

Porównywalny z n-oktanol/woda -

Bialka

Komórki drody Krew ludzka Heksan Woda

Hemoglobina

Ksyleny Jony metali cikich w postaci kompleksu z ditizonem Jony rtci (bez kompleksowania) Toluen, cykloheksanon, nonanol1, kwas octowy, kwas heksanowy Kwasy naftalenosulfonowe (barwniki azowe)

-

Woda Woda

Wyszy ni n-oktanol/woda

Woda

bis(trifluorometanosulfonylo)imidek N-butylo-Netylopirolidyniowy

ok. 2 (2 lub 3 ekstrakcje dawaly 95 % wydajnoci) 3 ÷ 20

Amoxicilina, ampicylina (antybiotyki)

Woda

heksafluorofosforan 1-butylo-3metyloimidazoliowy, heksafluorofosforan i tetrafluoroboran 1-heksylo-3metyloimidazoliowy, tetrafluoroboran 1-oktylo-3metyloimidazoliowy

77

Tabela 10. Zastosowanie cieczy jonowych RTIL w technice mikroekstrakcji Analit BTEX, halometany, chlorobenzeny, chloroaniliny Benzofenony Próbka Woda Ciecz jonowa Technika ekstrakcji

heksafluorofosforan 1 -oktylo-3- HS-SDME metyloimidazoliowy

Mocz

heksafluorofosforan metyloimidazoliowy

1-butylo-3- DI-SDME

WWA, alkilofenole

Woda

heksafluorofosforan metyloimidazoliowy

1-butylo-3- DI-SDME

Chlorofenole alifatyczne, wglowodory aromatyczne

Woda

heksafluorofosforan 1-butylo-3-metyloimidazoliowy heksafluorofosforan metyloimidazoliowy 1-oktylo-3-

HF-LPME

Amfetamina, metamfetamina

Mocz

1-winylo-3-alkiloimidazoliowa SPE ciecz jonowa chemicznie zwizana z wlóknem z krzemionki

Wodne uklady dwufazowe tworzone s zwykle przez dwie substancje o rónych wlasnociach (szczególnie o rónym powinowactwie do wody) w mieszaninie z wod. Trójskladnikowa mieszanina o okrelonym steniu w odpowiedniej temperaturze tworzy dwie wodne fazy o rónym skladzie. Wodny uklad dwufazowy mona stosowa do ekstrakcji ciecz - ciecz, a rozpuszczone substancje ulegaj podzialowi midzy dwie wodne fazy.

Ta technika jest szeroko stosowana do oczyszczania biopolimerów, poniewa jest selektywna, tania, rozdzielenie faz nastpuje szybko i mona j zaadaptowa do procesów ciglych, a ekstrahowane substancje zachowuj aktywno biologiczn. W technice dwufazowych roztworów wodnych podejmowano próby zastosowania niskotemperaturowych cieczy jonowych. Mieszanin trójskladnikow tworz ciecz jonowa, sól nieorganiczna i woda, w której ciecz jonowa wspólzawodniczy z sol nieorganiczn o czsteczki wody. Sól nieorganiczna ma wiksze powinowactwo do wody, wic hydratacja cieczy jonowej bdzie si zmniejszala, bo czsteczki wody bd przemieszczaly si od jonów cieczy jonowej do jonów soli nieorganicznej. Zmniejszenie hydratacji cieczy jonowej powoduje zmniejszenie jej rozpuszczalnoci w wodzie, co sprawia, e faza bogatsza w ciecz jonow oddziela si od reszty roztworu, dziki czemu powstaje uklad dwufazowy. Najkorzystniejsze cechy do zastosowania w technice dwufazowych ukladów wodnych maj sole kationów 1,3-dialkiloimidazoliowych, których zdolno do tworzenia dwóch faz jest w przyblieniu 78

odwrotnie proporcjonalna do rozpuszczalnoci w wodzie. Stosowane w tych ukladach sole nieorganiczne to: fosforany(V), siarczany(VI), wglany lub cytryniany amoniowe, potasowe lub sodowe. Faz wodn wzbogacon w ciecz jonow mona bezporednio analizowa metod chromatografii cieczowej. Wodne uklady dwufazowe z RTIL stosowane s do ekstrakcji niskoczsteczkowych skladników, np.: alkaloidów z rolin, tryptofanu, testosteronu i epitestosteronu w moczu, a najczciej stosowanym dwufazowym ukladem ekstrakcyjnym jest mieszanina chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowego lub bromku z fosforanem(V) lub kwanym fosforanem(V) sodu. 4.3. Ekstrakcja w ukladzie ciecz ­ cialo stale 4.3.1. Ekstrakcja do fazy stalej Klasyczna ekstrakcja ciecz-ciecz jest latwa, niewymagajca specjalistycznego sprztu, ale czasochlonna i wymagajca duej iloci czystych rozpuszczalników. Du redukcj czasu analizy i objtoci uywanych rozpuszczalników i zwizanego z tym zmniejszenia szkodliwych odpadów i zwikszenia bezpieczestwa pracy, daje ekstrakcja do fazy stalej (ang, solid phase extraction, SPE). Termin ten oznacza sposób izolowania analitu w ukladzie ciecz ­ cialo stale, wykorzystujcy zjawisko podzialu analitu midzy ciekl próbk a staly sorbent. Rozwój technik ekstrakcji do fazy stalej nastpil w latach siedemdziesitych ubieglego wieku, po pojawieniu si latwo dostpnych i trwalych sorbentów o rónorodnych wlaciwociach chemicznych. Do techniki SPE wykorzystano zmodyfikowane powierzchniowo materialy krzemionkowe czy polimerowe, podobne do tych, które s szeroko stosowane w HPLC. S to adsorbenty, takie jak: el krzemionkowy, florisil, tlenek glinu, krzemionka modyfikowana grupami alkilowym (np. C-18), fenylowymi, cyjanowymi, propyloaminowymi i in. W technice SPE stosuje si równie rónego rodzaju modyfikacje polimeru diwinylobenzenu (DVB), sorbenty wykluczania immunologicznego, polimery z nadrukiem molekularnym lub fazy stacjonarne stosowane w chromatografii jonowymiennej (SCX, SAX). Sorbentem o najwikszym znaczeniu w technice SPE jest krzemionka, gdy jest wygodnym nonikiem rónych grup funkcyjnych. ,,Czysta" krzemionka, zawierajca na swej powierzchni wolne grupy silanolowe (SiOH), która silnie adsorbuje polarne zwizki, przy czym jest to oddzialywanie na tyle silne, e odzysk zaadsorbowanych substancji jest znacznie utrudniony. Zmodyfikowanie powierzchni elu krzemionkowego poprzez zastpienie wolnych grup silanolowch grup cyjanow (CN), aminow (NH2) czy diolow (COHCOH) powoduje zmniejszenie sily oddzialywa silnie polarnych zwizków z krzemionk i umoliwia ich ekstrakcj. Ten typ sorbentów nosi nazw zwizanych faz normalnych (NP). Z kolei zastpienie grup silanolowch grupami oktylowymi (C-8), oktadecylowymi (C-18) czy alkilofenylowymi (RC6H5) sprawia, e krzemionka staje si sorbentem niepolarnym i nosi nazw faz odwróconych (RP). W tym przypadku powstaj silne, ale odwracalne oddzialywania niepolarnych lub slabo polarnych substancji ze zmodyfikowan powierzchni krzemionki, co umoliwia ich ekstrakcj z polarnego rozpuszczalnika. Zasada rozdzielania metod SPE zaley glównie od natury sorbentu. Silami warunkujcymi oddzialywania midzy analitem a stalym adsorbentem polarnym (np. el krzemionkowy, tlenek glinu) s wizania wodorowe, oddzialywania dipol-dipol, dipol indukowany-dipol oraz sily dyspersyjne (van der Waalsa) (por. roz. I.2.3). Ten typ ekstrakcji oparty jest na takich samych zasadach jak chromatografia adsorpcyjna. Gdy zastosowanym sorbentem jest krzemionka z chemicznie zwizan grup polarn, np. aminow (uklad faz normalnych) lub niepolarn, np. oktadecylow (uklad faz odwróconych) zasada rozdzielania jest taka, jak w chromatografii podzialowej (por. roz. III.2.4). Naley pamita, e istnieje moliwo rónych 79

oddzialywa midzy grupami funkcyjnymi analitu a powierzchni sorbentu i mimo, e mechanizm rozdzielania na fazach zwizanych jest podzialowy, w rzeczywistoci przebiega w duym stopniu przy udziale procesów adsorpcyjnych. Celem rozdzielania metod SPE jest przygotowanie próbki do analizy wlaciwej, czyli wyizolowanie analitu z matrycy w maksymalnie czystej i skoncentrowanej postaci. Moe by to osignite na dwa sposoby: mona wyeluowa analit, podczas gdy zanieczyszczenia s zatrzymywane lub odwrotnie, dany analit jest zatrzymywany na kolumnie, podczas gdy zanieczyszczenia s usuwane z kolumny. Ekstrakcja do fazy stalej zachodzi tylko wówczas, gdy wizanie pomidzy sorbentem a analitem jest silniejsze ni oddzialywanie wywierane przez rozpuszczalnik lub matryc próbki. Anality zatrzymane na zlou mona odzyskiwa przez mineralizacj zloa, ekstrakcj rozpuszczalnikami organicznymi czy desorpcj termiczn. Do najczstszych metod naley jednak ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi. W procesie wymywania eluent musi posiada silniejsze powinowactwo do analitu ni sorbent. Zwykle stosuje si: metanol, acetonitryl, aceton, izopropanol, dichlorometan, pentan oraz mieszaniny tych rozpuszczalników. Naley pamita, e stosowane w kolumienkach SPE fazy stacjonarne wykonane na bazie materialów krzemionkowych s stabilne w zakresie pH od 2 do 7,5; w odczynie alkalicznym el krzemionkowy moe si rozpuci a w odczynie silnie kwanym mog ulec hydrolizie wizania midzy grupami silanolowymi a podstawnikami modyfikujcymi el krzemionkowy. Chemicznie zwizane fazy stacjonarne posiadaj znaczn (od 1 do 5% masy sorbentu) zdolno umiarkowanie selektywnego wychwytu rónorodnych substancji, co umoliwia zminiaturyzowanie procesu ekstrakcji. W praktyce uywa si najczciej komercyjnie przygotowane kolumienki szklane lub polipropylenowe, zawierajce od 100 mg do 2 g sorbentu stalego, zawartego midzy dwoma porowatymi filtrami oraz system próniowy ze statywem na odbieralniki, manometrem kontrolnym i zaworem regulujcym. Ponadto w sklad systemu wchodz zlcza i zawory umoliwiajce lczenie kilku kolumienek tej samej lub rónej wielkoci. Ziarna wypelnienia w kolumienkach SPE maj rednic 40 m (wiksz ni stosowane w HPLC) a take nieregularny ksztalt, co umoliwia szybki przeplyw fazy ruchomej. Budowa pojedynczej kolumienki SPE oraz zestawu szeregu kolumienek podlczonych do próni przedstawiona jest na rysunku 20. Elucja analitów wymaga rozpoznania pochodzenia próbki, potencjalnych substancji przeszkadzajcych (interferentów) i wlaciwoci fizyko-chemicznych oznaczanych substancji. Dobór rozpuszczalnika do elucji zaley od miejsca rozpuszczalnika w szeregu eluotropowym w stosunku do analitu, rodzaju fazy stalej oraz od wymaga kolejnych etapów procedury oznaczania (np. lotno, moliwo zastosowania detektora spektrofotometrycznego UV/Vis). Ekstrakcj z wody zwizków niepolarnych wykonuje si, stosujc niepolarn faz, najczciej krzemionk zmodyfikowan grupami oktadecylowych (C-18) lub sorbenty polimerowe o wlaciwociach odwróconych faz. Do elucji stosuje si takie rozpuszczalniki, jak: dichlorometan, pentan, heksan, aceton, octan etylu, acetonitryl lub ich mieszanina. Mona te wymywa substancje kolejno rónymi rozpuszczalnikami, rónicymi si sil elucyjn - ekstrakcja sekwencyjna. Efektywno zagszczania metod SPE wyraa si wspólczynnikiem wzbogacenia analitu k, opisanego wzorem: V (43) k= W VE gdzie: VW - objto wody przepuszczona przez sorbent, VE - objto eluentu uyta do wymycia analitów. 80

Wzrost wartoci wspólczynnika mona osign przez zwikszenie objtoci wody przepuszczanej przez sorbent lub przez zmniejszenie objtoci eluentu. Zmniejszenie objtoci eluentu wie si z uyciem mniejszej iloci sorbentu. Uycie eluentu o wikszej sile wymywania te prowadzi do zmniejszenia jego objtoci, ale moe si wiza z wymyciem interferentów. W warunkach optymalnych warto odzysku moe wynosi ok. 90%, przy wspólczynniku wzbogacenia 1000 dla próbek o objtoci 0,5 do 1,0 dm3 wody. tloczek strzykawki

strzykawka lcznik

eluent kolumienka zloe ekstrahujce z naniesion próbk naczynko odbieralnik roztwór analitu podcinienie filtr

a)

b)

Rysunek 20. Budowa pojedynczej kolumienki SPE (a) i zestawu kilku kolumienek (b) Metoda ekstrakcji do fazy stalej znalazla szerokie zastosowanie, zwlaszcza do izolowania substancji organicznych z roztworów wodnych, np. do ekstrakcji WWA z wody stosowane s z powodzeniem niepolarne fazy oktadecylowe (C-18), same lub w polczeniu z grupami polarnymi, np. aminopropylow. Ekstrakcja do fazy stalej obejmuje kilka niezbdnych etapów. Poniej podano sposób przygotowania kolumienki wypelnionej niepolarn faz oktadecylow (C-18). Pierwszy etap to przemycie kolumienki wraz z wypelnieniem rozpuszczalnikami majcymi warto eluotropow wiksz ni stosowane eluenty. Usuwa si w ten sposób substancje (alkeny C16-C24, alkiloftalany, alkany, silanole, siloksany), które mog si wyekstrahowa z gotowych kolumienek, a ilo ich zaley od producenta. Wymywanie zwizków silanolowych wynika z hydrolizy wizania midzy grupami silanolowymi a podstawnikami modyfikujcymi krzemionk, dlatego naley bezwzgldnie unika stosowania eluentów mogcych j powodowa w dalszych etapach ekstrakcji. Objto rozpuszczalników slucych do przemywania kolumienek naley ustali dowiadczalnie, najczciej zaleca si wstpne przemywanie rozpuszczalnikami stosowanymi do elucji w objtoci 5-10 razy wikszej od masy wypelnienia. 81

Nastpnym etapem jest kondycjonowanie (solwatacja) wypelnienia kolumienki (zloa sorbentu), polegajce na przygotowaniu powierzchni sorbentu do efektywnej izolacji i wzbogacania analitów z wody. el krzemionkowy modyfikowany faz oktadecylow ma wlasnoci lipofilowe (fazy RP nie s zwilane wod), dlatego zloe najpierw przemywa si metanolem lub 2-propanolem a nastpnie mieszanin wody i 2-propanolu. Do kondycjonowania stosuje si zwykle 5­10 objtoci pustych uywanej kolumienki (1 objto pusta = 1,0­1,2 µl/mg sorbentu). W trakcie kondycjonowania lacuchy wglowodorowe ulegaj wyprostowaniu oddalajc si od powierzchni sorbentu, tworzc tzw. "szczotk" o znacznie powikszonej powierzchni aktywnej. Wane jest uycie do kondycjonowania rozpuszczalnika o wlaciwociach najbardziej zblionych do wlaciwoci matrycy badanej próbki (wody dejonizowanej dla próbek wodnych) oraz utrzymywanie sorbentu w pelni pokrytego rozpuszczalnikiem do momentu naniesienia próbki (zawsze pierwsz porcj rozpuszczalnika wprowadza si bez uycia podcinienia, pozwalajc jej "wsikn" w zloe). Kolejnym etapem jest naniesienie na kolumienk próbki wody. Jeli próbka zawiera zawiesin, przed naniesieniem naley j odwirowa lub przesczy, aby unikn zatkania filtru wlotowego kolumienki. Badan wod nanosi si z dodatkiem 1-5% metanolu lub 5­15% 2-propanolu. Dodatek alkoholu do wody badanej powoduje, e powierzchnia sorbentu jest aktywna (lacuchy wglowodorowe wyprostowane) podczas wszystkich etapów zagszczania (dynamiczna solwatacja), co umoliwia przepuszczenie przez kolumn wikszej objtoci próbki bez przekroczenia pojemnoci sorpcyjnej zloa (tzw. przebicia) oraz zmniejsza adsorpcj analitów na ciankach kolumienki. Roztwory wodne zawierajce analit przepuszcza si przez kolumienk z szybkoci 1­25 cm3/min przy stosowaniu odpowiedniego podcinienia (pompka wodna) lub nadcinienia (sprony gaz obojtny). Nastpny etap obejmuje usunicie z przestrzeni midzy czstkami sorbentu oraz z wntrza jego porów substancji niezwizanych przez przemycie czystym rozpuszczalnikiem, w którym znajdowal si analit. Mona zastosowa inne rozpuszczalniki, o sile eluotropowej wikszej, jeli nie spowoduj wymycia analitu. W ten sposób usuwa si ewentualne interferenty pochodzce z matrycy, co zwiksza czysto frakcji analizowanej. Resztki rozpuszczalnika przemywajcego usuwa si przez suszenie strumieniem powietrza (zasysanym przez pompk wodn). Czas suszenia zaley od lotnoci rozpuszczalnika i masy sorbentu i wynosi od 1­20 minut. W przypadku rozpuszczalników wysokowrzcych (w tym wody), suszenie przy uyciu podcinienia moe by niewystarczajce i powinno go poprzedzi wirowanie. Odwirowanie rozpuszczalnika naley stosowa, gdy mamy do czynienia z analitami lotnymi lub latwo ulegajcymi utlenieniu. Przy nielotnych analitach mona zastosowa równie liofilizacj. Ostatnim etapem jest wymycie zatrzymanych na kolumience analitów mal porcj (zalena od wielkoci zloa, zwykle 300 -500 µL) odpowiedniego rozpuszczalnika. Na rysunku 21 przedstawiono

zestaw do ekstrakcji do fazy stalej z zastosowaniem podcinienia z pompki wodnej.

82

Zbiornik próbki

Kolumienka SPE (CHROMABOND® C-18)

Warstwa fazy stalej

Lcznik Odbieralnik

Pompka wodna

Rysunek 21. Zestaw do ekstrakcji do fazy stalej Kolumienki SPE charakteryzuj si mal sprawnoci mierzonej iloci pólek teoretycznych, maj za to nastpujce zalety: · · · · · · · · · · · · · szybko ekstrakcji - kilkukrotnie wiksza ni w ukladzie ciecz -ciecz, przy ladowych zanieczyszczeniach, jedna kolumienka moe ekstrahowa nawet 100 L próbki wody, mona je stosowa do analitów lotnych i nielotnych, mona je stosowa do analitów organicznych i nieorganicznych, mona przechowywa analit w warstwie sorbentu do czasu analizy, co pozwala na wykonywanie ekstrakcji w warunkach polowych, powoduj ominicie problemu pienienia si lub emulgowania próbek, maj du odtwarzalno, dziki zmniejszeniu iloci manipulacji z próbk, moliwo automatyzacji procesu, dua selektywno ekstrakcji dziki duemu wyborowi stalych sorbentów, s bardziej ekonomiczne, przez zmniejszenie zuycia szkla, odczynników i nakladu pracy (moliwo wielokrotnego uycia sorbentu, prostota wyposaenia), s zdecydowanie bezpieczniejsze od tradycyjnej ekstrakcji, na skutek mniejszego zuycia latwopalnych rozpuszczalników, daj moliwo izolacji od matrycy i zagszczania rónorodnych grup zwizków chemicznych w czasie jednej ekstrakcji, dziki wysokiemu wspólczynnikowi podzialu i malej objtoci eluatu mona przeprowadzi bezporedni jego analiz bez strat z powodu zagszczania, co jest bardzo wan zalet tej metody, zwlaszcza w analizach ladów, moliwo zagszczania w warunkach polowych: moliwo ekstrakcji prób o duej objtoci do malych, kilkumililitrowych kolumienek z materialem sorpcyjnym umoliwia transport duej ich iloci i zabezpiecza nietrwale anality przed rozkladem w czasie transportu i oczekiwania na analiz.

·

83

Niestety metoda ta posiada te wady, a do najistotniejszym mona zaliczy: · · · · · tlo pozostawione przez uyty rozpuszczalnik, konieczno regeneracji zloa przed kolejnym uyciem, czasem male wartoci odzysku analitu, spowodowane oddzialywaniami midzy sorbentem a substancj analizowan, zatykanie zloa poprzez zawiesiny obecne w próbce, czasami slaba odtwarzalno spowodowana rónicami midzy kolejnymi partiami sorbentu.

Przewaga zalet nad wadami jest zdecydowana i ekstrakcja do fazy stalej znalazla szerokie zastosowanie do wydzielania analitów bezporednio z próbek gazowych, wodnych jak i z ekstraktów próbek stalych. Ekstrakcja do fazy stalej jest rutynow technik w kadym laboratorium.

4.3.2. Mikroekstrakcja do fazy stalej Rozwój techniki SPE doprowadzil do miniaturyzacji procesu ekstrakcji oraz jego automatyzacji, czego przykladem jest mikroekstrakcja do fazy stalej (por. roz. II.3.2.2). 4.3.3. Ekstrakcja za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego Jedn z wersji ekstrakcji do fazy stalej jest mikroekstrakcja do warstwy sorbentu, pokrywajcego staly element szklany lub kwarcowy. Do takiej nale mikroekstrakcja do fazy stalej oraz ekstrakcja za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego (ang. stir bar sorptive extraction, SBSE). Obie techniki ekstrakcji s zgodne z ide "zielonej chemii analitycznej", gdy powoduj minimalizacj preparatyki próbek: ograniczaj lub eliminuj zuycie rozpuszczalników, zmniejszaj objto próbki wymaganej do analizy oraz minimalizuj straty analitów, poniewa nie wymagaj obróbki ekstraktów, które w caloci mog by wprowadzane do systemu dozowania w chromatografie gazowym czy cieczowym. Metod SBSE wprowadzil Baltussen i wspólpracownicy w 1999 roku i nazwal j ,,twisters". Od tamtej pory metoda ta znajduje coraz szersze zastosowanie w oznaczaniu zanieczyszcze w próbkach rodowiskowych, w ywnoci oraz w próbkach biomedycznych. Tak due zainteresowanie t metod wie si z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu jako fazy sorpcyjnej. Polidimetylosiloksan (PDMS), znany w podzialowej chromatografii gazowej, jako ciekla faza stacjonarna, jest termicznie stabiln ciecz o duej lepkoci, niemieszajc si z matryc próbki (wod), która moe by stosowana w szerokim zakresie temperatur (do 320ºC). Poza tym, PDMS wykazuje interesujce wlaciwoci dyfuzyjne, w ekstrakcji analitu bierze udzial cala objto sorbentu a nie tylko jego powierzchnia. Nieorganiczne sorbenty nie maj duego zastosowania w tej metodzie, poniewa oddzialuj zbyt silnie z wylapywanymi substancjami, co wie si z desorpcj w warunkach mogcych powodowa degradacj analitu (np. wysoka temperatura). Organiczne adsorbenty, jak np. Tenax, czsto powoduj termiczn dekompozycj skladu próbki.

84

Podstawy metody W miar uplywu czasu ekstrakcji, nastpuj zmiany stenia analitu w fazie sorpcyjnej PDMS. Jest to zaleno wykladnicza, któr przedstawia równanie: c PDMS (t ) = cW , 0 gdzie: k1 (1 - e - k2t ) k2 (44)

k1 i k2 - stale sorpcji i desorpcji analitu w fazie PDMS, - pocztkowe stenie analitu w wodzie, - stenie analitu w fazie PDMS w czasie t. Próbka i sorbent s cieczami, wic mechanizm ekstrakcji polega na podziale analitu midzy dwie fazy. W zwizku z tym wydajno ekstrakcji zaley w glównej mierze od wartoci stalej podzialu analitu midzy dwie fazy: PDMS i wod (próbk) . Stala podzialu podzialu jest ilorazem ste analitu w stanie równowagi w fazie sorpcyjnej(cPDMS) i fazie wodnej (cw):

c PDMS m PDMS VW m = = PDMS cW mW V PDMS mW

K PDMS =

(45)

gdzie: - stosunek objtoci fazy wodnej do fazy ekstrahujcej - masa analitu w fazie ekstrahujcej, - masa analitu w fazie wodnej. Po osigniciu stanu równowagi, bilans mas mona zapisa: ,

mW , 0 = m PDMS + mW

gdzie: - pocztkowa masa analitu w fazie wodnej. Lczc obydwa równania mona wyliczy teoretyczny odzysk izolowanego analitu R:

R= m PDMS m PDMS K PDMS / w K /w = = PDMS mW m PDMS ( K PDMS + ) K PDMS +

(8)

(47)

Ze wzoru wynika, e odzysk analitu (tym samym wydajno ekstrakcji) jest tym wyszy im mniejszy jest stosunek objtoci faz wodnej do ekstrahujcej (). Aby oceni, czy dla danego analitu technik SBSE z wykorzystaniem fazy PDMS osignie si wystarczajc wydajno, mona posluy si stal podzialu oktanol ­woda KOW, zwan te wspólczynnikiem podzialu P (por. roz. I.2.4). Jeli do wzoru na odzysk analitu w czasie ekstrakcji wprowadzi si warto stalej podzialu oktanol­ woda, KOW dla badanej substancji, uzyska si przyblion warto jej odzysku w czasie ekstrakcji do fazy polidimetylosiloksanowej.

85

Stala podzialu oktanol ­ woda jest niezawodnym sposobem przewidywania zachowania si analitu w ukladzie faz polarnej i niepolarnej. W literaturze chemicznej mona znale wartoci stalej KOW dla wielu substancji.

Stala podzialu oktanol­woda jest niezawodnym sposobem przewidywania zachowania si analitu w ukladzie faz polarnej i niepolarnej. W literaturze chemicznej mona znale wartoci wspólczynnika dla wielu substancji. Przyjmuje si, e zwizki, których log KOW jest mniejszy od jednoci, charakteryzowane s jako hydrofilowe, wic nie bd si rozpuszczaly w niepolarnej fazie PDMS. Zwizki, dla których log KOW mieci si midzy wartoci 1 a 3, charakteryzuj si rednim charakterem hydrofilowym (lub rednim charakterem hydrofobowym) i mog w ograniczonym stopniu rozpuszcza si w fazie PDMS. Natomiast zwizki, których log KOW osiga warto powyej 3, charakteryzowane s, jako hydrofobowe i bd dobrze rozpuszczaly si w niepolarnej fazie PDMS. Ekstrakcja SBSE sklada si z kilku etapów:

· · ·

Ekstrakcja (zestaw do ekstrakcji za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego przedstawiono na rysunku 22). Usuwanie resztek matrycy (soli, cukrów, bialek i innych skladników próbki) przez przemycie wod i delikatne osuszenie. Izolacja analitu z sorbentu poprzez desorpcj rozpuszczalnikiem lub termiczn.

Ekstrakcj wykonuje si mieszadelkiem magnetycznym pokrytym warstw sorbentu. Jest to prt magnetyczny umieszczony w szklanej oslonie, któr pokrywa sorbent. Komercyjnie, dostpne s mieszadelka o dlugoci 1 cm, pokryte warstw polidimetylosiloksanu, o gruboci 0,5 mm. Calkowita objto sorbentu wynosi 24 µL. SBSE wykonuje si w naczynkach HS o pojemnoi 30 mL, przy objtoci próbek wodnych do 20 mL. Podczas ekstrakcji, mieszadelko jest zanurzone w roztworze próbki lub umieszczone w gazowej fazie nadpowierzchniowej. Mieszadelka pokryte PDMS mona stosowa wielokrotnie, nawet wicej ni 50 razy (oczywicie, po analizie, naley je rekondycjonowa). Ustalenie warunków ekstrakcji polega na:

· · · · · · ·

doborze odpowiedniego czasu ekstrakcji, doborze intensywnoci mieszania, doborze odpowiedniej temperatury, doborze odpowiedniego pH roztworu próbki, doborze iloci dodawanej soli obojtnej do próbki, wyborze modyfikatora organicznego i jego iloci, doborze objtoci próbki i objtoci fazy ekstrahujcej.

86

Technika ekstrakcji za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego naley do metod równowagowych. Czas osignicia równowagi (czas ekstrakcji) zaley od kinetyki procesu i przecitnie wynosi 30­150 min. Zwikszenie kinetyki ekstrakcji mona uzyska przez mieszanie i podwyszenie temperatury. Rozpito stosowanego czasu ekstrakcji w SBSE jest dua, od minut do doby. W trakcje mieszania zmniejsza si grubo warstwy granicznej miedzy mieszadelkiem a zawartoci roztworu, co przyspiesza wymian mas. Ale bardzo szybkie mieszanie powoduje czstszy kontakt mieszadelka ze ciank naczynka i moe by przyczyn uszkodze fizycznych fazy ekstrahujcej, równie generowanie bbli przy wysokich obrotach nie wplywa dobrze na wydajno. Najczciej wspólczynnik ekstrakcji wzrasta ze wzrostem obrotów do 500-750 na min, potem wzrasta niewiele lub wcale.

Naczynko HS Próbka Prt magnetyczny (mieszadelko) pokryte warstw sorbentu

Mieszadlo magnetyczne

Rysunek 22. Zestaw do ekstrakcji za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego, SBSE Podwyszenie temperatury przyspiesza osignicie stanu równowagi. Ale wspólczynnik podzialu a tym samym wspólczynnik ekstrakcji staje si mniejszy. Poza tym skraca si czas ycia fazy PDMS, jeli ekstrakcja prowadzona jest w temperaturze wyszej ni 40°C.Wplyw temperatury na wspólczynnik ekstrakcji zaley od wlaciwoci analitu. Takie parametry jak pH, dodatek soli obojtnej czy dodatek modyfikatora organicznego, wplywaj na wlaciwoci analitów lub próbki i zmieniaj stan równowagi. Dobór wlaciwego pH próbki ekstrahowanej za pomoc niepolarnej fazy PDMS, jest wany dla tych próbek, których wlaciwoci kwasowe lub zasadowe zale od odczynu roztworu. Odpowiedni warto pH ustala si dla uzyskania czciowo lub calkiem niejonowej postaci analitu. Poza tym, zbyt kwane lub zbyt zasadowe warunki nie s zalecane ze wzgldu na moliwo degradacji fazy PDMS, co skraca jej czas ycia. Dodatek soli obojtnej (np. NaCl, KCl) modyfikuje sil jonow roztworu próbki, co wplywa na rozpuszczalno organicznych analitów w matrycy próbki (wodzie). Dla polarnych analitów obserwowany jest wzrost wydajnoci ekstrakcji wraz ze wzrostem dodatku soli obojtnej do roztworu próbki. Dzieje si tak dlatego, e nastpuje hydratacja jonów soli nieorganicznej, przez co woda staje si mniej dostpna dla organicznych zwizków, zostaje utrudniony ruch ich czsteczek i zmniejsza si rozpuszczalno.

87

Dla analitów hydrofobowych (o wartoci log KOW > 3,5), dodatek soli obojtnej nie jest ju tak oczywisty. Dodatek soli nie zawsze poprawia odzysk niepolarnego analitu z wody, czasem nawet zmniejsza. Dla wyjanienia spadku odzysku dla niepolarnych zwizków zaproponowano kilka hipotez:

·

· · ·

zmniejszenie rozpuszczalnoci niepolarnego zwizku powoduje jego zbieranie si na powierzchni próbki (efekt oleju), przez co utrudniony jest jego kontakt z faz sorpcyjn na mieszadelku, wraz ze wzrostem stenia soli zwiksza si lepko roztworu, co zmniejsza kinetyk ekstrakcji, jony soli pokrywaj powierzchniow warstw polimeru PDMS i utrudniaj rozpuszczanie, oddzialywania elektrostatyczne lub oddzialywania par jonowych midzy jonami soli i roztworem, utrudniaj ruch analitu.

Analitycy czsto spotykaj si z przeciwnymi skutkami wysalania w przypadku tych samych substancji, dlatego naley z wielk ostronoci podchodzi do doboru warunków wysalania podczas ekstrakcji.

Dodatek organicznego modyfikatora, jak metanolu czy acetonitrylu zmienia warunki ekstrakcji i stan równowagi. Zmiany zalene s od wlaciwoci chemicznych i iloci dodanego rozpuszczalnika organicznego i od wlaciwoci analitu. Podobnie jak w przypadku dodatku soli, dodatek modyfikatora organicznego moe zwiksza lub zmniejsza wydajno ekstrakcji. Ze wzoru (48) na odzysk R wynika, e wydajno ekstrakcji jest tym wysza im mniejszy jest stosunek faz wodnej do ekstrahujcej, czyli im wiksza objto fazy ekstrahujcej, tym mniejsze i odzysk wikszy. Zaobserwowano, e wplyw stosunku faz na wydajno ekstrakcji jest wyraniejszy dla zwizków bardziej polarnych (o niskich wartociach KOW ni dla niepolarnych (o wyszych wartociach KOW). Z drugiej strony, cho wiksze objtoci próbki nie zwikszaj odzysku (R), to wiksza objto próbki daje wiksz mas analitu wprowadzan do detektora, co zwiksza jego wskazania. Przy standardowej objtoci badanych próbek, wynoszcej 10 mL, stosunek w przypadku SBSE wynosi 400 (10 mL/24µL), za w przypadku stosowania techniki SPME, gdzie objto fazy na wlóknie wynosi 5 µL ­ stosunek faz wynosi 20000 (10 mL/5µL). Jest to bezporedni przyczyn znacznie wyszego odzysku w SBSE w porównaniu do SPME. Odzysk analitów z mieszadelka moe odbywa si poprzez desorpcj termiczn (ang. thermal desorption, TD), wtedy mona stosowa t ekstrakcj w polczeniu z chromatografi gazow. W desorpcji termicznej nie ma rozpuszczalnika. Mieszadelko wprowadza si do termicznego desorbera, polczonego z chromatografem gazowym. Desorpcja moe trwa wicej ni 15 min. Desorber termiczny jest grzany dwuetapowo, do temperatury 150-300°C. W pierwszym etapie nastpuje desorpcja termiczna analitów, po czym nastpuje chlodzenie do temperatury 150-40°C (drugi etap), tzw. krioogniskowanie, pozwalajce zminimalizowa szeroko piku na chromatogramie gazowym. Ograniczeniem termicznej desorpcji jest trwalo analitu. Anality labilne termicznie mog by desorbowane rozpuszczalnikiem (ang. liquid desorption, LD). Desorpcj rozpuszczalnikiem stosuje si równie w polczeniu z chromatografi cieczow lub elektroforez. Mieszadelko zanurzane jest w rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników, które musz by dostosowane do wlaciwoci sorbentu. Zwykle stosowane s acetonitryl, metanol lub ich mieszanina oraz mieszanina z wod lub wodnymi buforami. Minimalna objto rozpuszczalnika stosowanego do desorpcji

88

musi calkowicie pokrywa mieszadelko. Desorpcj rozpuszczalnikiem mona przyspieszy mieszaniem, ogrzewaniem lub ultradwikami. Handlowo dostpne mieszadelka pokryte s niepolarnym polidimetylosiloksanem, co ogranicza zastosowanie ich do ekstrakcji zwizków niepolarnych. Wydajno ekstrakcji do PDMS dla zwizków polarnych jest bardzo mala. Stosuje si wiele modyfikacji sorbentu PDMS, zwikszajcych selektywno i oraz wydajno dla zwizków hydrofilowych. Trwaj badania nad wykorzystaniem polipirolu, pianki poliuretanowej czy alkoholu poliwinylowego. Innym sposobem umoliwiajcym ekstrakcj polarnych zwizków do fazy PDMS jest przeprowadzanie analitów w mniej polarne pochodne. Derywatyzacj mona przeprowadzi bezporednio w naczynku ekstrakcyjnym. Po dodaniu reagenta powstaje niepolarna pochodna analitu, która moe by ekstrahowana przez sorbent polidimetylosiloksanowy. Reagent moe te pokrywa mieszadelko, wtedy pochodna powstaje na jego powierzchni. Niestety, duym ograniczeniem jest niemoliwo przeprowadzenia reakcji zachodzcych w bezwodnych warunkach. W tabeli 11 podano przyklady zastosowania ekstrakcji do sorbentu na ruchomym elemencie SBSE. Tabela 11. Przyklady zastosowa techniki SBSE (na podstawie A. Prieto A., Basauri O., R. Rodil R. Usobiaga A., Fernández L. A., Etxebarria N., Zuloaga O., Stir-bar sorptive extraction: A view on method optimisation, novel applications,limitations and potential solutions, J. of Chromatography A, 1217, 2642­2666, 2010) Analit Matryca, objto Woda rzeczna, 10 mL Osady, 0,5 g Technika ekstrakcji, sorbent SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm SBSE, PDMS, CD 10mm/0,5mm SBSE, MIP 10mm/0,5mm SBSE, PPESK, SBSE,PDMS CDDVB, 20mm/0,5mm SBSE, PDMS, CD 10mm/0,5mm Czas ekstrakcji [min], rodzaj desorpcji 120, TD 60, TD Dodatek, derywatyzacj a Ekstrakt MeOH, ACN, acylowanie NaCl, MeOH NaCl, MeOH 30% NaCl Ekstrakt -

17-Estradiol Chlorofenole

Pestycydy WWA Estrogeny` Fosforoorganiczne pestycydy Zwizki organiczne WWA

Woda, 10 mL Woda, 10 mL Woda, 2 mL Gleba, 10 g Woda, 50 mL Woda, 50 mL

30, LD 30, LD 15, LD 60, LD 20, LD 90, TD

Triclocarban (3,4,4'trichlorocarbanilid)

Woda, 10 mL

120, TD

-

89

Tabela 11 c.d. Analit Matryca, objto Wina, 30 mL Woda, 4 mL Wina, 10 mL Mocz, 1 mL Plyny biologiczne, 1 mL Mleko ludzkie, 5 mL Woda, mocz, 30 mL Osocze, 1 mL Technika ekstrakcji, sorbent SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm SBSE, PU, SBSE, PDMS 10mm/0,5mm SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm SBSE-RAM(alkildiol-silica), SBSE, PDMS 20mm/0,5mm SBSE, PDMS 20mm/1mm SBSE, PDMS, 10mm/0,5mm Czas ekstrakcji [min], rodzaj desorpcji 60, LD 30, LD 60, TD 60 (40°C), TD 40, LD Dodatek, derywatyzacj a EtOH 5% MeOH acylowanie 10% MeOH

Lotne fenole i inne polarne zwizki Herbicydy triazynowe TCA, fenole, 17-Estradiol Kofeina i jej metabolity Lotne skladniki zapachowe Hormony plciowe Antydepresanty

60, TD 120 lub 240, LD 45, LD

NaCl Bufor boranowy

CD - -cyklodekstryna, MIP - Nylon 6 imprintowany czsteczkami fosforoorganicznego pestycydu, Alkil-diol-silica RAM (metoda ograniczonego dostpu do fazy stalej), PPESK (polimer pochodnej ftaloazyny, zawierajcej grup slufonow, eterow i ketonowe), DVB ­ diwinylobenzen, Pu ­ pianka poliuretanowa, TCA ­ kwas trichlorooctowy. Istotnym problemem w ekstrakcji SBSE jest duy wplyw matrycy, ale mimo tego ograniczenia, metoda ta znajduje coraz szersze zastosowanie w analityce próbek rodowiskowych, biologicznych, medycznych, ywnoci oraz pasz zwierzcych i moe by rutynow technik ekstrakcji.

4.3.4. Ekstrakcja z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej Ekstrakcja do fazy stalej moe odbywa si jednoczenie wg dwóch rónych mechanizmów rozdzielania. Tak si dzieje w przypadku stosowania kolumienek z wypelnieniem typu RAM (ang. restricted access material or restricted access media), a metod mona nazwa ekstrakcj z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej. Ograniczenie powoduje zewntrzna, stykajca si z matryc, powierzchnia fazy stacjonarnej, której wlaciwoci fizyczne lub chemiczne uniemoliwiaj sorpcj czsteczek o duych rozmiarach, takich jak: bialka, kwasy nukleinowe czy polimery. Substancje niskoczsteczkowe mog penetrowa male pory sorbentu i ulega ekstrakcji przez podzial do wntrza fazy stacjonarnej, która ma najczciej charakter faz odwróconych (niepolarny). Technika RAM lczy w sobie mechanizm wykluczania z mechanizmem podzialowym.

90

Fazy stale RAM, ze wzgldu na mechanizm wykluczania makromolekul, dzieli si na dwie grupy. W pierwszej grupie wykluczanie odbywa si z powodu fizycznej bariery, jak jest wielko porów powierzchni fazy stalej, a ekstrakcja analitów zachodzi wewntrz porów. Sorbenty w tej grupie mog mie róny charakter, zaleny od wlaciwoci analitu, np. fazy odwrócone, jak krzemionka modyfikowana gliceryn i zwizana z lacuchami wglowodorowymi C4, C8 lub C18, znana pod nazw ADS (ang. alkil-diol-silica) oraz fazy z porowatej krzemionki z rónymi ligandami. W drugiej grupie, wykluczanie odbywa si z powodu chemicznej bariery. Oprócz odpowiedniej wielkoci porów, zewntrzna warstwa sorbentu stanowi pólprzepuszczaln powierzchni - krzemionk pokryt bialkami albo fazy z mieszanymi funkcjami lub oslon hydrofobow. W technice RAM s równie stosowane fazy stale o specyficznych wlaciwociach, np. umoliwiajce rozdzieanie enancjomerów lub separacja oparta na mechanizmie jonowymiennym. Struktura zewntrznej warstwy sorbentu umoliwia desorpcj makromolekul i stosowanie sorbentu wielokrotnie. Wewntrzn warstw sorbentu take najczciej stanowi sorbent o charakterze odwróconych faz, typu ADS, na którym sorpcja zachodzi glównie na skutek oddzialywa Van der Waals'a. Sorbent ten jest stosowany do szerokiego zakresu analitów. Technika z zastosowaniem RAM wykorzystywana jest przede wszystkim w analizach biologicznych, co pozwala wyeliminowa z preparatyki wstpne usuwanie bialek i innych duych polarnych skladników (usuwanych dotd przez strcanie, wirowanie itp.). Technika ta stosowana jest do analizy wielu substancji, w tym leków i ich metabolitów, w plynach fizjologicznych, takich jak: osocze krwi, mocz czy wydzielina z nosa, jak równie do oznaczania substancji w supernatantach przy hodowli kultur komórkowych i in. Technika ekstrakcji z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej ma zastosowanie równie w analizach próbek rodowiskowych, np. do oznaczania herbicydów. 4.3.5. Ekstrakcja przez wykluczanie na sorbentach immunologicznych W sytuacji, gdy analit wystpuje w próbkach w iloci ladowej, a substancje interferujce w duym steniu, zastosowanie nieselektywnego sorbentu do ekstrakcji nie przyniesie oczekiwanych rezultatów. W takim przypadku tej intensywne sygnaly interferentów bd maskowa sygnaly analitów na chromatogramie. Najbardziej selektywnymi sorbentami, stosowanymi do ekstrakcji do fazy stacjonarnej i redukujcymi wplyw matrycy s sorbenty immunologiczne.

Sorbent immunologiczny umoliwia izolacj, oczyszczanie i zagszczanie analitu w jednej operacji. Mechanizm ekstrakcji polega na rozpoznaniu molekuly analitu przez przeciwcialo (na zasadzie oddzialywania antygen-przeciwcialo). Odpowiednie przeciwciala (jednego rodzaju lub róne) unieruchamia si poprzez wizania kowalencyjne z powierzchni nonika, np. krzemionki (rysunek 23). Taki sorbent nazywany jest immunosorbentem (IS) i moe by przewidziany do ekstrakcji pojedynczego analitu, analitu i jego metabolitów oraz klasy strukturalnie podobnych analitów. Szczególnie wydajn, przy zastosowaniu immonosorbentów, jest ekstrakcja analitów z próbek biologicznych i rodowiskowych.

91

Powierzchnia krzemionki Przeciwcialo

Analit Miejsce wice

Rysunek 23. Schemat budowy i dzialania immunosorbentu (IS) W analizach zanieczyszcze rodowiska, immunosorbenty zastosowano do wykrywania np. pochodnych triazyn (herbicydy), wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych (WWA), pochodnych fenylomocznika (herbicydy), benzydyny, barwników azowych, aflatoksyn, ochratoksyn, leków weterynaryjnych, wglowodorów aromatycznych BTEX, kortykosteroidów i in. Immunosorbenty stosowane s w postaci wypelnienia kolumienek SPE lub w postaci wymiennego naboju. Wysokie powinowactwo przeciwciala do analitu zapewnia bardzo wysok selektywno, wic nie ma problemu z substancjami interferujcymi z matrycy. 4.3.6. Ekstrakcji za pomoc polimerów z nadrukiem molekularnym Zasada dzialania polimerów z nadrukiem molekularnym (ang. molecularly imprinted polymers, MIP) jest porównywana z rozpoznawaniem czsteczek przez naturalne biomolekuly (receptory, enzymy, przeciwciala). W tak przygotowanym polimerze znajduj si trójwymiarowe miejsca wychwytu (wnki), odpowiadajce wymiarom i charakterowi chemicznemu czsteczki analitu. Mechanizm ekstrakcji oparty jest na efekcie wykluczania, wynikajcego z rónic w wielkoci i ksztalcie czsteczek oraz charakteru zwizku i wynikajcych z niego sposobów oddzialywa z polimerem (wizania wodorowe, oddzialywania dipol-dipol, tworzenie par jonowych itp.). Na rysunku 24 przedstawiono sposób otrzymywania polimerów z nadrukiem molekularnym. Aby otrzyma polimer zdolny wychwyci czsteczki analitu naley wlaciwie dobra monomer funkcyjny oraz poszczególn substancj (analit) lub substancj, bdc analogiem strukturalnym analitu lub grupy analitów. Monomer funkcyjny jest to substancja zdolna do polimeryzacji, najczciej posiadajca sprzone podwójne wizania oraz posiadajca odpowiednie grupy funkcyjne, dobrane do grup obecnych w czsteczce analitu tak, aby moglo zachodzi wizanie kowalencyjne lub inne oddzialywania midzy monomerem a analitem, np. elektrostatyczne, wodorowe czy hydrofobowe( od ich rodzaju zale techniki modelowania polimeru).

92

Polimeryzacja wlaciwa z odczynnikiem sieciujcym

Usuwanie substancji wzorcowej

Czasteczka analitu (lub substancja wzorcowa)

Monomer funkcyjny

Struktura prepolimeryzacyjna

Wlaciwa struktura polimeru z substancj wzorcow

Polimer po usuniciu substancji wzorcowej

Rysunek 24. Schemat otrzymywanie molekularnie imprintowanych polimerów W wyniku tych oddzialywa substancja wzorcowa i monomer, rozpuszczone w wybranym rozpuszczalniku, tworz trwal struktur, zwan kompleksem prepolimeryzacyjnym. Po dodaniu odczynnika sieciujcego zachodzi wlaciwa polimeryzacja, utrwalajca struktur prepolimeru. Po usuniciu z polimeru substancji wzorcowej, powstaje miejsce zdolne wychwytywa selektywnie czsteczki analitu z mieszaniny wieloskladnikowej. Molekularnie imprintowany polimer jest stabilny chemicznie i fizycznie i mona go stosowa wielokrotnie (rysunku 25).

Molekularnie imprintowany polimer i próbka

Sorpcja z próbki

Desorpcja z polimeru

Rysunek 25. Schemat ekstrakcji za pomoc polimeru z nadrukiem molekularnym Wród czsto stosowanych monomerów funkcyjnych znajduj si: kwas akrylowy, kwas metakrylowy, kwas 4-winylobenzoesowy(monomery kwane), winylopirydyna, winyloimidazol, alliloamina(monomery zasadowe), styren, akrylonitryl, metakrylan metylu, akrylamid(monomery obojtne). Dobór rozpuszczalnika zaley od stosowanych monomerów i substancji oznaczanej, najczciej uywane s toluen, acetonitryl, chloroform czy metanol. Molekularnie imprintowane polimery s stosowane w wielu dziedzinach, ale najszersze zastosowanie znalazly w izolacji i zagszczaniu substancji. Jako faza stacjonarna w technice SPE stosowane s do izolowania substancji czynnych w materiale biologicznym, jak np. antybiotyków czy -blokerów w moczu, krwi, osoczu oraz w tkankach 93

wtroby, nerek czy mini. Wykorzystywane s te w testach immunologicznych oraz do izolowania i oznaczania substancji toksycznych lub szkodliwych w próbkach rodowiskowych: wodzie, glebie, ywnoci i paszach. Handlowo dostpne s polimery z nadrukiem do oznaczania: -blokerów, -receptorów, antybiotyku chloramfenikol, ryboflawiny (wit. B2), herbicydów triazynowych i in. Nowym kierunkiem w ekstrakcji do fazy stalej jest polczenie sorbentów stosowanych w technice RAM z molekularnie imprintowanymi polimerami (RAM-MIP). Schemat takiego rozdzielania, stosowanego do izolacji triazynowych herbicydów pokazano na rysunku 26.

Próbka

Zmiana rozpuszczalnika Rozpuszczalnik organiczny

Przemywanie wod

RAM

Naloenie próbki Rozdzial skladników wg rozmiaru molekul

Przemywanie rozpuszczalnikiem organicznym

Mieszanina wodnoorganiczna

MIP

Analit Niskoczasteczkowe skladniki matrycy Wielkoczsteczkowe skladniki matrycy

Rozpoznanie czsteczek analitu

Wymycie pozostaloci matrycy

Desorpcja analitu

Rysunek 26. Schemat procedury rozdzielania za pomoc polczonych technik RAM-MIP, u góry, po lewej stronie schemat rozdzielania na kolumience RAM, po prawej u dolu schemat procedury na kolumience MIP (na podstawie Guiochon G., A., Beaver L., A., Progress and future of instrument al analytical chemistry applied to the environment, Analytica Chimica Acta, 523,1-14, 2004) 94

Procedura izolacji sklada si z dwóch etapów:

· ·

usuniciu z próbki wielkoczsteczkowych zanieczyszcze, wyizolowanie czystego analitu z wstpnie oczyszczonej próbki.

W pierwszym etapie, po zaladowaniu próbki na kolumienk nastpuje odmycie wod (roztworem wodnym) zanieczyszcze wielkoczsteczkowych, nieprzechodzcych przez male pory wierzchniej warstwy sorbentu. Analit i inne zanieczyszczenia zostaj na wewntrznej warstwie sorbentu. Nastpnie, zmieniajc rozpuszczalnik na organiczny, wymywa si zwizki z sorbentu. Wstpnie oczyszczon próbk nanosi si na kolumienk, w której sorbentem jest polimer imprintowany czsteczkami triazyny. Czsteczki triazynowego herbicydu pozostaj w aktywnych wnkach polimeru, a pozostale skladniki s usuwane wraz z rozpuszczalnikiem. Nastpnie, stosujc mieszanin wodnoorganiczn o okrelonym pH, wymywa si czysty analit. Taka technika jest bardzo selektywna i pozwala unika niekorzystnych oddzialywa w czasie analizy i moe znale szerokie zastosowanie w analityce medycznej. Kolumienki RAM-MIP mog by wykorzystane wielokrotnie, po uprzednim przemyciu i kondycjonowaniu. 4.3.7. Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce Mikroekstrakcja do stalego sorbentu upakowanego w strzykawce (ang. microextraction by packed sorbent lub microextraction in packed syringe, MEPS) jest te nazywana krótk kolumn chromatograficzn w strzykawce. Jest to nowa technika ekstrakcji, cho oparta na starej zasadzie ­ jest miniaturyzacj ekstrakcji do fazy stalej (SPE). Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu moe by polczona bezporednio z chromatografem cieczowym lub gazowym lub jako odrbna metoda izolacji substancji. Najistotniejsz cech tej techniki jest to, e zloe sorbentu jest integraln czci strzykawki a nie osobn kolumn. Wszystkie czynnoci, jak przemywanie, kondycjonowanie zloa, sorpcja i desorpcja wykonywane s w tym samym miejscu - w strzykawce, któr równie wprowadza si próbk do dozownika chromatografu. W mikroekstrakcji do fazy stalej w strzykawce stosuje si te same sorbenty, co w SPE, wic standardowe fazy RPC-18, RPC-8 i inne produkowane na bazie krzemionki oraz polimery, jak polidiwinylobenzen czy molekularnie drukowane polimery a take wymieniacze jonowe i przeciwciala. Minikolumn w strzykawce przygotowuje si w ten sposób, e do mikrostrzykawki o pojemnoci 100 ­ 250 µL wsypuje si midzy dwa filtry polietylenowe sorbent staly w iloci 1-4 mg, co daje mikrolitrowe objtoci kolumienki. Do wymycia analitu z tak malej iloci zloa wystarcz mikrolitowe objtoci rozpuszczalnika, stosowne do dozowania do chromatografu. Strzykawka MEPS moe by uywana do ekstrakcji wiele razy, nawet powyej stu. Mikroekstrakcja do fazy stalej w strzykawce obejmuje podobne etapy jak w metodzie SPE. Po kondycjonowaniu kolumienki ekstrakcj przeprowadza si nastpujco: 10÷1000 µL cieklej próbki przepuszcza si w strzykawce przez sorbent, nacigajc i wypuszczajc plyn wielokrotnie, a wymagana ilo analitu zostanie zatrzymana na fazie stalej. Nastpnie faz stal naley przepluka mal objtoci rozpuszczalnika próbki (wody), aby usun niesorbujce si na fazie stacjonarnej substancje. Zloe wysuszy, po czym mal objtoci rozpuszczalnika organicznego lub fazy ruchomej eluowa anality bezporednio do dozownika HPLC lub GC. Schemat 95

postpowania przy wykonywaniu mikroekstrakcji w strzykawce przedstawiono na rysunku 27a. Proces mikroekstrakcji moe by zautomatyzowany, poszczególne etapy ekstrakcji mog odbywa si w automatycznym podajniku próbek (autosamplerze). Strzykawka z sorbentem moe by wykorzystywana wielokrotnie, do rónych analiz, pod warunkiem, e sposób regeneracji bdzie dopracowany dla kadego zastosowania odrbnie. Zloe sorbentu moe by upakowane w korpusie strzykawki lub jako wkladka (nabój) midzy korpusem strzykawki a igl oraz oba warianty jednoczenie (rysunku 27b). Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce moe by stosowana do ekstrakcji szerokiego zakresu analitów. Polczenie techniki MEPS z wysokosprawn chromatografi cieczow i spektrometri mas jest narzdziem do oznaczania w plynach ustrojowych (osocze, krew, mocz) leków i ich metabolitów, takich jak: rodki znieczulajce, -blokery, leki przeciwrakowe, antydepresanty oraz zwizków toksycznych - narkotyków i ich metabolitów, amfetaminy we wlosach, monoterpenowych metabolitów w moczu i in. Technik t zastosowano równie do ekstrakcji wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych w wodzie, ochratoksyny A (mikotoksyna kancerogenna) w winie, trichloroanizolu (substancja o stchlym, mulistym zapachu) w winie.

Ruchy tloczka strzykawki: wielokrotne - , pojedyncze -

Warstwa sorbentu stalego

Próbka

Ciecz do przemywania

Eluent

Dozownik

a)

b

Rysunek 27. Schemat postpowania przy wykonywaniu mikroekstrakcji do upakowanego sorbentu (MEPS)

96

Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce MEPS jest obiecujc metod izolacji i zagszczania substancji z wielu powodów:

· · · · ·

jest prosta w uyciu, moe by calkowicie zautomatyzowana, jest szybka, redukuje iloci rozpuszczalnika i próbki, jest zdecydowanie tasza od ekstrakcji do fazy stacjonarnej, SPE.

Strzykawki z upakowanym sorbentem s dostpne komercyjnie.

5. Ekstrakcja próbek stalych

Ekstrakcja w ukladzie cialo stale ­ ciecz (ang. solid liquid extraction, SLE) jest podstawow metod wyodrbniania z ciala stalego substancji rozpuszczalnych w wodzie lub rozpuszczalnikach organicznych. Ekstrakcj ciecz stosuje si do wydzielania substancji z materialu rolinnego (substancji tluszczowych z rolin oleistych, substancji aktywnych biologicznie z ziól, owoców, korzeni, substancji zapachowych i smakowych z rolin), z materialu pochodzenia zwierzcego (tluszcze, witaminy) oraz z gleby, osadów i zawiesin. Ekstrakcja w ukladzie cialo stale ­ ciecz jest te czsto stosowana do desorpcji analitu z sorbentu stalego. Na wydajno i kinetyk ekstrakcji wplywaj trzy, cile ze sob zwizane, czynniki: rozpuszczalno, przenoszenie masy i wplyw matrycy. Ekstrahowana substancja musi by dobrze rozpuszczalna w stosowanym ekstrahencie. Rozpuszczalno analitu zaley od rodzaju rozpuszczalnika, a dla wybranego rozpuszczalnika, od temperatury i cinienia. Aby zaistniala ekstrakcja w ukladzie dwufazowym cialo stale ­ ciecz konieczna jest desorpcja analitu z powierzchni matrycy i rozpuszczenie go w rozpuszczalniku. W tym celu musi nastpi transport rozpuszczalnika do wntrza matrycy (miejsc adsorpcji), a nastpnie przeniesienie roztworu z miejsc desorpcji. Transport masy (rozpuszczalnika i analitu) zaley od wspólczynników dyfuzji i struktury matrycy. Wspólczynniki dyfuzji zmieniaj si ze zmian warunków ekstrakcji. Podwyszona temperatura, niska lepko rozpuszczalnika, rozdrobnienie matrycy oraz mieszanie w czasie ekstrakcji przyspieszaj przenoszenie masy. Matryca moe znacznie wplywa na wydajno ekstrakcji, zwlaszcza, jeli silnie oddzialuje z analitem. W takim przypadku nawet bardzo dobrze rozpuszczalny analit jest niedostpny, bo silnie zwizany z matryc zalega w jej porach. Próbki stale wymagaj wstpnego przygotowania przed ekstrakcj. Bardzo czsto próbki zawieraj wod, któr trzeba usun, by ulatwi penetracj rozpuszczalnika organicznego. Woda zawarta w matrycy ogranicza dostp do zaadsorbowanego analitu, zmniejsza jego rozpuszczalno w 97

rozpuszczalniku organicznym i sprawia due problemy przy izolacji z ekstraktu. Sposób usuwania wody zaley od rodzaju matrycy i lotnoci oraz trwaloci analitu (nietrwalo w obecnoci tlenu czy promieniowania UV). Zwykle próbki suszy si w temperaturze pokojowej do tzw. powietrznie suchych, lub w suszarce, w temperaturze 40°C. Próbki z nielotnymi analitami mona liofilizowa, dla usunicia wody. Wysuszone próbki naley rozdrobni. W zalenoci od rodzaju próbki rozdrabnianie wykonuje si przez kruszenie w specjalnych urzdzeniach, mielenie w mlynach lub rozcieranie w modzierzach. Niestety, w ten sposób nie mona postpowa z próbkami zawierajcymi lotne anality lub/i zagraajce zdrowiu. W takim przypadku zaleca si osuszanie próbki przez roztarcie z bezwodnym siarczanem sodu lub ziemi okrzemkow (diatomitem). Wybór techniki ekstrakcji zaley przede wszystkim od stanu skupienia matrycy, wlaciwoci i stenia analitu oraz wlaciwoci i stenia substancji przeszkadzajcych. Technik ekstrakcji naley dostosowa do celu, czasu analizy, sposobu przygotowania próbki do ekstrakcji oraz czuloci i selektywnoci metody kocowego oznaczania, jeli takie jest stosowane. Wybór rozpuszczalnika podyktowany jest wlaciwociami analitów, matrycy oraz substancji przeszkadzajcych. W zalenoci od celu ekstrakcji, rozpuszczalnik powinien dobrze izolowa róne klasy zwizków lub selektywnie okrelony zwizek. Niezalenie od celu ekstrakcji, rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników powinna by tak dobrana, by w najmniejszym stopniu wspólekstrahowala substancje przeszkadzajce.

5.1. Ekstrakcja próbek stalych faz gazow Oznaczanie lotnych substancji, rozpuszczonych lub zaadsorbowanych w kompleksie matrycy stalej (np. glebie, ywnoci, farmaceutykach czy polimerach) metodami tradycyjnymi moe by malo powtarzalne i niedokladne. Metody tradycyjne wymagaj wstpnego przygotowania próbki, jak suszenie czy rozdrabnianie. S to czynnoci, które powoduj due straty ilociowe zwizków lotnych. Zatanie ekstraktów to kolejny etap strat analitów. Jednym ze sposobów dokladnego oznaczania lotnych zwizków organicznych (ang. volatile organic compounds, VOCs) jest ekstrakcja do fazy gazowej. Ekstrakcj prowadzi si w ukladzie zamknitym, próbka moe by ekstrahowana w stanie natywnym. Poza tym, ekstrakt gazowy moe by bezporednio badany najlepsz, do oznaczania analitów lotnych, technik chromatografii gazowej. 5.1.1 Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej Ekstrakcj do fazy gazowej mona przeprowadza w ukladzie statycznym (ekstrakcja równowagowa, SHS) lub dynamicznym (PT), w którym nie musi by osignity stan równowagi termodynamicznej. Aby ulatwi desorpcj analitów z fazy stalej i rozpuszczenie w fazie gazowej, czsto dodaje si do próbki niewielk ilo wody lub innego rozpuszczalnika. Sposoby i zasady ekstrakcji do fazy gazowej przedstawione s w rozdziale: 4.1.1. Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej.

98

5.1.2. Ekstrakcja dynamiczna technik wymywania i wychwytywania Sposoby i zasady ekstrakcji do fazy gazowej technik wymywania i wychwytywania przedstawione s w rozdziale: 4.1.2. Ekstrakcja strumieniem gazu przeplywajcym przez próbk. 5.1.3. Ekstrakcja strumieniem gazu z desorpcj termiczn W metodzie desorpcji termicznej i ekstrakcji strumieniem gazu czynnikiem ekstrahujcym jest temperatura. Pod wplywem ogrzewania substancje desorbuj si z matrycy stalej i s przenoszone strumieniem gazu do pulapki analitów lub bezporednio do analizatora, np. chromatografu gazowego. Ten sposób ekstrakcji jest przede wszystkim stosowany do desorpcji analitów z adsorbentów stalych lub filtrów, które byly uyte do izolacji substancji z matryc gazowych czy cieklych i stosowany zarówno w laboratoriach analitycznych jak i przemyle. W przemyle, do desorpcji zwizków organicznych z sorbentu stalego, np. do desorpcji rozpuszczalników z wgla aktywnego, najczciej stosuje si przegrzan par wodn. Para wodna spelnia tu podwójn rol: dostarcza ciepla do desorpcji termicznej i wypiera czsteczki rozpuszczalnika, adsorbujc si na wglu aktywnym. Desorpcj termiczna przeprowadza si równie gorcym gazem obojtnym. Przez zloe przepuszcza si podgrzany gaz, który je ogrzewa, umoliwiajc termiczn desorpcj zaadsorbowanych zwizków, przenoszonych nastpnie strumieniem gazu. Proces taki mona prowadzi w otwartym ukladzie przeplywu gazu obojtnego (gaz nie jest zawracany do desorpcji) i zamknietym (kolowym), z zawracaniem do ekstrakcji. Inny sposobem jest ekstrakcja gazem obojtnym zloa podgrzanego do temperatury desorpcji. Taki sposób jest stosowany w analityce, w urzdzeniach zwanych desorberami termicznymi. Stosujc odpowiedni temperatur desorpcji, mona ekstrahowa anality lotne (VOCs) oraz wysokowrzce, jak WWA czy PCB. Desorbery termiczne skladaj si z komory, ogrzewanej i termostatowanej elektrycznie, do której wklada si pojemnik(rurk) z sorbentem stalym, zaworu wielodronego i sterownika elektronicznego. Najprostszy sposób desorpcji polega na polczeniu desorbera termicznego z chromatografem gazowym i bezporednim wprowadzeniu desorbowanych analitów wraz ze strumieniem gazu nonego na kolumn chromatograficzn. Ten sposób stosowany jest do zwizków, których temperatura wrzenia nie przekracza 200°C. Bardziej skomplikowanym sposobem, z zastosowaniem midzyoperacyjnego wzbogacania analitów, jest: · desorpcja termiczna a nastpnie wymraanie uwolnionych analitów pustej kapilarze, dla ich zagszczenia, · desorpcja termiczna analitów a nastpnie adsorpcja ich na innym sorbencie, z którego desorpcja wprost do kolumny chromatograficznej jest latwiejsza. Zagszczenie desorbowanych termicznie analitów mona uzyska przez ich bezporednie wprowadzenie na czolo kolumny chromatograficznej, które jest utrzymywane w temperaturze pokojowej lub chlodzone za pomoc par cieklego azotu lub ditlenku wgla. Rozdzielanie chromatograficzne prowadzone jest nastpnie w programowanej temperaturze kolumny. Termiczna desorpcja nie wymaga skomplikowanej procedury ekstrakcji, odzwierciedla rzeczywisty sklad próbki, nawet lotnych skladników i nie wymaga duych iloci próby. 99

Du zalet desorpcji termicznej w polczeniu z chromatografi gazow jest brak duego sygnalu rozpuszczalnika, który moe maskowa obecno innych zwizków. Termiczna desorpcja w polczeniu z chromatografi gazow jest stosowana do analizy lotnych zwizków organicznych (VOCs) w powietrzu atmosferycznym i w pomieszczeniach zamknitych. Stosowana jest równie, jako technika izolacji rónych zanieczyszcze, zaadsorbowanych w pylach, jak pestycydy, wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne i wiele innych substancji. 5.2. Ekstrakcja w ukladzie cialo stale ­ ciecz Stosowane obecnie techniki ekstrakcji próbek stalych ciecz mona podzieli na:

· · ·

techniki tzw. klasyczne, techniki klasyczne wspomagane, wspólczesne techniki ekstrakcji, z zastosowaniem niekonwencjonalnych rozpuszczalników oraz warunków procesu.

Klasyczne techniki ekstrakcji, cho cigle stosowane, skutecznie wypierane s przez modyfikowane sposoby izolacji substancji. Stosowanie fizycznych metod wspomagania ekstrakcji, takich jak: zwikszanie cinienia ekstrahenta, stosowanie promieniowania mikrofalowego lub fal ultradwikowych, zdecydowanie zwiksza wydajno ekstrakcji, co z kolei zmniejsza zuycie lotnych i szkodliwych rozpuszczalników oraz energii. 5.2.1. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie Najprostsz technik klasyczn, cho niewygodn, jest cigle stosowana ekstrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie. Jest ona dlugotrwala, wymagajca pracy i duej iloci ekstrahenta. Próbk po wysuszeniu i rozdrobnieniu umieszcza si w naczyniu, zalewa rozpuszczalnikiem i wytrzsa. Próbk ekstrahuje si wielokrotnie, za kadym razem wie porcj rozpuszczalnika. Uzyskane porcje ekstraktu lczy si, sczy dla oddzielenia czstek stalych próbki i odparowuje rozpuszczalnik. 5.2.2. Ekstrakcja przez homogenizacj próbki z rozpuszczalnikiem Do próbek rolinnych i biologicznych czsto stosuje si homogenizacj próbki z rozpuszczalnikiem. Próbk zalewa si odpowiednim rozpuszczalnikiem i rozdrabnia przez miksowanie lub ucieranie. Ekstrakcja zachodzi jednoczenie z rozdrabnianiem. Uzyskany ekstrakt jest nastpnie oddzielany od nierozpuszczalnej pozostaloci przez sczenie lub czciej, zwlaszcza w przypadku próbek biologicznych, poprzez wirowanie. Pozostaly osad mona zawróci do nastpnej ekstrakcji. Powtarzanie homogenizacji kilkoma porcjami wieego rozpuszczalnika daje wiksz wydajno ekstrakcji. W niektórych przypadkach istnieje potrzeba podgrzania rozdrobnionej w rozpuszczalniku próbki, wtedy naley j przenie do kolby i ogrzewa pod chlodnica zwrotn. Taka metoda nazywa si digesti i stosowana jest bardzo czsto w analityce farmaceutycznej. 5.2.3. Ekstrakcja przez zmydlanie (saponifikacja) Sposób zwizania analitu z matryc próbki stalej zaley od budowy jego czsteczki. Np. wglowodory czy sterole zwizane s z hydrofobowymi regionami czsteczek bialkowych czy tluszczowo100

bialkowych wizaniami hydrofobowymi lub Van der Waalsa. W takim przypadku do ich ekstrakcji mona uy rozpuszczalnika niepolarnego, jak eter di etylowy, heksan czy chloroform. Anality zwizane wizaniami wodorowymi czy elektrostatycznymi musz by ekstrahowane rozpuszczalnikami polarnymi, jak metanol czy etanol, aby nastpilo rozerwanie wiza wodorowych i dezaktywacja miejsc przycigania elektrostatycznego. Jeli analit jest zwizany z matryc wizaniami kowalencyjnymi, np. kwasy tluszczowe zwizane estrowo, amidowo czy glikozydowo z bialkami czy polisacharydami, mona go ekstrahowa dopiero po hydrolizie tych wiza. Wykonuje si zazwyczaj hydroliz alkaliczn, stosujc alkoholowy roztwór wodorotlenku sodu lub potasu. Reakcj t nazwano zmydlaniem, bo jej produktem s mydla - sole sodowe czy potasowe kwasów tluszczowych. Po zmydleniu do próbki dodaje si wod, roztwór zobojtnia i wolne kwasy mona ekstrahuje niepolarnym rozpuszczalnikiem. Reakcje zmydlania przeprowadza si bardzo czsto, w przypadku próbek pochodzenia rolinnego czy zwierzcego, np. przy oznaczaniu steroli w komórkach rolinnych. Sterole wystpuj w formie wolnej lub zwizane estrowo lub glikozydowo. Zwizki steroli mona wyekstrahowa odpowiednim rozpuszczalnikiem, a nastpnie przeprowadzi reakcj zmydlania i izolowa wolne sterole niepolarnym rozpuszczalnikiem. Reakcj zmydlania przeprowadza si równie ze wzgldu na charakter matrycy. Gdy analit niepolarny znajduje si w równie niepolarnej matrycy, np. witaminy A, D, E (rozpuszczalne w tluszczach) zawarte w oleju. Przeprowadzajc zmydlanie zmienia si charakter matrycy (np. oleju) na polarny, wtedy niepolarne skladniki mona ekstrahowa niepolarnym rozpuszczalnikiem.

Podobnie mona oznaczy benzo(a)piren (rakotwórczy wielopiercieniowy wglowodór aromatyczny) w oleju. Zmydlenie oleju powoduje, e próbka zmienia charakter na polarny, z którego latwo wyekstrahowa wglowodór niepolarnym rozpuszczalnikiem. Reakcj zmydlania przeprowadza si na gorco, pod chlodnic zwrotn, a ekstrakcj - jedn z technik w ukladzie ciecz ­ ciecz. Ekstrakcj polczon ze zmydlaniem, bardzo czsto stosuje si przy ekstrakcji materialu rolinnego i zwierzcego. 5.2.4. Ekstrakcja za pomoc strumienia rozpuszczalnika Ekstrakcja za pomoc strumienia rozpuszczalnika polega na ciglym przeplywie rozpuszczalnika przez próbk. Próbka jest umieszczona w kolumnie, przez któr jest pompowany rozpuszczalnik. Zalet tego procesu jest to, e próbka, bdca w nieprzerwanym kontakcie z rozpuszczalnikiem, styka si cigle ze wie jego porcj. Proces ten mona prowadzi w podwyszonej temperaturze, ale nieprzekraczajcej temperatury wrzenia zastosowanego rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik z ekstraktem jest odprowadzany do destylacji, po czym jako czysty zawracany jest do procesu. Ekstrakcj za pomoc strumienia rozpuszczalnika nazywa si perkolacj i czsto stosuje w przemyle tluszczowym.

101

5.2.5. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypelniaczem Wyodrbnianie za pomoc strumienia rozpuszczalnika wraz z jednoczesnym wstpnym rozdzielaniem mieszaniny mona uzyska, stosujc ekstrakcj za pomoc rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypelniaczem (ang. matrix solid-phase dispersion, - MSPD). Ekstrakcja polega na wymywaniu substancji z próbki stalej zmieszanej z sorbentem. Charakter sorbentu dobierany jest do natury matrycy i wlaciwoci substancji izolowanej oraz interferentów i moe sluy do zatrzymywania jednych lub drugich. Stosowane s sorbenty polarne, np. el krzemionkowy, Florisil, tlenek glinu lub niepolarne ­ np. krzemionka zwizana z lacuchami wglowodorowymi C-8 lub C18. Ucieranie próbki z du iloci sorbentu mechanicznie niszczy struktur tkanki rolinnej czy zwierzcej, powoduje rozproszenie i sorpcj próbki na powierzchni sorbentu poprzez hydrofobowe i hydrofilowe oddzialywania. Wynikiem tego jest jakby nowa struktura sorbentu, bdcego jednorodn mieszank próbki i wypelniacza, wolnej od plynów i prawie suchej. Podczas przeplywu rozpuszczalnika przez t mieszanin, nastpuje ekstrakcja i podzial ekstraktu miedzy faz ciekl rozpuszczalnik a faz stal ­ sorbent. Wykonanie ekstrakcji technik MSPD przedstawiono na rysunku 28.

a)

b)

c)

d)

e)

Rysunek 28. Schemat ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypelniaczem (MSPD) Etapem pierwszym jest rozdrobnienie i dokladne wymieszanie próbki stalej z sorbentem (rysunek 28a). Masa próbki zaley od stenia analitu i czuloci metody stosowanej w kolejnym etapie analizy, najczciej wynosi od 0,5 do 1,0 g. Próbk miesza si z sorbentem zwykle w proporcji 1 do 4. Stosunek masy próbki do masy sorbentu zaley od natury matrycy, w przypadku próbek zawierajcych duo wody (owoce, warzywa) masa sorbentu moe by wiksza ni czterokrotna 102

masa próbki. Mieszanin próbki i sorbentu umieszcza si w kolumience (rysunek 28b). Na wierzch zloa naklada si filtr z bibuly i zawarto kolumienki delikatnie ugniata tloczkiem od strzykawki lub bagietk (rysunek 28c). Nastpnym etapem jest wymycie substancji przeszkadzajcych (rysunek 28d) odpowiednim rozpuszczalnikiem: np. wod, buforem, mieszanin wody z metanolem lub acetonitrylem lub rozpuszczalnikiem niepolarnym. Rozpuszczalniki niepolarne, np. heksan, stosuje si w celu odmycia tluszczów, utrudniajcych penetracj eluentu. Na kade 100 mg mieszaniny próbki z sorbentem zuywa si 1-2 mL rozpuszczalnika. Usuwanie interferentów powinno trwa nie dluej, jak 1-2 min, aby nie doprowadzi do wymycia substancji oznaczanej. Przed elucj analitów zloe w kolumience naley wysuszy, szczególnie, gdy eluentem ma by rozpuszczalnik niepolarny. Zloe suszy si pod próni, w strumieniu azotu lub przez odwirowanie. Ostatnim etapem jest izolowanie analitu (rysunek 29e) rozpuszczalnikiem, w iloci minimum 250 µL/100 mg zloa. Dla powtarzalnoci oznacze naley równie zachowa stal szybko elucji i prowadzi j dwuetapowo, stosujc kilkuminutowe nasikanie. MSPD to ekstrakcja na mikroskal, która zostala zastosowana po raz pierwszy 1989 r. Jest to technika stosowana do oznaczania organicznych analitów, jak: leki, steroidy i inne pozostaloci farmaceutyków, pestycydy, polichlorowane bifenyle (PCB) w próbkach stalych lub semi-stalych. Szczególnie jest przydatna w oznaczaniu substancji w próbkach zawierajcych duo wody: warzywach, owocach oraz w matrycach biologicznych: tkance miniowej, wtrobie czy tluszczu. Wad tej metody s male odzyski analitów. 5.2.6. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta Klasyczn ekstrakcj cigl próbek stalych jest ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta. Jest to jedna z najstarszych metod, zastosowana po raz pierwszy w 1879 roku przez Franza Rittera von Soxhleta, niemieckiego chemika. Pocztkowo aparat Soxhleta byl stosowany do ekstrakcji tluszczy z próbek stalych. Potem okazalo si, e jest to uniwersalna metoda izolacji substancji redniolotnych i nielotnych oraz trwalych termicznie z wielu matryc stalych, jak gleby, osadów, pylów, sorbentów stalych z zaadsorbowanymi zwizkami z matryc cieklych i gazowych, ywnoci, pasz, materialu rolinnego i zwierzcego, próbek biologicznych, farmaceutyków i in. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest polczeniem ekstrakcji i destylacji. Oba procesy odbywaj si w obiegu zamknitym, w wyniku których próbka jest ekstrahowana wielokrotnie, za kadym razem wie porcj rozpuszczalnika. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest zdecydowanie bardziej ekonomiczna ni klasyczna ekstrakcja przez wytrzsanie, bo zmniejsza zuycie rozpuszczalnika. Schemat budowy aparatu Soxhleta przedstawiono na rysunku 29. Glówn cz zestawu stanowi aparat Soxhleta, czyli pojemnik szklany na próbk, zaopatrzony w rurk przelewow (syfon) i rurk boczn, umoliwiajc przeplyw par rozpuszczalnika do chlodnicy. W pojemniku umieszcza si gilz z twardej bibuly filtracyjnej lub wykonan z innego, porowatego materialu, zawierajc ekstrahowan próbk. Aparat Soxhleta lczy si od dolu z kolb okrglodenn, zawierajc ekstrahujcy rozpuszczalnik, a od góry z chlodnic zwrotn. Polczenia aparatu z chlodnic i kolb s szlifowe i musz by szczelne. Kolb z rozpuszczalnikiem ogrzewa si, utrzymujc lagodny stan wrzenia. Pary rozpuszczalnika przechodz rurk boczn do chlodnicy, gdzie ulegaj schlodzeniu i skropleniu. Kondensat z chlodnicy wplywa do 103

gilzy z próbk i pojemnika szklanego, powoli je wypelniajc. Gdy poziom rozpuszczalnika w pojemniku osignie wysoko rurki bocznej, ekstrakt przelewa si do kolby.

Chlodnica

Gilza porowata z próbk

Aparat Soxhleta

Przelew

Rurka boczna

Rozpuszczalnik i ekstrakt

Rysunek 29. Schemat budowy zestawu do ekstrakcji za pomoc aparatu Soxhleta Proces ten powtarza si automatycznie tak dlugo, jak dlugo ogrzewana jest kolba z rozpuszczalnikiem. Z kolby odparowuje tylko rozpuszczalnik i w czasie procesu stenie ekstraktu w kolbie wzrasta. Kolb naley ogrzewa lagodnie, by nie przegrza ekstraktu.

Dobór warunków ekstrakcji w aparacie Soxhleta polega przede wszystkim na wyborze rozpuszczalnika i okreleniu czasu ekstrakcji. Przy wyborze rozpuszczalnika obowizuje zasada, e ,,podobne rozpuszcza podobne".

Dla ulatwienia rozpuszczania analitów w rozpuszczalniku organicznym, próbk naley wysuszy i rozdrobni. W aparacie Soxhleta substancje ekstrahowane s cieplym rozpuszczalnikiem, a temperatura ekstrakcji zaley od temperatury kondensatu, a ta od temperatury wrzenia uytego rozpuszczalnika. Substancja ekstrahowana nie styka si z gorcymi parami rozpuszczalnika. To jest korzystne dla analitów lotnych i niestabilnych termicznie, które moglyby si rozloy lub by porywane wraz z parami rozpuszczalnika. Z kolei nisza temperatura zmniejsza rozpuszczalno analitów, przez co ekstrakcja jest powolna. Ekstrakcja jest powolna, dlatego e podczas napelniania pojemnika kondensatem przebiega statycznie (nie ma ruchu rozpuszczalnika wzgldem próbki). Jedynie przelewanie ekstraktu do kolby odbywa si szybko i jest to jednoczenie mechaniczne plukanie zawartoci gilzy. Szybkie przelewanie ulatwia wymian warstwy 104

rozpuszczalnika bezporednio przylegajcej do powierzchni próbki. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta trwa dlugo i zwykle wynosi od 6 do 48 godzin.

Czas ekstrakcji mona okrela iloci pojedynczych cykli (przelewów), których powinno by minimalnie 30. Czas trwania ekstrakcji ustala si eksperymentalnie, sprawdzajc, czy rozpuszczalnik w gilzie zawiera jeszcze substancje ekstrahowane (próba na szkielku zegarkowym). Ilo uytego rozpuszczalnika zaley od nawaki próbki, zwykle stosuje si 300 mL na 10 g próbki. Technika ekstrakcji w aparacie Soxhleta, mimo e jest procedur dlugotrwal, daje najdokladniejsze wyniki i jest stosowana, jako metoda odniesienia dla innych, szybkich technik i wci ulepszana. Aby zwikszy szybko i wydajno ekstrakcji, zastosowano cylindryczne, wykonane ze stali nierdzewnej, autoklawy z aparatem Soxhleta wewntrz, umoliwiajce ekstrakcj w podwyszonym cinieniu. Taki zestaw musi by zaopatrzony w system pomp do wody chlodzcej, dla otrzymania kondensatu. Ekstrakcja pod zwikszonym cinieniem jest krótka, redukuje zuycie rozpuszczalnika, ale aparatura jest droga. Jest stosowana do izolacji chlororganicznych pestycydów i polichlorowanych bifenyli w warzywach (marchew, pomidory), w oliwie i liofilizowanym misie ryb. Inny sposób na popraw parametrów ekstrakcji za pomoc aparatów Soxhleta zaproponowano w automatycznych ekstraktorach, wprowadzonych przez firm Buchi oraz firm Foss. Ekstrakcja w automatycznych ekstraktorach sklada si z dwóch etapów:

· ·

ekstrakcji wlaciwej we wrzcym rozpuszczalniku, ekstrakcji dodatkowej (przemywania) kondensatem rozpuszczalnika.

Podwójn ekstrakcj umoliwia konstrukcja aparatu, w którym pojemnik z gilz moe si znajdowa na dwu rónych poziomach: we wrzcym rozpuszczalniku i ponad jego powierzchni. Aparat firmy Foss umoliwia równie zagszczanie i wstpne suszenie ekstraktu wraz z odzyskiem rozpuszczalnika. Budow zasad dzialania automatycznego ekstraktora SoxtecTM 2050, firmy Foss przedstawiono na rysunku 30. Ekstraktor SoxtecTM sklada si z systemu ogrzewania elektrycznego (1), pojemnika na rozpuszczalnik (2), gilzy (3) na próbk (4) oraz chlodnicy zwrotnej (5). Proces ekstrakcji w aparacie SoxtecTM 2050 sklada si z czterech etapów. W pierwszym etapie gilza z próbk zanurzona jest we wrzcym rozpuszczalniku, gdzie temperatura i ruch wrzcej cieczy ulatwiaj szybk ekstrakcj. Po glównym etapie ekstrakcji, gilza z próbk zostaj podniesione i znajduj si nad powierzchni ekstraktu (6). W tym etapie, który odbywa si jak w tradycyjnym aparacie Soxhleta, nastpuje dokoczenie ekstrakcji i przeplukanie próbki i gilzy czystym rozpuszczalnikiem. Po zakoczeniu ekstrakcji ekstrakt zostaje zagszczony (7) a odparowany i skroplony w chlodnicy rozpuszczalnik, krócem (8) zostaje zebrany do ponownego uycia. W ostatnim etapie ekstrakt jest wstpnie suszony (9) przez lagodne ogrzewanie nad powierzchni plyty grzejnej. Zestaw do ekstrakcji SoxtecTM 2050 sklada si z szeciu stanowisk, co oznacza moliwo ekstrakcji jednoczenie 6 próbek. Caly proces jest w pelni zautomatyzowany.

105

5

8

3 2 4 6 7 9

1

Rysunek 30. Zasada dzialania automatycznego ekstraktora SoxtecTM 2050 (za zgod Dyrektora Dzialu Handlowego FOSS Polska) W aparacie Soxtec mona oznacza zawarto rónych substancji rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych, w takich matrycach, jak: produkty ywnociowe, pasze, gleba, polimery, produkty wlókiennicze, masa papiernicza i inne. System Soxtec jest oficjalnie zaaprobowany i stosowany m.in. w normie ISO1444:1996, dotyczcej oznaczania wolnego tluszczu w misie i produktach misnych, oraz w normie EPA 3541, dotyczcej oznaczania polichlorowanych bifenyli w glebie i osadach. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta moe by wspomagana ultradwikami, zestaw taki przedstawiono na rysunku 31, w kolejnym rozdziale. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta wspomagana promieniowaniem mikrofalowym (ang. microwave assisted soxhlet extraction, MASE) prowadzona jest zawsze w systemie otwartym, czyli przy cinieniu atmosferycznym (patrz rozdz.: II.5.2.8. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym). Po wlczeniu aparatu, gdy pary rozpuszczalnika po skropleniu w chlodnicy wypelni pojemnik z próbk, wlczane jest promieniowanie mikrofalowe. Mikrofale s ogniskowane wylcznie na pojemniku z próbk. Po okrelonym czasie, gdy promieniowanie zostanie wylczone, otwiera si zawór na syfonie i ekstrakt splywa do kolby, po czym zaczyna si kolejny cykl. Aparaty do MASE s zautomatyzowane, czas procesu jest krótki a ekstrakcja zachodzi z du wydajnoci.

106

5.2.7. Ekstrakcja wspomagana ultradwikami Ekstrakcja wspomagana ultradwikami (ang. ultrasound-assisted extraction, UAE) stosowana jest do próbek stalych lub semistalych. Próbk miesza si z rozpuszczalnikiem ekstrahujcym i poddaje dzialaniu ultradwików. Rozchodzenie si fal dwikowych w cieczy zwizane jest z cyklami zagszczenia i rozrzedzenia, które w cieczy i gazie s zmianami cinienia (fala cinienia). Zmienne cinienie akustyczne powoduje zjawiska wtórne, które przyspieszaj proces ekstrakcji. Wród zjawisk wtórnych, najwiksze znaczenie w procesie przenoszenia mas ma kawitacja ­ proces dynamicznego tworzenia si, wzrostu i zaniku pcherzy parowo gazowych w cieczy. Tworzenie si pcherzyków lub innych obszarów zamknitych, tzw. kawern, zawierajcych par danej cieczy, gaz lub mieszanin parowo-gazow nastpuje w cyklu rozrzedzenia, czyli zmniejszenia cinienia. Dzialaj wtedy due sily rozcigajce, powodujce lokalne rozerwania ciglego orodka (cieczy). Nadmiar energii przenoszonej przez fal akustyczn powoduje wzrost i w kocu implozj pcherzyka, która jest ródlem lokalnych fal udarowych (szybka adiabatyczna kompresja gazu powoduje w pcherzyku lokalny, gwaltowny wzrost temperatury do 5000°C i cinienia do 100 MPa). Proces tworzenia si i rozerwania pcherzyka trwa 0,0004 s. Kiedy kawitacja zachodzi w cieczy pokrywajcej powierzchni ciala stalego, kawerny i pcherzyki zapadaj si niesymetrycznie, tworzc silny strumie cieczy w kierunku powierzchni (o szybkoci do 400 km/h). Tak silny strumie powoduje powane uszkodzenie w miejscu uderzenia i udostpnia do ekstrakcji now powierzchni próbki. Kawitacja, tarcie na powierzchniach midzyfazowych i absorpcja energii fali akustycznej oraz zwizane z nimi wydzielanie ciepla sprawia, e wspomaganie ekstrakcji ultradwikami zwiksza rozpuszczalno, dyfuzj, penetracj rozpuszczalnika i transport analitu, a to zdecydowanie skraca czas ekstrakcji i zwiksza jej wydajno. W ekstrakcji wspomaganej ultradwikami stosuje si drgania akustyczne o nieduej czstotliwoci, rzdu 20÷50 kHz (rzadziej 500 kHz), ale o duym nateniu ­ 140÷160 dB (dla wywolania kawitacji). Ekstrakcj mona przeprowadza dwoma sposobami, pierwszy to zastosowanie lani ultradwikowej (rysunek 31a i 31c). W tym celu próbk umieszcza si w szklanym lub metalowym naczyniu i wstawia do lani. Zalet tego sposobu jest moliwo jednoczesnej ekstrakcji wielu próbek. Drugim sposobem jest uycie sondy generujcej ultradwiki, zanurzanej bezporednio do próbki (rysunek 31b). Ten sposób stosuje si wtedy, gdy jest konieczno uycia duej energii, np. do rozerwania tkanek czy komórek. Ilo energii, jak naley dostarczy do próbki, zaley od wielu czynników: lepkoci i temperatury próbki, obecnoci par i gazów w cieczy, stenia i wielkoci czsteczek stalych oraz ksztaltu i geometrii komory z ciecz. Du zalet ekstrakcji ultradwikami jest moliwo przeprowadzania jej z du wydajnoci w pokojowej temperaturze, co jest bardzo korzystne dla nietrwalych analitów.

107

Do ekstrakcji wspomaganej ultradwikami stosowane s róne rozpuszczalniki, w zalenoci od wlaciwoci chemicznych analitu i matrycy, lcznie z wod oraz ich mieszaniny. Podczas ekstrakcji lotnymi rozpuszczalnikami, zwlaszcza w podwyszonej temperaturze, mona zastosowa zestaw z chlodnic zwrotn, pokazany na rysunku 31c. Ekstrakcj w aparacie Soxhleta mona wspomaga równie ultradwikami, jak to pokazano na rysunku 32. Czas trwania ekstrakcji rozpuszczalnikiem, wspomaganej ultradwikami jest krótki w porównaniu z klasycznymi metodami i, w zalenoci od próbki, wynosi od 10 min do 1 h.

Uchwyt Chlodnica Statyw

Próbka z rozpuszczalnikiem

Woda Generator ultradwików

a)

b)

c)

Rysunek 31. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana ultradwikami, a,c ­ w lani ultradwikowej i b ­ z zastosowaniem sondy generujcej ultradwiki Niedogodnoci ekstrakcji rozpuszczalnikiem wspomaganej ultradwikami jest konieczno oddzielenia ekstraktu od pozostaloci poekstrakcyjnej. Technika ta moe równie powodowa czciow degradacj analitu. W czasie kawitacji mog tworzy si wolne rodniki lub inne reaktywne skladniki, prowadzce do przemian oznaczanych substancji. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana ultradwikami jest szeroko stosowana w przemyle farmaceutycznym (np. ekstrakcja alkaloidów z rolin), perfumeryjnym i spoywczym (np. intensyfikacja wydobycia cukru z buraków albo tranu z wielorybów i ryb) i innych. Ekstrakcja ultradwikowa znajduje szerokie zastosowanie w analityce, glównie w biologii i biotechnologii, farmacji oraz ochronie rodowiska (np. izolacja pozostaloci pestycydów z warzyw i owoców). 5.2.8. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym (ang. microwaveassisted extraction, MAE) jest powszechnie stosowana technik do izolacji analitów z próbek stalych. W technice tej wykorzystuje si zjawisko bezporedniej absorpcji promieniowania mikrofalowego przez czsteczki substancji. Skuteczno wspomagania ekstrakcji promieniowaniem mikrofalowym wynika ze sposobu przekazywania energii cieplnej. Tradycyjne ogrzewanie próbki czy rozpuszczalnika polega na przekazywaniu energii cieplnej ze ródla przez konwekcj lub przewodzenie, co dlugo trwa i wie si ze stratami energii. Mikrofale natomiast dostarczaj energi bezporednio czsteczce zwizku chemicznego.

108

Chlodnica Aparat Soxhleta Sonda ultradwikowa

Gilza porowata z próbk Termostatowana lania wodna

Lcznik teflonowy

Rozpuszczalnik i ekstrakt

Rysunek 32. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta wspomagana ultradwikami Przekazywanie energii mikrofal moe odbywa si na dwa sposoby. Pierwszy wynika z polaryzacji dipolowej. W polu elektrycznym, czsteczki zwizków o momencie dipolowym rónym od zera, ulegaj polaryzacji, czyli ustawiaj si zgodnie z kierunkiem i zwrotem tego pola. W przypadku mikrofal o czstotliwoci 2,45 GHz (taka czstotliwo stosowana jest w piecach mikrofalowych), pole elektryczne zmienia zwrot 4,9 x 109 razy na sekund (co pól okresu fali promieniowania, 2 x 2,45 109 s-1). Zmiany pola wymuszaj ruch drgajcy dipoli, które usiluj ustawi si zgodnie z jego kierunkiem. Intensywno oscylacji zaley m.in. od wielkoci momentu dipolowego. Ruch czsteczek o wikszym momencie dipolowym, np. acetonu (2,69 D), metanolu (2,87 D), acetonitrylu (3,44 D) jest intensywniejszy ni czsteczek o mniejszym momencie dipolowym, np. heksanu (<0,1 D). Zmieniajc swoje poloenie, dipole uderzaj w ssiadujce z nimi czsteczki, przekazujc im swoj energi. W ten sposób cieplo rozchodzi si szybko i równomiernie w calej próbce. Czsteczki, które maj moment dipolowy równy 0, np. izooktan, nie wykonuj ruchów w polu elektrycznym. Drugi sposób przekazywania energii mikrofal opiera si na ruchliwoci jonów w roztworze w polu elektromagnetycznym (dodatnie przemieszczaj si w jedn, ujemne w drug stron) i wynikajcym z niego przewodnictwie jonowym. Cieplo próbki jest wynikiem tarcia midzy poruszajcymi si jonami a roztworem. Innym wskanikiem okrelajcym zdolno materii do przeksztalcania energii mikrofal w energi ciepln jest tg , zwany tangensem kta strat, tangensem strat lub tangensem delta. Termin 109

strata odnosi si do straty (oddania) energii fali w wyniku jej absorpcji, a wartoci tg dla poszczególnych rozpuszczalników mona odnale w tablicach fizycznych. Wybór warunków ekstrakcji ze wspomaganiem promieniowaniem mikrofalowym uzaleniony jest od wyboru rozpuszczalnika, który przede wszystkim ma rozpuszcza substancj ekstrahowan. Jeli to moliwe, ekstrahent powinien mie moment dipolowy róny od zera, czyli by rozpuszczalnikiem polarnym, np.: metanol, etanol, woda, aceton, octan etylu, dichlorometan, acetonitryl i inne. Rozpuszczalniki, które maj du warto tangensa , np. metanol (tg = 0,64), woda (tg = 0,157) lub mieszaniny niepolarnych z polarnymi bd absorbowaly promieniowanie mikrofalowe i szybko si grzaly. Takie rozpuszczalniki zostaj podgrzane bardzo szybko do temperatury powyej temperatury wrzenia ten sposób ekstrakcji wymaga specjalnej aparatury, w tzw. ukladzie zamknitym. Umoliwia on szybk ekstrakcj analitów z matrycy. Jeli substancja jest ekstrahowana rozpuszczalnikiem nieabsorbujcym promieniowania mikrofalowego, nie ulega on podgrzaniu. W tym przypadku mikrofale s absorbowane nie przez ekstrahent, a przez zdolne do absorpcji skladniki próbki, które nastpnie oddaj cieplo do rozpuszczalnika.

Skladnikiem próbki, który ogrzewa calo jest bardzo czsto woda w niej zawarta oraz inne polarne substancje. W tym przypadku temperatura nie jest wysoka i ekstrakcja moe by przeprowadzana w ukladzie otwartym, przy cinieniu atmosferycznym. Schemat urzdzenia do ekstrakcji w ukladzie zamknitym przedstawiony jest na rysunku 33a. Próbka z rozpuszczalnikiem znajduje si w zamknitym naczyniu, najczciej teflonowym, zwanym bomb, poniewa temperatura roztworu dochodzi zwykle do 150÷190°C lub wyej i wzrasta cinienie. Obudowa bomby teflonowej musi by z materialu przepuszczajcego (nieabsorbujcego) promieniowanie mikrofalowe i musi posiada wskanik cinienia i zawór bezpieczestwa, który uruchamia si, gdy cinienie przekroczy warto 10 MPa. Material obudowy pozwala wyj bomb z pieca mikrofalowego bezporednio po ekstrakcji, gdy nie nagrzewa si. ródlem promieniowania mikrofalowego jest magnetron, polczony z komor pieca falowodem. Dla urednienia energii stosowane jest metalowe mieszadlo i obrotowa podstawa, na której znajduj si próbki w bombach. Czujniki temperatury i cinienia polczone s z bombami. Komercyjnie dostpne s zestawy do MAE, o rónej pojemnoci naczynia ekstrakcyjnego, od 20 do 120 mL. Schemat urzdzenia do ekstrakcji wspomaganej promieniowaniem mikrofalowym przy cinieniu atmosferycznym przedstawiono na rysunku 33b. W tym urzdzeniu energia mikrofali jest kierowana tylko do jednego naczynia, wykonanego zwykle ze szkla lub kwarcu. W ekstrakcji wspomaganej mikrofalami uywa si od 2 do 20 g próbki i do 30 mL rozpuszczalnika. Czas trwania ekstrakcji zwykle nie przekracza 30 min (10÷20 min), czas chlodzenia trwa ok. 20 min.

110

Czujniki temperatury i cinienia

Chlodnica Mieszadlo metalowe Falowód

Magnetron

Talerz obrotowy

Bomba

Próbka

Rozpuszczalnik

a)

b)

Rysunek 33. Zestawy do ekstrakcji wspomaganej promieniowaniem mikrofalowym, a ­ do cinieniowej ekstrakcji (w naczyniu zamknitym), b - do ekstrakcji przy cinieniu atmosferycznym (w naczyniu otwartym) W urzdzeniach do celów badawczych wykorzystuje si mikrofale o czstotliwoci 2,45 GHz (piece mikrofalowe do zamknitej ekstrakcji pod podwyszonym cinieniem, (rys. 34a) oraz o czstotliwoci 0,9 GHz (w piecach do otwartej ekstrakcji pod cinieniem atmosferycznym, rys. 34b). Generator mikrofal ­ magnetron jako ródlo ciepla zastosowano po raz pierwszy w 1946 r. W laboratorium, pierwszy raz wykorzystano piec mikrofalowy do mineralizacji kwasowej próbek w 1975 r., a do ekstrakcji zwizków organicznych ­ 1986 r. MAE jest obecnie szeroko stosowan technik ekstrakcji w oznaczaniu takich zanieczyszcze rodowiska, jak: wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne, polichlorowane bifenyle, pestycydy, fenole, olej mineralny. Stosowana jest do oznacze w glebie, rolinach i innych próbkach stalych, jak polimery - do oznaczania oligomerów, tabletki ­ do oznaczania skladu, ziola ­ do izolacji zwizków biologicznie aktywnych oraz wiele innych. EPA (Environmental Protection Agency) wprowadzila ekstrakcj wspomagan promieniowaniem mikrofalowym jako standardow metod ekstrakcji semilotnych i nielotnych skladników z próbek stalych. 5.2.9 Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika pod zwikszonym cinieniem Zwikszone cinienie rozpuszczalnika ulatwia jego penetracj w glb stalej matrycy, dziki temu ekstrakcja jest wydajniejsza. Ekstrakcj za pomoc rozpuszczalnika pod zwikszonym cinieniem wykonuje si wykorzystujc pomp chromatografu cieczowego. Rozdrobnion próbk umieszcza si w kolumnie a nastpnie za pomoc pompy chromatografu, przepuszcza si przez ni rozpuszczalnik pod zwikszonym cinieniem (rysunek 34).

111

Kolumna wypelniona próbk

Zbiornik z ekstrahentem

Pompa HPLC

Odbieralnik ekstraktu

Rysunek 34. Zestaw do ekstrakcji rozpuszczalnikiem pod zwikszonym cinieniem Próbki przed ekstrakcj mona zmiesza (ucierajc) z wypelniaczem, np. z adsorbentem polarnym, takim jak: el krzemionkowy lub tlenek glinu. Adsorbent wie wod zawart w próbce, co ulatwia penetracj rozpuszczalnika organicznego oraz zmienia oddzialywania midzy matryc próbki a analitami, ulatwiajc ich desorpcj i rozpuszczanie w ekstrahencie. Ten sposób ekstrakcji stosuje si do izolacji z próbek gleby wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych (WWA) lub polichlorowanych bifenyli (PCB). 5.2.10. Przyspieszona ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika W przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika (ang. pressurized fluid extraction, PFE lub accelerated solvent extraction, ASE lub pressurized liquid extraction, PLE) stosuje si konwencjonalne rozpuszczalniki, ekstrakcj przeprowadza w szczelnym, wytrzymalym naczyniu, zwanym celk ekstrakcyjn, a przyspieszenie ekstrakcji osiga przez stosowanie wysokiej temperatury (100÷200°C), co w zamknitym naczyniu powoduje wzrost cinienia nawet do 20 MPa. Metoda przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika stosowana jest do izolacji iloci ladowych analitów z próbek stalych i semistalych. Jest metod szybk i gwarantujc du wydajno, powszechnie zalecan dla analitów lub/i matryc trwalych temperaturowo. Podgrzewanie cieczy w zamknitym naczyniu powoduje wzrost cinienia i wzrost temperatury wrzenia, dlatego ekstrakcja moe by przeprowadzana ciecz, mimo e jej temperatura znacznie przewysza temperatur wrzenia w warunkach normalnych. Podwyszona temperatura i cinienie wplywaj na wlasnoci rozpuszczalnika, próbki oraz ich wzajemne oddzialywania. Glównym powodem duej wydajnoci technik ASE jest temperatura, która powoduje zwikszenie rozpuszczalnoci substancji oraz zwikszenie kinetyki przenoszenia masy ­ szybszej desorpcji analitu z fazy stalej i szybszej dyfuzji do rozpuszczalnika. Wysoka temperatura zmniejsza lepko 112

rozpuszczalnika oraz napicie powierzchniowe, co ulatwia penetracj rozpuszczalnika w glb matrycy. Drugim powodem wikszej wydajnoci w wysokiej temperaturze jest zaklócanie stanu równowagi na powierzchni styku rozpuszczalnik ­ matryca, przez oslabienie oddzialywa rozpuszczalnika z matryca typu sil Van der Waalsa, wiza wodorowych czy przycigania dipoli. Daje to lepszy kontakt rozpuszczalnika z próbk, co konsekwencji skraca czas ekstrakcji i ilo rozpuszczalnika. W przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika cinienie nie odgrywa a tak duej roli jak temperatura, jednak umoliwia glbsz penetracj w matryc i ekstrakcj analitów zatrzymanych w porach. Wymuszanie penetracji jest szczególnie korzystne przy wilgotnych próbkach i matrycach silnie adsorbujcych anality. Zestaw do przyspieszonej ekstrakcji próbek stalych za pomoc rozpuszczalników przedstawiono na rysunku 35.

Zawory

Pompa

Termostat Celka ekstrakcyjna z próbk

Zawór Odbieralnik ekstraktu Butla z azotem spronym

Butelki z rozpuszczalnikami do ekstrakcji

Rysunek. 35. Schemat zestawu do przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalników z próbek stalych Sklada si on z termostatowanej komory (pieca), w której umieszcza si celk z ekstrahowan próbk, pompy dozujcej rozpuszczalniki, odbieralnika ekstraktu i zbiornika obojtnego gazu spronego oraz szeregu zaworów, umoliwiajcych odpowiednie dozowanie. Celka wykonana jest najczciej ze stali kwasoodpornej. Po umieszczeniu celki z próbk w termostacie, uklad wypelnia si zimnym rozpuszczalnikiem i nastpnie wlcza ogrzewanie komory termostatu. Ekstrakcj prowadzi si zwykle w zakresie temperatur 100÷200°C w czasie 5÷10 min. Cinienie w celce ekstrakcyjnej moe wzrosn do ok. 20 MPa. Jeli ekstrakcja jest jednostopniowa, analit wyplukuje si wie porcj rozpuszczalnika do naczynka na ekstrakt. Ruch rozpuszczalnika jest wymuszany cinieniem gazu z 113

butli (najczciej azotu). Jeli ekstrakcja ma by wielokrotna, ponownie napelnia si uklad zimnym ekstrahentemi, wlcza ogrzewanie komory termostatu i powtarza caly cykl. W technice ASE stosuje si kilku gramowe nawaki próbek, maksymalnie od 10 do 30 g i male iloci (kilka mL) rozpuszczalników, stosownie do iloci próbki. Przy oznaczaniu WWA w glebie moliwa byla nawet miniaturyzacja ekstrakcji, w której uyto 50 mg próbki i 100 µL estrahenta. Technika przyspieszonej ekstrakcji próbek stalych za pomoc rozpuszczalników moe by w pelni zautomatyzowana i umoliwia wielokrotn ekstrakcj jednym lub rónymi rozpuszczalnikami. Czas ekstrakcji zaley od iloci cykli, jeden cykl trwa zwykle kilka minut. W przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika wykorzystuje si takie same rozpuszczalniki jak w klasycznych metodach. Najczciej s to aceton, octan etylu, dichlorometan, heksan, toluen, woda. Czsto stosuje si mieszanin rozpuszczalników lub dodatek kwasów: octowego, fosforowego i trifluoroctowego. Na szczególn uwag zasluguje przyspieszona ekstrakcja za pomoc wody. Technik t nazywa si SHWE (ang. subcritical hot-water extraction) lub PHWE (ang. plessurized hot water extraction). Woda, poniej punktu krytycznego, który osiga w temperaturze 374°C i cinieniu 22 MPa, zmienia swoje wlaciwoci. W warunkach normalnych, 20°C i cinieniu atmosferycznym, warto stalej dielektrycznej wody wynosi = 78,3, natomiast w temperaturze 250°C i cinieniu 5 MPa, warto spada do ok. 27, co zblia wlaciwoci wody w tych warunkach do wlaciwoci etanolu w warunkach normalnych ( etanol = 24,3). W konsekwencji zwiksza si rozpuszczalno w wodzie wielu zwizków redniopolarnych. Poza tym wzrost temperatury i cinienia zmniejsza napicie powierzchniowe wody oraz lepko, co zwiksza wydajno ekstrakcji. W przyspieszonej ekstrakcji wod stosuje si temperatury od 100 do 374°C i cinieniu pozwalajcym utrzyma stan ciekly wody. Jeli woda przejdzie w stan pary stanie si bardzo korozyjnym i agresywnym dla analitów medium, o czym naley pamita przy doborze warunków ekstrakcji. Woda nie jest rozpuszczalnikiem, który mona stosowa bezporednio w chromatografii gazowej. Konieczna staje si wic ekstrakcja z wody do rozpuszczalnika organicznego (LLE, SDME) lub do fazy stalej (SPME, SBSE). Ekstrakcja z wody jest bardzo wydajna, bo przy obnianiu temperatury ekstraktu wodnego do pokojowej, rozpuszczalno analitów gwaltownie spada. Najczciej wymieniane zalety techniki przyspieszonej ekstrakcji próbek stalych za pomoc rozpuszczalników to: · · · · · · nie wymaga suszenia próbek (cinienie i temperatura zapewniaj wystarczajc penetracj matrycy przez rozpuszczalniki o rónej polarnoci), korzystna kinetyka ekstrakcji - desorpcja z matrycy, rozpuszczanie w ekstrahencie i transport analitów zachodz szybko), krótkie czasy ekstrakcji, wynikajce z kinetyki, moliwo zbudowania zestawu do ASE, latwo automatyzacji procesu, latwo obslugi aparatu. 114

Technik przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika pocztkowo zastosowano do ekstrakcji organicznych, ladowych zanieczyszcze gleby i osadów ciekowych. Amerykaska Agencja Ochorony rodowiska (ang. Environmental Protection Agency, EPA) wprowadzila ASE jako metod standardow izolacji organicznych analitów ze rodowiskowych próbek stalych, zwlaszcza do ekstrakcji WWA, oleju mineralnego oraz trwalych zanieczyszcze rodowiska, tzw. POP (ang. persistent organic pollutants) z gleby, osadów oraz pylów. Do POP zalicza si takie zanieczyszczenia, jak: chloroorganiczne i fosforoorganiczne pestycydy, polichlorowane bifenyle i dioksyny. Obecnie technika ASE jest stosowana do oznaczania pestycydów w rolinach, produktach ywnociowych i w tkankach zwierzcych, do oznaczania aflatoksyn, furanów, zwizków cyjanoorganicznych. Stosowana jest równie do izolowania plastyfikatorów z polimerów, dodatków i aktywnych skladników farmaceutyków jak i izolacji tluszczów z próbek ywnoci. 5.2.11. Ekstrakcja plynem w stanie nadkrytycznym Ciecz a raczej plynem w stanie nadkrytycznym jest medium znajdujce si w warunkach powyej warunków punktu krytycznego, tzn. ma temperatur wysz od temperatury krytycznej i jest pod cinieniem wyszym od cinienia krytycznego. Definicj t obrazuje diagram przemian fazowych przedstawiony na rysunku 36. Wykres przemian fazowych przy zmianie temperatury i cinienia charakteryzuj dwa punkty, które okrelaj, w jakich warunkach trwale s róne stany skupienia substancji. S to punkt potrójny i punkt krytyczny. Punktem potrójnym jest stan, w którym wspólistniej w stanie równowagi termodynamicznej trzy stany skupienia danej substancji.

Cialo stale

Cinienie

Ciecz ciliwa

Plyn w stanie nadkrytycznym

Pk

Faza ciekla

Punkt krytyczny

Ppp

Faza gazowa Punkt potrójny

Para przegrzana Para

Tpp

Tk

Temperatura

Rysunek 37. Schemat typowego diagramu przemian fazowych w ukladzie cinienia i temperatury dla czystej substancji Przy wartociach cinienia i temperatury poniej wartoci punktu potrójnego mog istnie tylko dwie fazy; stala i gazowa, oddziela je krzywa sublimacji. Powyej wartoci punktu potrójnego, w zalenoci 115

od zmian wartoci cinienia i temperatury, a do wartoci punktu krytycznego, mog istnie trzy stany skupienia substancji ­ gazowa, ciekla i stala. Faz stal od cieklej oddziela krzywa topnienia, faz ciekl od gazowej ­ krzywa parowania (wrzenia). Powyej wartoci okrelanych przez punkt krytyczny, substancja znajduje si w stanie nadkrytycznym, w którym zanika rónica midzy gazem a ciecz i zmiany cinienia i temperatury powyej tego punktu nie zmieniaj jej stanu skupienia. Punkt potrójny i punkt krytyczny s wielkociami charakterystycznymi dla danej substancji. Substancja w stanie nadkrytycznym ma wlaciwoci porednie midzy gazem a ciecz. Plyn w stanie nadkrytycznym ma gsto zblion do gstoci cieczy (0,2÷0,9 g/mL), lepko zblion do lepkoci gazu (10-4 g/s cm) a wspólczynnik dyfuzji mniejszy ni dla gazu ale wyszy ni dla cieczy (10-4 cm2/s). Gsto plynu w stanie nadkrytycznym sprawia, e substancje rozpuszczaj si w nim jak w cieczy, mala lepko plynu i niskie napicie powierzchniowe sprzyjaj penetracji matrycy, podobnej do penetracji gazu, wspólczynnik dyfuzji powoduje, e przenoszenie masy jest szybsze ni w cieczy. Wymienione cechy s bardzo korzystne dla procesu ekstrakcji. Rozpuszczalno w plynie nadkrytycznym zaley przede wszystkim od temperatury i gstoci, a w mniejszym stopniu od cinienia. Wiele substancji w stanie nadkrytycznym posiada dobre wlaciwoci rozpuszczania, jednak w ekstrakcji znalazlo zastosowanie tylko kilka. Ograniczeniem s wysokie wartoci cinienia i temperatury stanu krytycznego. Najpowszechniej stosowany jest ditlenek wgla (CO2), przede wszystkim dlatego, e ma nisk temperatur krytyczn (31,1°C), niskie cinienie krytyczne (7,38 MPa), jest nietoksyczny i niepalny oraz latwy do otrzymania o wysokiej czystoci. Ditlenek wgla jest niepolarny, wic mona nim ekstrahowa tylko niepolarne i redniopolarne zwizki. Ekstrakcja polarnych i silnie zwizanych z matryc zwizków za pomoc samego CO2 w stanie nadkrytycznym jest niewydajna, ale mona zastosowa dodatek malych iloci (1÷10%) substancji polarnych, zw. modyfikatorami. Najczciej stosowanymi modyfikatorami s metanol, etanol, alkohol izopropylowy, aceton, acetonitryl, dichlorometan, toluen, kwas mrówkowy i ditlenek siarki. Ekstrakcj plynem w stanie nadkrytycznym (ang. supercritical fluid extraction, SFE) mona przeprowadza statycznie i dynamicznie. Próbki o zwartej strukturze matrycy, zawierajce trudno rozpuszczalne anality musz mie zapewniony dlugi czas kontaktu z ekstrahentem, dlatego ich ekstrakcj przeprowadza si sposobem statycznym. Próbk umieszcza si w plynie w stanie nadkrytycznym i po okrelonym czasie ekstrakcji, usuwa plyn z analitami do odbieralnika. Sposób dynamiczny stosuje si do próbek latwo penetrowanych przez plyn i zawierajcych anality dobrze w nim rozpuszczalne. Plyn w stanie nadkrytycznym przepuszcza si w sposób cigly przez próbk a ekstrakt zbierany jest w odbieralniku. Sposób dynamiczny ekstrakcji moe by prowadzony równie z wielokrotnym zawracaniem ekstrahenta do próbki (recyrkulacja), zanim zostanie zebrany w odbieralniku. W odbieralniku nastpuje odzyskiwanie analitów z roztworu. Schemat zestawu do ekstrakcji plynem w stanie nadkrytycznym przedstawiono na rysunku 37. Zestaw sklada si z pieca o regulowanej temperaturze, w którym znajduje si ekstraktor, restryktora i odbieralnika ekstraktu. Do ekstraktora doprowadzany jest, ze stalowej butli, sprony CO2 oraz - jeli to konieczne ­ modyfikator. 116

Sprony CO2 i modyfikator, po osigniciu w piecu wlaciwej temperatury stanu nadkrytycznego, stanowi ekstrahent, który jest wprowadzany do próbki w sposób statyczny lub dynamiczny. Po zakoczeniu procesu ekstrakt wprowadzany jest do odbieralnika poprzez restryktor (przewenie), którego zadaniem jest obnienie cinienia wychodzcego plynu. Stosowne s dwie grupy restryktorów, stale i zmienne.

Zawory

Pompy

Piec Ekstraktor

Restryktor Odbieralnik ekstraktu Butla z CO2 spronym Pojemnik z modyfikatorem

Rysunek 37. Schemat zestawu do ekstrakcji plynem (CO2) w stanie nadkrytycznym Restryktor staly to rurka o stalej rednicy wykonana z metalu lub topionej krzemionki lub kwarcu. Restryktor zmienny ma kryz lub otwór wylotowy sterowany elektronicznie. Restryktory stale czsto zatykaj si z powodu zamarzania wody, przy szybkim rozpraniu plynu oraz z powodu obecnoci siarki elementarnej lub duych iloci wglowodorów czy tluszczów w ekstrakcie. S za to bardzo tanie i latwe do zamontowania, w porównaniu do bardzo drogich restryktorów zmiennych (elektronicznych). Po obnieniu cinienia, ekstrakt jest kierowany do odbieralnika. Stosowane s dwa sposoby odzyskiwania analitów z ekstraktu: absorpcja w rozpuszczalniku i adsorpcja na sorbencie stalym. Absorpcja w rozpuszczalniku jest prosta i latwa w optymalizacji warunków, ale wie si ze stratami analitu w postaci aerozolu lub/i strat rozpuszczalnika. Warunki adsorpcji na sorbencie stalym s trudniejsze do ustalenia, ale odzysk jest bez strat i istnieje moliwo selektywnego wymywania substancji z adsorbentu. Dobór warunków SFE powinien uwzgldnia parametry procesu (cinienie, temperatur, szybko przeplywu w procesie dynamicznym, czas ekstrakcji, wielko próbki i pojemno ekstraktora) oraz wlaciwoci chemiczne i fizyczne matrycy (np. posta fizyczna, jednorodno, rozpuszczalno, zdolno do adsorpcji i desorpcji analitów i in.). 117

Zmieniajc parametry procesu, zmienia si wlaciwoci plynu w stanie nadkrytycznym. Gsto plynu ulega zmianie ze zmian cinienia oraz temperatury. Plyn o mniejszej gstoci ma wlaciwoci rozpuszczalników niepolarnych, natomiast o duej gstoci ­ wlaciwoci bardziej polarnych rozpuszczalników, jak dichlorometanu. Due znaczenie w zwikszaniu rozpuszczalnoci analitów ma dodatek do CO2 modyfikatora. Czas ekstrakcji i szybko przeplywu plynu w procesie dynamicznym naley dopasowa do wlaciwoci matrycy, aby zapewni wystarczajcy czas kontaktu CO2 z analitem. Mona zmodyfikowa równie próbk przez wymieszanie jej z sorbentem stalym o odpowiednich wlaciwociach, aby nie dopuci do ekstrakcji zwizków przeszkadzajcych. Dodatek do próbki polarnego elu krzemionkowego powoduje zatrzymanie w matrycy wielu balastowych, polarnych i rednio polarnych substancji. SFE trwa zwykle od 10 do 60 min, w analityce próbki maj zwykle mas mniejsz ni 10 g a minimalna ilo plynu wynosi ok. 10 mL. W metodzie dynamicznej szybko przeplywu plynu wynosi od 1 do 4 mL/min. Plyn w stanie nadkrytycznym do ekstrakcji zastosowano po raz pierwszy w 1978 r. Technik t wprowadzil koncern Kraft General Foods, obecny Maxwell House Coffee Division do produkcji kawy bezkofeinowej. Obecnie jest szeroko stosowan technik ekstrakcji zanieczyszcze rodowiska, jak WWA i innych wglowodorów, PCB, fenoli, pestycydów, herbicydów z próbek stalych. SFE stosuje si równie do oznaczania zanieczyszcze wody, po izolacji z wody do sorbentu stalego (zanieczyszczenia na sorbencie stalym s stal próbk). Ekstrakcja plynem w stanie nadkrytycznym znalazla równie zastosowanie w izolacji zanieczyszcze z ywnoci i paszy, do izolacji aktywnych biologicznie skladników ziól, przy oznaczaniu aktywnych skladników farmaceutyków i kosmetyków. SFE jest równie lczona z innymi technikami ekstrakcyjnymi, np. przy oznaczaniu parabenowych (estry kwasu p-hydroksybenzoesowego) rodków konserwujcych i polifenolowych przeciwutleniaczy w kosmetykach zastosowano ekstrakcj SFE w polczeniu z bezporedni derywatyzacj analitów i ekstrakcj metod HS-SPME. Parabeny i polifenole s nielotne, aby je oznacza metod chromatografii gazowej, naley je przeprowadzi w pochodne, np. w etery sililowe. Schemat takiej procedury przedstawiono na rysunku 38. Ekstrakt uzyskany technik SFE jest wprowadzany do odbieralnika, zawierajcego odczynnik do sililowania.

Strzykawka do SPME

Zestaw do SFE

Odczynnik sililujcy

Rysunek 38. Schemat zestawu do izolacji parabenów i polifenoli z kosmetyków polczonymi metodami SFE i HS-SPME 118

Parabeny i polifenole zawieraj grupy hydroksylowe, które reaguj z odczynnikiem. W wyniku reakcji powstaj etery sililowe, sorbujce si na wlóknie SPME. Wlókno z analitami jest nastpnie wprowadzane do dozownika chromatografu gazowego i analizowane polczonymi technikami chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC/MS). Ekstrakcja plynem w stanie nadkrytycznym ma wiele zalet: · · · · · · moliwo stosowania do termolabilnych zwizków, niezbyt wysokie cinienie krytyczne, umoliwiajce latwe konstrukcyjnie systemy regulacji cinienia a tym samym gstoci plynu, co daje du selektywno procesu, latwo usuwania ekstrahenta (nie zostawia ladów), dostpno i niski koszt CO2, moliwo bezporedniego analizowania ekstraktu metod chromatografii gazowej; moliwo polczenia z innymi technikami (chromatograficznymi i elektromigracyjnymi).

Najczciej SFE jest stosowana w oznaczeniach zanieczyszcze rodowiska (ponad 40% wszystkich zastosowa), w przemyle (ok. 20%) oraz w analizie ywnoci (ok. 14%). 5.2.12. Ekstrakcja poprzez mineralizacj Oznaczanie calkowitej zawartoci pierwiastków w próbkach stalych wymaga uprzedniej ich mineralizacji. Mineralizacja jest zespolem procesów w wyniku, których zwizki organiczne przeksztalcane s w proste zwizki mineralne takie, jak: CO2, H2O, NH3 i inne. W rodowisku naturalnym procesy mineralizacji zachodz z udzialem najczciej organizmów ywych. W przypadku mineralizacji z dostpem tlenu mówimy o butwieniu, w warunkach beztlenowych za o gniciu. W chemii analitycznej, mineralizacja próbki stalej prowadzi do otrzymania zwizków mineralnych, które latwo przeprowadzi ilociowo do roztworu. Podczas mineralizacji ogólna struktura poszczególnych czci próbki, w tym mineralów ulega destrukcji, odwrotnie ni w analizie specjacyjnej. Wybór sposobu mineralizacji zaley od rodzaju analizowanej próbki i od oznaczanego pierwiastka. Do najwaniejszych sposobów mineralizacji zaliczamy mineralizacj na mokro oraz mineralizacj na sucho, a kad z nich mona przeprowadzi metod redukcyjn lub utleniajc. Najczciej stosowan metod pozyskiwania analitów w postaci dogodnej do oznaczenia jest mineralizacja utleniajca na mokro. W tej technice uywa si mieszaniny jednego lub kilku kwasów mineralnych (najczciej: HNO3, H2SO4, HClO4) oraz zwizku o wlaciwociach utleniajcych (np. H2O2). Przykladem mineralizacji utleniajcej mokrej jest metoda Kjeldahla, wykorzystywana glównie do oznaczania azotu organicznego. Mineralizacj w kwasie azotowym z dodatkiem kwasu nadchlorowego lub wody utlenionej stosuje si do pozyskiwania metali, boru, fosforu, siarki i chlorowców z próbek organicznych. Mineralizacja jest procesem dlugotrwalym, dlatego wspomagana jest:

· ·

stosowaniem podwyszonej temperatury, wykorzystaniem promieniowania UV, jako katalizatora reakcji utleniania,

119

· · ·

wykorzystaniem lani ultradwikowej, wykorzystanie zjawiska kawitacji, uyciem energii mikrofalowej, jako nonika energii bezporednio do czsteczki zwizku mineralizowanego, uyciem podwyszonego cinienia.

Wród metod mineralizacji na sucho stosuje si stapianie z solami mineralnymi o wlaciwociach utleniajcych, jak NaNO3, KNO3, Na2CO3. Proces ten ulatwia rozpuszczanie w kwasach lub wodzie oznaczanych analitów.

120

6. Literatura

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. Kocjan, R. (red.) Chemia analityczna. Podrcznik dla studentów; Wydawnictwo Lekarskie PZWL: Warszawa, 2000; Tom 2. Komider, J.; Mazur-Chrzanowska, B.; Wyszyski, B. Odory; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 2002. Mitra, S. (red.) Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry; John Wiley & Sons Inc.: New York, 2003. Molenda, J.; Steczko, K. Ochrona rodowiska w gazownictwie i wykorzystaniu gazu; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2000. Namienik, J. (red.) Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszcze rodowiska; Wydawnictwo Politechniki Gdaskiej: Gdask, 1992. Namienik, J.; Jamrógiewicz, Z.; Pilarczyk, M.; Torres. L. Przygotowanie próbek rodowiskowych do analizy; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 2000. Namienik, J.; Jamrógiewicz, Z. (red.) Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszcze rodowiska; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1998. Paderewski, M. L. Procesy adsorpcyjne w inynierii chemicznej; Wydawnictwo NaukowoTechniczne: Warszawa, 1999. Abdel-Rehim, M. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2569-2580. Babic, S.; Petrovic, M.; Kastelan-Macan, M. J. Chromatogr. A 1998, 823, 3­9. Beyer, A.; Biziuk, M. Ecol. Chem. Eng. S 2007, 14, 291-313. Cheng, D. H.; Chen, X. W.; Shu, Y.; Wang, J. H. Talanta 2008, 75, 1270-1278. Ciemniak, A. ywno. Nauka. Technologia. Jako 2007, 3, 54-61. Clement, M.; Arzel, S.; Le Bot, B.; Seux, R.; Millet, M. Chemosphere 2000, 40, 49-56. Curylo, J.; Wardencki, W.; Namienik, J. Pol. J. Environ. Stud. 2007, 16, 5-16. Dbrowska, H.; Dbrowski, L.; Biziuk, M.; Gaca, J.; Namienik, J. J. Chromatogr. A 2003, 1003, 29­ 42. Deng, C.; Yao, N.; Wang, B.; Zhang, X. J. Chromatogr. A 2006, 1103, 15-21. Dziadek, K.; Waclawek, W. Chemia, Dydaktyka, Ekologia i Metrologia 2005, 10, 33-37. Eskilsson, C. S.; Bjorklund, E. J. Chromatogr. A 2000, 902, 227­250. Fernandes, J. O.; Soares, C. J. Chromatogr. A 2007, 1175, 1­6, 2007 Ge, L.; Wang, X. T.; Tan, S. N.; Tsai, H. H.; Yong, J. W. H.; Hu, L. Talanta 2010, 81, 1861­1864. González, E. J.; González, B.; Calvar, N.; Domínguez, A. Fluid Phase Equilibria 2010, 295, 249­254. Guan, W.; Wang, Y.; Xu, F.; Guan, Y. J. Chromatogr. A 2008, 1177, 28-35. Guiochon, G. A.; Beaver, L. A. Anal. Chim. Acta 2004, 523, 1-14. Hennion, M.-C. J. Chromatogr. A 1999, 856, 3­54. Hu, Y.; Zheng, Y.; Zhu, F.; Li, G. J. Chromatogr. A 2007, 1148, 16-22. Huie, C. W. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 373, 23­30. Jeannot, M. A.; Cantwell, F. F. Anal. Chem. 1997, 69, 235-239. Jonsson, S.; Hagberg, J.; Bavel B. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 4962­4967. Karasova, G.; Brandsteterova, A.; Lachova, M. Czech J. Food Sci. 2003, 21, 219­234. Kawaguchi, M.; Takahashi, S.; Seshimo, F.; Sakui, N.; Okanouchi, N.; Ito, R.; Inoue, K.; Yoshimura, Y.; Izumi, S.; Makino, T.; Nakazawa, H. J. Chromatogr. A 2004, 1046, 83­88. Klein, D. R.; Flannelly, D.F.; Schultz, M. M. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 1742-1747. Kloskowski, A.; Pilarczyk, M.; Namienik J. Anal. Chem. 2009, 81, 7363-7367. 121

34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64.

Koning, S.; Janssen, H. G.; Brinkman, U. A. Th. Chromatographia 2009, 69, Suplement 1, 33-78. Kosikowska, M.; Biziuk, M. Ecol. Chem. Eng. S 2009, 16, 207-220. Kot, A.; Namienik, J. Trends Anal. Chem. 2000, 19, 69-79. Kotowski, W. Ecol. Chem. Eng. S 2008, 15, 43-60. Liang, P.; Liu, R.; Cao J. Microchim. Acta 2008, 160, 135-139. Liu, H.; Dasputa P. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1817. Lopez, P.; Sanchez, C.; Batlle, R.; Nerian, C. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4348-4356. Luque de Castro, M. D.; Priego-Capote, F. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2383­2389. Maltez, H. F.; Borges, D. L. G.; Carasek, E.; Welz, B.; Curtius, A. J. Talanta 2008, 74, 800­805. Nováková, L.; Vlcková, H. Anal. Chim. Acta 2009, 656, 8-35. Onuska, F. I.; Terry, K.A. Chromatographia 1993, 36, 191-194. Poole, C. F.; Poole, S. K. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2268-2286. Prieto, A.; Basauri, O.; Rodin, R.; Usobiaga, A.; Fernández, L. A.; Etxebarria, N.; Zuloaga, O. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2642­2666. Przyjazny, A.; Kokosa, J. M. J. Chromatogr. A 2002, 977, 143­153. Raynie, D. E. Anal. Chem. 2006, 78, 3997-4003. See, H. H.; Sanagi, M. M.; Ibrahim, W.; Naim, A. A. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 1767-1772. Shariati-Feizabadi, S.; Yamini, Y.; Bahramifar, N. Anal. Chim. Acta 2003, 489, 21­31. Smith, R. M. J. Chromatogr. A 2003, 1000, 3-27. Souza Pinheiro, A.; Andrade, J. B. Talanta 2009, 79, 1354­1359. Wardencki, W.; Curylo, J.; Namienik, J. J. Biochem. Biophys. Methods 2007, 70, 275­288. Waterman, D.; Horsfield, B.; Leistner, F.; Hall, K.; Smith, S. Anal. Chem. 2000, 72, 3563-3567. Wei, G-T.; Yang, Z.; Chen, C-J. Anal. Chim. Acta 2003, 488, 183­192. Xu, H.; Pan, W.; Song, D.; Yang, G. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 9351-9356. Yang, T-J.; Tsai, F-J.; Chen, C-Y.; Yang, T. C-C.; Lee, M-R. Anal. Chim. Acta 2010, 668, 188­194. Zougagh, M.; Valcarcel, M.; Rios, A. Trends Anal. Chem. 2004, 23, 399 ­ 405. US EPA Method 3546. US EPA Method 3545A. Dmochowski, D.; Prdecka, A.; Dmochowska, A. Zeszyty Naukowe SGSP 2008, 37, 49-61, http://www.zn.sgsp.edu.pl/37/zn_nr_37.pdf Luliski, P.; Cielak, A.; Maciejewska, D. Biul. Wydz. Farm. WUM 2008, 1, 1-11, http://biuletynfarmacji.wum.edu.pl/ Namienik, J. Materialy z Konferencji Zielona Chemia Analityczna, lesin, 11-13.05.2009, http://www.sge.com.pl/sympozja/pdfy/slesin2009_namiesnik.pdf wietlik, R; Trojanowska, M. Monitoring rodowiska Przyrodniczego 2008, 9, 29-36, http://www.ujk.edu.pl/ios/wydawnictwa/z9/Ryszard%20Swietlik.pdf

122

III. Techniki chromatograficzne

1. Wprowadzenie do chromatografii

1.1. Wstp Chromatografia jest jedn z glównych technik separacyjnych stosowanych przede wszystkim w analityce zwizków chemicznych. Umoliwia ona wykrywanie badanej substancji i oznaczanie jej iloci w próbkach o zloonym skladzie. Próbki mog by gazowe, ciekle lub stale, za sam proces chromatograficzny moe by prowadzony albo przy uyciu kosztownej aparatury, albo powszechnie dostpnego sprztu laboratoryjnego. Chromatografia jest zarówno metod analityczn jak i metod preparatywn sluc do izolacji czystych substancji. Jest obecnie najbardziej rozpowszechnion i jednoczenie wszechstronn technik separacyjn, dostpn nie tylko w nowoczesnych laboratoriach. Stosuje si j powszechnie w przemyle chemicznym, farmaceutycznym, kosmetycznym, spoywczym a take w slubie zdrowia, ochronie rodowiska, rolnictwie i innych galziach przemyslu i gospodarki. Chromatografia narodzila si na pocztku XX wieku w wyniku prac rosyjskiego botanika, Michaila Semenowicza Cwieta (1872-1919), którego wspólczenie uwaa si za jej twórc. Cwiet, pracujc nota bene na Uniwersytecie Warszawskim i zajmujc si badaniem barwników rolinnych podjl prób rozdzielenia ich na kolumnie wypelnionej adsorbentem. Kolorowe pasma barwników, uzyskane na kolumnie w czasie rozdzielania daly pocztek nazwie chromatografia (z greckiego: chromatos = barwa oraz grapho = pisze), std aparat do rozdzielania na kolumnie zostal nazwany chromatografem. Prace Cwieta zostaly docenione dopiero w polowie XX wieku wraz z rozwojem bada nad fizykochemi powierzchni i zjawisk midzyfazowego podzialu, które zapocztkowaly intensywny rozwój chromatografii. Obecnie chromatografia jest stosowana do separacji wszystkich (nie tylko barwnych) rodzajów zwizków chemicznych. Chromatografia jest oparta na systemie dwóch niemieszajcych si faz: fazy stacjonarnej (nieruchomej) oraz fazy ruchomej, która porusza si wzdlu fazy stacjonarnej. Próbka jest wprowadzana do kolumny w postaci wskiego pasma, co znaczy, e ma niewielk objto (rysunek 1). Skladniki próbki s separowane dziki temu, i w róny sposób dziel si pomidzy obie fazy i tym samym przemieszczane s przez faz ruchom z rón prdkoci. Kinetyczny ruch czsteczek powoduje cigl wymian skladników próbki pomidzy obydwoma fazami. Jednoczenie faza ruchoma porusza si wzdlu fazy stacjonarnej i czsteczki, które s w danym momencie rozpuszczone w fazie ruchomej poruszaj si wraz z ni. Natomiast te czsteczki, które s w danym momencie zatrzymane przez faz stacjonarn, nie przemieszczaj si wzdlu kolumny. Skladniki próbki, które wykazuj wiksze powinowactwo do fazy ruchomej poruszaj si znacznie szybciej ni skladniki, które wykazuj wiksze powinowactwo do fazy stacjonarnej, i tym samym te pierwsze wczeniej opuszczaj uklad chromatograficzny. Tak wic separacja skladników próbki jest spowodowana rónymi szybkociami migracji poszczególnych skladników próbki w ukladzie chromatograficznym. Proces chromatograficzny mona prowadzi w kolumnach chromatograficznych (rysunek 1) bd technik planarn (rysunek 2). Najprostsza chromatografia kolumnowa wymaga jedynie szklanej rurki (kolumny) zakoczonej zaworem. Szklana kolumna jest wypelniona faz stacjonarn, przez któr przeplywa faza ruchoma. Badan mieszanin (próbk) wprowadza si na pocztek (czolo) zloa fazy stacjonarnej, a nastpnie przepuszcza si faz ruchom przez kolumn. W tym czasie skladniki próbki 123

ulegaj separacji i kolejno opuszczaj kolumn, czyli ulegaj elucji z kolumny (s eluowane, eluuj si z kolumny).

Faza ruchoma wprowadzana do kolumny w sposób cigly Próbka wprowadzona do kolumny

Faza stacjonarna

Zwizki rozdzielane w kolumnie

Czas

Rysunek 1. Chromatografia kolumnowa Technika planarna polega na wykonaniu procesu chromatograficznego na bibule lub na cienkich warstwach fazy stacjonarnej osadzonych na podlou z plytek szklanych, folii aluminiowej lub polimerach (chromatografia cienkowarstwowa) (rysunek 2). Glówn rónic pomidzy chromatografi kolumnow a chromatografi cienkowarstwow jest ksztalt fazy stacjonarnej, czyli ksztalt zloa chromatograficznego. W chromatografii cienkowarstwowej faza ruchoma porusza si w gór plytki chromatograficznej dziki dzialaniu sil kapilarnych.

Faza stacjonarna Czolo fazy ruchomej Rozdzielone zwizki Faza ruchoma

Linia startu

Rysunek 2. Chromatografia cienkowarstwowa, plytka przygotowana do rozdzielania z naniesionymi plamkami badanych próbek (po lewej), plytka po wykonaniu rozdzielania (po prawej)

124

1.2. Podstawowe definicje chromatograficzne Intensywny rozwój chromatografii spowodowal powstanie wielu terminów i poj zwizanych z t technik separacyjn. Ich znajomo jest niezbdna do prawidlowego zrozumienia tej dziedziny wiedzy. Midzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) opublikowala nomenklatur chromatograficzn w jzyku angielskim w 1993 roku. Nomenklatura ta zostala przetlumaczona na jzyk polski i wydana przez Polskie Towarzystwo Chemiczne w 1996 roku. W niniejszym rozdziale zostan przedstawione podstawowe pojcia i definicje wybrane z nomenklatury chromatograficznej. Chromatografia jest fizyczn metod rozdzielania, w której skladniki rozdzielane ulegaj podzialowi pomidzy dwie niemieszajce si fazy; jedna z nich jest nieruchoma (faza stacjonarna), a druga (faza ruchoma) porusza si w okrelonym kierunku. Faza stacjonarna ­ jedna z dwóch faz tworzcych uklad chromatograficzny, okrelana te terminem zloe chromatograficzne. Faza stacjonarna moe by stala lub ciekla. Jeeli faza stacjonarna jest ciecz to moe by albo zwizana chemicznie z cialem stalym (nonikiem) albo unieruchomiona na nim fizycznie. Faza ruchoma ­ plyn (gaz lub ciecz), który przemieszcza si przez nieruchom faz stacjonarn albo wzdlu niej w okrelonym kierunku. W chromatografii gazowej stosujemy termin gaz nony natomiast w chromatografii cieczowej stosujemy termin eluent dla okrelenia fazy ruchomej. Wyróniamy eluent (faza ruchoma wprowadzana do kolumny) oraz eluat (faza ruchoma, wraz z rozpuszczonymi w niej skladnikami próbki, opuszczajca kolumn), a proces przemieszczania si eluentu przez kolumn i opuszczania kolumny przez eluat nazywa si elucj. Chromatografia elucyjna ­ technika, w której faza ruchoma przemieszcza si cigle przez zloe chromatograficzne natomiast próbka jest wprowadzona do ukladu w jednej porcji. Strefa (pasmo) ­ objto zloa chromatograficznego, w której znajduje si jeden lub wicej skladników próbki. Chromatogram (gazowy, cieczowy) jest to wykres przedstawiajcy zmiany stenia analitu w fazie ruchomej opuszczajcej kolumn w zalenoci od czasu lub objtoci fazy ruchomej. Chromatograf jest to przyrzd lub zestaw przyrzdów slucy do wykonywania rozdzielania chromatograficznego. Najwaniejsze czci chromatografu to dozownik, kolumna chromatograficzna oraz detektor. Dozownik ­ urzdzenie za pomoc, którego wprowadzamy próbk do fazy ruchomej przed zloem chromatograficznym lub na to zloe. Detektor ­ urzdzenie, które okrela zmiany w skladzie fazy ruchomej przeplywajcej przez niego poprzez pomiar jej wlaciwoci fizycznych lub chemicznych. Innymi slowy jest to urzdzenie, które monitoruje sklad wyplywajcego z kolumny eluatu w sposób cigly, a zapis wskaza detektora w czasie rozdzielania to chromatogram. Kolumna ­ rurka ze znajdujc si w niej faz stacjonarn, przez któr przeplywa faza ruchoma. Kolumna pakowana ­ rurka zawierajca zloe chromatograficzne w calej objtoci. Kolumna otwarta ­ kolumna o malej rednicy, w której faza stacjonarna jest naniesiona w postaci warstwy na wewntrzn cian rurki a faza ruchoma przeplywa w sposób swobodny. Stosuje si te pojcia: kolumna o przekroju otwartym bd kolumna kapilarna. 125

Chromatografia w odwróconym ukladzie faz ­ rodzaj chromatografii cieczowej, w której faza ruchoma jest znacznie bardziej polarna ni faza stacjonarna. Chromatografia w normalnym ukladzie faz ­ rodzaj chromatografii cieczowej, w której faza ruchoma jest mniej polarna ni faza stacjonarna. Elucja izokratyczna ­ proces rozdzielania chromatograficznego z wykorzystaniem fazy ruchomej o niezmiennym skladzie jakociowym i ilociowym. Elucja gradientowa - proces rozdzielania chromatograficznego z wykorzystaniem fazy ruchomej o zmieniajcym si, w sposób cigly lub stopniowo, skladzie jakociowym lub/i ilociowym. Techniki chromatograficzne dzieli si wedlug nastpujcych kryteriów: stanu skupienia fazy ruchomej, mechanizmu rozdzielania, sposobu prowadzenia procesu chromatograficznego (ksztalt zloa chromatograficznego, skala procesu). Ze wzgldu na stan skupienia fazy ruchomej wyróniamy nastpujce rodzaje chromatografii: · chromatografia gazowa (GC) ­ technika rozdzielania, gdzie faz ruchom jest gaz; w chromatografii gazowej zawsze stosujemy kolumny chromatograficzne, · chromatografia cieczowa (LC) ­ technika rozdzielania, gdzie faz ruchom jest ciecz; w chromatografii cieczowej rozdzielania chromatograficzne mona prowadzi w kolumnach bd technik planarn, wyrónia si równie wysokosprawn chromatografi cieczow (HPLC) a take ultrasprawn chromatografi cieczow (UPLC), · chromatografia z faz ruchom w stanie nadkrytycznym (SFC) ­ technika rozdzielania, w której faza ruchoma jest plynem powyej jego krytycznej temperatury i krytycznego cinienia; stosuje si równie terminy: chromatografia fluidalna czy chromatografia nadkrytyczna. Ze wzgldu na mechanizm rozdzielania wyróniamy nastpujce rodzaje chromatografii: · chromatografia adsorpcyjna ­ rozdzielanie jest wynikiem rónic pomidzy skladnikami próbki w zdolnoci do adsorbowania si na powierzchni ciala stalego (adsorbentu), · chromatografia podzialowa ­ rozdzielanie jest wynikiem rónej rozpuszczalnoci skladników próbki w fazie stacjonarnej (w przypadku chromatografii gazowej) lub rónej rozpuszczalnoci skladników w fazie stacjonarnej i ruchomej (w przypadku chromatografii cieczowej), · chromatografia jonowa (jonowymienna) ­ technika, w której rozdzielanie jest wynikiem rónej zdolnoci skladników próbki do ulegania wymianie jonowej, · chromatografia wykluczania ­ technika, w której o rozdziale skladników próbki decyduj rónice w wielkociach czsteczek i/lub w ich ksztalcie; w przeszloci stosowane byly równie nazwy: chromatografia elowa, sczenie molekularne, chromatografia sitowa, · chromatografia powinowactwa - technika, w której rozdzielanie jest wynikiem biologicznej specyficznoci oddzialywa midzy dwiema substancjami ­ oznaczanym skladnikiem próbki i reaktywnym chemicznie ligandem zwizanym z powierzchni nonika, ten rodzaj chromatografii jest stosowany do izolacji i oczyszczania bialek oraz kwasów nukleinowych. Ze wzgldu na sposób prowadzenia procesu chromatograficznego wyrónia si nastpujce rodzaje chromatografii: · chromatografia kolumnowa ­ technika rozdzielania, w której faza stacjonarna znajduje si w rurce (kolumnie), czstki stalej fazy stacjonarnej albo nonika pokrytego ciekl faz 126 · · ·

·

·

stacjonarn wypelniaj cal objto rurki (kolumna pakowana) lub s osadzone na wewntrznych ciankach rurki (kolumna otwarta, czyli kolumna ze swobodnym przeplywem fazy ruchomej), chromatografia planarna ­ technika rozdzielania, w której faza stacjonarna jest plask warstw; rozrónia si tu chromatografi bibulow oraz chromatografi cienkowarstwow (TLC), gdzie faza stacjonarna jest naniesiona w postaci warstwy na plytk, chromatografia analityczna i preparatywna ­ techniki rozróniane ze wzgldu na skal procesu; obie chromatografie: kolumnowa i planarna mog by prowadzone w skali analitycznej i preparatywnej.

1.3. Chromatogram W kadej technice chromatograficznej na pocztku rozdziela si badan próbk a nastpnie przeprowadza si detekcj poszczególnych skladników. Wynik procesu chromatograficznego zapisuje si w postaci chromatogramu przedstawiajcego wykres wskaza sygnalu uzyskanego w detektorze (odpowiadajcego zmianom stenia substancji w fazie ruchomej opuszczajcej kolumn i przechodzcej przez detektor) w funkcji czasu lub (rzadko) w funkcji objtoci fazy ruchomej (rysunek 3 i 4). Na osi X chromatogramu mierzymy czas natomiast na osi Y ­ wielko (wysoko lub powierzchnia) pików .

Maksimum piku

Pik h

Linia podstawowa

Podstawa piku Czas Czas

Rysunek 3. Pik chromatograficzny Zapis stenia pojedynczej substancji w fazie ruchomej w funkcji czasu ma posta krzywej Gaussa i nosi nazw piku (ang. peak - szczyt) (rysunek 3). Inaczej mówic jest to cz chromatogramu ilustrujca sygnal detektora w czasie, gdy kolumn opuszcza skladnik próbki. Wysoko piku (h) ­ jest to odleglo pomidzy podstaw piku a maksimum piku (rys. 4). Wysoko piku mierzy si do linii podstawowej piku a nie do osi X chromatogramu. Wielko piku, w tym i wysoko, jest proporcjonalna do iloci rozdzielanej substancji a wic moe sluy do analizy

127

ilociowej. Jednake, bardziej rozpowszechnione w analizie ilociowej, bo dokladniejsze, jest korzystanie z pola powierzchni piku. Linia podstawowa (linia zerowa) ­ jest to cz chromatogramu ilustrujca sygnal detektora w czasie, gdy z kolumny wyplywa jedynie faza ruchoma. Podstawa piku ­ jest wyznaczana poprzez interpolacj linii podstawowej chromatogramu pomidzy kocami piku. Chromatogram przedstawiony na rysunku 4 zawiera pik substancji niezatrzymywanej na fazie stacjonarnej. Na rysunku przedstawiono te podstawowe parametry retencyjne chromatografowanych substancji.

t'R Wysoko piku Pik badanej substancji tM

Pocztek analizy

Pik substancji niezatrzymywanej na fazie stacjonarnej Linia podstawowa

Czas

Rysunek 4. Chromatogram elucyjny oraz podstawowe parametry retencyjne: czas retencji substancji niezatrzymywanej tM, calkowity czas retencji tR oraz zredukowany czas retencji t'R badanej substancji Chromatogram dostarcza wielu cennych informacji, w tym dwie najwaniejsze: · o skladzie jakociowym rozdzielanej próbki (poloenie piku substancji na

chromatogramie, czyli czas retencji piku, pozwala na jej identyfikacj), · o skladzie ilociowym rozdzielanej próbki (wysoko i pole powierzchni piku substancji odpowiada jej steniu w próbce). W praktyce, nie zawsze w badanej próbce wystpuj substancje niezatrzymywane na fazie stacjonarnej, co powoduje, e wyznaczenie czasu retencji substancji niezatrzymywanej nie jest spraw prost. W chromatografii gazowej tak substancj bylby hel. 128

1.4. Podstawowe parametry retencyjne Retencja (lac. retentio ­ powstrzymywanie) w chromatografii charakteryzuje czas przebywania substancji w kolumnie chromatograficznej. Skladniki próbki mog wdrowa przez kolumn chromatograficzn wolniej ni faza ruchoma - to zjawisko nazywa si retencj. Na chromatogramie mona okreli parametry retencyjne rozdzielanej substancji. Parametry retencji opisuj zachowanie si rozdzielanych skladników mieszaniny. Parametry retencji wyznacza si poprzez pomiar odlegloci na chromatogramie, zapisywanym przez rejestrator na papierze z okrelon prdkoci i przeliczeniu na czas lub odczytuje bezporednio z wydruku chromatogramu, zapisanego przez odpowiednie urzdzenie (np. komputer). Sposób pomiaru jest przedstawiony na rysunku 5.Najczciej stosowane w chromatografii parametry retencyjne to: · czas retencji substancji niezatrzymywanej tM - czas liczony od momentu wprowadzenia do kolumny (od pocztku analizy) substancji niezatrzymywanej przez faz stacjonarn do momentu pojawienia si na chromatogramie maksimum piku; odpowiada czasowi, w którym faza ruchoma migruje przez kolumn chromatograficzn oraz przez dozownik, detektor i lczniki; poprzednio nazywany równie czasem martwym lub czasem zerowym, objto retencji substancji niezatrzymywanej VM - objto fazy ruchomej, która jest potrzebna do elucji substancji niezatrzymywanej przez faz stacjonarn; poprzednio nazywana objtoci martw lub zerow; objto retencji substancji niezatrzymywanej jest oczywicie proporcjonalna do czasu retencji substancji niezatrzymywanej:

VM = t M Fc

·

(1)

gdzie: Fc - natenie przeplywu fazy ruchomej (objtociowa prdko przeplywu fazy ruchomej) w temperaturze kolumny, · calkowity czas retencji tR - czas liczony od momentu wprowadzenia badanej substancji do kolumny (od pocztku analizy) do momentu pojawienia si na chromatogramie maksimum piku, czyli momentu maksymalnego stenia substancji na wyjciu z kolumny, calkowita objto retencji VR - objto fazy ruchomej, która jest potrzebna do elucji badanej substancji mierzona od momentu wprowadzenia substancji do kolumny do momentu pojawienia si na chromatogramie maksimum piku; calkowita objto retencji jest proporcjonalna do calkowitego czasu retencji:

VR = t R Fc

·

(2)

·

zredukowany czas retencji t'R ­ rónica pomidzy calkowitym czasem retencji badanej substancji i czasem retencji substancji niezatrzymywanej: (3) Zredukowany czas retencji charakteryzuje retencj substancji na fazie stacjonarnej i jest charakterystyczny dla danej substancji a wic moe sluy do jej identyfikacji, zredukowana objto retencji V'R ­ rónica pomidzy calkowit objtoci retencji badanej substancji i objtoci retencji substancji niezatrzymywanej: 129

t 'R = t R - t M

· ·

V ' R = VR - V M ·

(4)

wspólczynnik retencji k ­ miara czasu, w jakim substancja przebywa w fazie stacjonarnej, w stosunku do czasu, w którym przebywa ona w fazie ruchomej; okrela, ile razy dluej substancja jest zatrzymywana przez faz stacjonarn ni potrzebowalaby na przejcie przez kolumn z szybkoci fazy ruchomej. Wspólczynnik retencji oblicza si z nastpujcego wzoru: k= t'R tM (5)

Wspólczynnik retencji jest to jednoczenie stosunek iloci substancji w fazie stacjonarnej do iloci tej substancji w fazie ruchomej w stanie równowagi. 1.5. Podstawy teoretyczne procesu chromatograficznego Pomidzy czsteczkami próbki a czsteczkami fazy stacjonarnej i fazy ruchomej zachodz oddzialywania midzyczsteczkowe, które róni si midzy sob, w zalenoci od charakteru zwizków oddzialujcych (por roz. I.2.3) i od miejsca wystpowania ­ na powierzchni graniczcych ze sob faz, np. podczas adsorpcji lub w calej objtoci faz ukladu, jak w przypadku podzialu (por.roz. I. 2.2.). Oddzialywania midzyczsteczkowe powoduj, e skladniki mieszaniny s w rónym stopniu zatrzymywane przez faz stacjonarn. Oczywicie silniejsze oddzialywanie z faz stacjonarn powoduje wiksz retencj danego skladnika próbki i tym samym póniejsze opuszczenie ukladu (np. kolumny chromatograficznej). Oddzialywania midzyczsteczkowe mog zachodzi tylko midzy skladnikami próbki a faz stacjonarn, jak w przypadku chromatografii gazowej, gdzie gaz nony nie oddzialuje ze skladnikami próbki natomiast w chromatografii cieczowej zachodz oddzialywania midzyczsteczkowe pomidzy wszystkimi elementami ukladu ­ faz stacjonarn, faz ruchom (rozpuszczalnikiem) i skladnikami próbki (rysunek 6). Tym samym w chromatografii gazowej jedynie faza stacjonarna wplywa na retencj a w przypadku chromatografii cieczowej, na retencj skladników próbki wplywa zarówno faza stacjonarna jak i faza ruchoma. Skladniki mieszaniny wprowadzanej do kolumny chromatograficznej migruj poprzez kolumn z rón prdkoci a tym samym opuszczaj j w rónym czasie. Zatrzymywanie skladników próbki na powierzchni fazy stacjonarnej jest spowodowane rónorodnymi zjawiskami, takimi jak:

· · · · · ·

adsorpcja, podzial, oddzialywania jonowe, oddzialywania jonowo-asocjacyjne, efekty zwizane z rozmiarami czsteczek (wykluczanie), powinowactwo biologiczne.

130

Chromatografia gazowa

Chromatografia cieczowa

Faza stacjonarna

Oddzialywania analit : faza stacjonarna

Faza stacjonarna

Oddzialywania midzy fazami

Faza ruchoma

Analit

Rysunek 6. Oddzialywania midzyczsteczkowe w chromatografii gazowej oraz w chromatografii cieczowej Oddzialywania midzyczsteczkowe, które bior udzial w procesie chromatograficznym s efektem wystpowania sil midzyczsteczkowych, takich jak:

· · ·

sily dyspersyjne, polarne (oddzialywania dipol-dipol, oddzialywania -, wizania wodorowe), jonowe.

Proces chromatograficzny moe by prowadzony trzema technikami: technik elucyjn, jako analiza czolowa oraz jako rozwijanie przez rugowanie. Wspólczenie, wikszo rozdziele chromatograficznych jest wykonywana technik elucyjn; pozostale techniki s stosowane bardzo rzadko. W technice elucyjnej nastpuje seria procesów adsorpcji-desorbcji chromatografowanego zwizku zachodzcych pomidzy dwiema fazami: stacjonarn i ruchom. Istot procesu oddaje rysunek 7. Profile ste zwizku w obu fazach odpowiadaj krzywym Gaussa. Poruszajca si faza ruchoma przesuwa profil stenia zwizku w fazie ruchomej do przodu w porównaniu z faz stacjonarn. To powoduje, e stenie zwizku w fazie ruchomej w czci frontowej piku przekracza stan równowagi i nastpuje przejcie czci masy zwizku z fazy ruchomej do fazy stacjonarnej. Odwrotny proces nastpuje w tylnej czci piku. Pasmo zwizku porusza si wzdlu kolumny chromatograficznej w rezultacie transferu zwizku z fazy ruchomej do stacjonarnej we frontowej polowie piku przy jednoczesnym transferze zwizku z fazy stacjonarnej do ruchomej w czci tylnej piku.

131

Rysunek 7. Proces elucji zwizku w chromatografii [na podstawie Chromatography theory. Cazes J., Scott R.P.W., 2002] Istniej dwie fundamentalne teorie chromatograficzne: teoria pólek oraz teoria kinetyczna. Teoria pólek opisuje czynniki, które kontroluj retencj chromatograficzn oraz pozwala na obliczenie objtoci retencji. Teoria kinetyczna opisuje zjawisko rozmycia pasma chromatograficznego. 1.5.1. Teoria pólek W chromatografii podzialowej rozdzielanie skladników próbki jest wynikiem ich rónej rozpuszczalnoci w fazach chromatograficznych. Dla zobrazowania procesu podzialu przyjmuje si, e kolumna chromatograficzna sklada si z wielkiej iloci polczonych ze sob sekcji, czyli tzw. pólek teoretycznych (rysunek 8). Termin ten zostal zaczerpnity z teorii destylacji i ma wymiar calkowicie teoretyczny. Pod pojciem pólki teoretycznej rozumiemy tak objto kolumny, w której zostaje osignity stan (dynamicznej) równowagi pomidzy steniem zwizku w fazie stacjonarnej, a jego steniem w fazie ruchomej.

Pólka teoretyczna

Kolumna chromatograficzna

Rysunek 8. Ilustracja pólki teoretycznej kolumny chromatograficznej

Tak jak to opisano wczeniej, rozklad czsteczek analitu pomidzy dwie niemieszajce si fazy charakteryzuje stala podzialu K opisana równaniem Nernsta (por. roz. I.2.2 równanie 26) 132

Kiedy substancja jest wprowadzona do kolumny chromatograficznej natychmiast dzieli si pomidzy faz stacjonarn a faz ruchom w ,,pierwszej pólce" zgodnie z wartoci stalej podzialu. Rozpuszczone w fazie ruchomej czsteczki substancji poruszaj si wraz z ni, a napotykaj faz stacjonarn w ,,drugiej pólce". Ponownie dziel si pomidzy obie fazy zgodnie z wartoci stalej podzialu. Jednoczenie stenie substancji w fazie ruchomej w ,,pierwszej pólce" ulega zmniejszeniu, a wic cz czsteczek przechodzi z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej, aby stosunek ste odpowiadal wartoci stalej podzialu. W krótkim czasie wszystkie czsteczki substancji przechodz z ,,pierwszej pólki" do nastpnej. Faza ruchoma porusza si poprzez kolejne pólki i w kadej z nich ustala si lokalna równowaga opisana prawem Nernsta. Proces trwa dopóki wszystkie czsteczki substancji nie opuszcz kolumny chromatograficznej.

K=1

K = 1/2

Rysunek 9. Mechanizm procesu chromatograficznego na przykladzie chromatografii gazowej na kolumnie o przekroju otwartym; rozdzielane substancje charakteryzuj si zrónicowanymi stalymi podzialu K Gdy do kolumny chromatograficznej wprowadzona jest mieszanina dwóch lub wicej substancji, charakteryzujcych si rónymi stalymi podzialu, substancje, których stala podzialu jest mniejsza od jednoci (K < 1) migruj znacznie szybciej przez kolumn ni te, których K > 1. W rezultacie, substancje o niszej wartoci stalej podzialu ulegaj rozdzieleniu od substancji o jej wyszej wartoci (rysunek 9). Teoria pólek wprowadza fundamentalne równanie chromatografii lczce calkowit objto retencji substancji VR ze stal podzialu K:

VR = Vm + KVs + VE

gdzie:

(6)

VR ­ objto retencji substancji, K ­ stala podzialu, Vm ­ objto fazy ruchomej, Vs ­ objto fazy stacjonarnej, VE ­ objto pozakolumnowa (objto dozownika, lczników itp.); dla VE << Vm, warto VE pomija si. Objto retencji substancji niezatrzymywanej na kolumnie VM w praktyce jest sum objtoci fazy ruchomej Vm oraz objtoci pozakolumnowej VE:

133

VM = Vm + VE

gdzie: VM ­ objto retencji substancji niezatrzymywanej na kolumnie, Vm ­ objto fazy ruchomej, VE ­ objto pozakolumnowa. Czas retencji tR jest proporcjonalny do objtoci retencji:

VR = t R VC

(7)

(8)

gdzie: VR ­ objto retencji substancji, tR ­ czas retencji substancji, Fc ­ natenie przeplywu fazy ruchomej. Z równania wywodzcego si z teorii pólek wynikaj praktyczne wnioski:

· ·

im wiksza warto stalej podzialu K, tym wikszy czas retencji tR danego zwizku, wzrost objtoci fazy stacjonarnej Vs powoduje wzrost czasu retencji tR danego zwizku, czyli czas retencji zaley równie od wymiarów kolumny.

Dla dwóch rónych zwizków chemicznych A i B:

VR ( A) = Vm + K ( A)Vs + VE VR ( B ) = Vm + K ( B )Vs + VE

(9) (10)

Dwa róne skladniki mieszaniny zostaj rozdzielone, jeli róni si objtoci retencji a tym samym róni si stal podzialu:

VR ( A) VR ( B ) K ( A) K ( B )

Wspólczynnik retencji k jest definiowany jako stosunek liczby moli substancji w fazie stacjonarnej do liczby moli substancji w fazie ruchomej:

k=

gdzie:

ns cV = s s nm cmVm

(11)

k ­ wspólczynnik retencji, ns ­ liczba moli substancji w fazie stacjonarnej, nm ­ liczba moli substancji w fazie ruchomej. Wspólczynnik retencji k jest zaleny od stalej podzialu K:

134

k=K

Vs Vm

(12)

1.5.2. Teoria kinetyczna Teoria kinetyczna jest drug fundamentaln teori chromatograficzn. Opisuje przyczyny poszerzenia pasma chromatograficznego. Obszar w zlou chromatograficznym, w którym znajduje si substancja rozdzielana (pasmo) stale poszerza si w czasie, kiedy substancja migruje poprzez zloe chromatograficzne. Poszerzanie si pasma chromatograficznego jest wynikiem zachodzcych w kolumnie procesów kinetycznych i termodynamicznych. Efektem tego, widocznym na chromatogramie, moe by szeroki pik substancji.

Rys. 10. Porównanie chromatogramów mieszaniny substancji A i B otrzymanych na kolumnie o niskiej sprawnoci (a) oraz o duej sprawnoci (b) Na rysunku 10 przedstawiono dwa przyklady rozdzielania chromatograficznego mieszaniny dwóch substancji A i B, rónicych si czasami retencji. Poszczególne skladniki mieszaniny s rozdzielone jedynie wtedy, jeeli profil stenia (pik) kadego z nich jest dostatecznie wski, aby piki nie lczyly si ze sob. Sprawno kolumn chromatograficznych decyduje o tym, czy uzyskane piki s wskie czy szerokie. Sprawno kolumn zaley od liczby pólek teoretycznych (N) w danej kolumnie. Im wicej pólek teoretycznych, tym kolumna jest sprawniejsza i uzyskane piki rozdzielanych substancji s wsze. Liczba pólek teoretycznych zaley od dlugoci kolumny L oraz od wysokoci pojedynczej pólki H:

N =

gdzie:

L H

(13)

N ­ liczba pólek teoretycznych, L ­ dlugo kolumny, H ­ wysoko równowana pólce teoretycznej, inaczej oznaczana WRPT. 135

Im wiksza jest wysoko pólki teoretycznej, tym mniej pólek teoretycznych znajduje si w danej kolumnie i tym mniej sprawna jest kolumna, co powoduje, e uzyskane piki rozdzielanych substancji s szersze.

Wysoko pólki teoretycznej zaley od warunków eksperymentalnych w danym ukladzie chromatograficznym, midzy innymi od liniowej prdkoci przeplywu fazy ruchomej przez kolumn. Dla danego ukladu chromatograficznego istnieje optymalna liniowa prdko przeplywu fazy ruchomej, przy której uzyskuje si najmniejsz wysoko pólki teoretycznej, a wic najwiksz sprawno kolumny. W praktyce liniow prdko przeplywu fazy ruchomej oblicza si poprzez podzielenie dlugoci kolumny L przez czas retencji substancji niezatrzymywanej tM:

u=

gdzie:

L tM

(14)

u ­ liniowa prdko przeplywu fazy ruchomej. Wzory opisujce zaleno wysokoci pólki teoretycznej od liniowej prdkoci przeplywu fazy ruchomej s bardzo podobne w chromatografii gazowej oraz w chromatografii cieczowej. W przypadku chromatografii gazowej stosujemy równanie van Deemtera natomiast w chromatografii cieczowej równanie Kennedy'ego i Knoxa. Wysoko pólki teoretycznej H opisana jest równaniem van Deemtera:

H = A+

gdzie:

B + C s u + Cm u u

(15)

A ­ dyfuzja wirowa, B ­ dyfuzja podluna w fazie ruchomej, Cs ­ opór przenoszenia masy zwizany z faz stacjonarn, Cm ­ opór przenoszenia masy zwizany z faz ruchom. W kolumnie wypelnionej faz stacjonarn czsteczki chromatografowanego zwizku poruszaj si rónymi drogami (rysunek 11), co powoduje, e ich czasy przebywania w kolumnie, a tym samym ich czasy retencji s róne. Zjawisko to nosi nazw dyfuzji wirowej i jest powodem rozmycia piku. Dyfuzja wirowa wystpuje w kolumnach pakowanych, w których czstki fazy stacjonarnej wypelniaj cal wewntrzn objto kolumny, a jej efekt, czyli rozmycie pików zaley od wymiarów czstek wypelnienia kolumny, ich ksztaltu, porowatoci i sposobu upakowania w kolumnie.

136

Rysunek 11. Mechanizm dyfuzji wirowej. Czerwone linie pokazuj róne drogi czsteczek w wypelnieniu kolumny [na podstawie Chromatography theory. Cazes J., Scott R.P.W., 2002] Dyfuzja podluna jest efektem przypadkowych ruchów czsteczek chromatografowanego zwizku w fazie ruchomej (rysunek 12), którym ulegaj w sposób naturalny w cieczy lub w gazie. Profil stenia zwizku w fazie ruchomej ma ksztalt krzywej Gaussa, poniewa proces dyfuzji jest przypadkowy.

Rysunek 12. Poszerzanie pasma chromatograficznego w kolumnie z powodu dyfuzji podlunej na podstawie [Chromatography theory. Jack Cazes, Raymond P. W. Scott, 2002] Parametry C w równaniu van Deemtera dotycz oporów przenoszenia masy. Parametr Cs dotyczy oporu przenoszenia masy zwizanego z faz stacjonarn. W trakcie migracji przez kolumn czsteczki zwizku chromatografowanego s przenoszone cigle z fazy ruchomej do stacjonarnej i odwrotnie. Proces ten nie jest blyskawiczny, ale wymaga okrelonego czasu, czego efektem jest poszerzanie si pasma chromatograficznego. Parametr Cm dotyczy oporu przenoszenia masy pomidzy ssiednimi strumieniami fazy ruchomej.

137

Równanie van Deemtera pokazuje jak wysoko pólki teoretycznej zaley od liniowej prdkoci przeplywu fazy ruchomej i jest równaniem hiperboli (rysunek 13a). Dla danego ukladu chromatograficznego istnieje optymalna prdko przeplywu fazy ruchomej, przy której uzyskuje si najmniejsz warto wysokoci pólki teoretycznej a wic najwiksz sprawno kolumny. Rysunek 13b ilustruje wplyw indywidualnych czynników (A, B/u, Csu, Cmu) na wysoko pólki teoretycznej i na wypadkow krzyw van Deemtera. Wartoci A, B i C s okrelone i stale dla okrelonej substancji chromatografowanej i okrelonych warunków chromatograficznych.

a)

b)

Rysunek 13. Krzywa van Deemtera. Zaleno wysokoci pólki teoretycznej od prdkoci przeplywu fazy ruchomej w chromatografii gazowej [na podstawie Instrumental Methods of Analysis. Willard et al., 1988] W przypadku chromatografii gazowej czynnik Cm jest maloznaczcy i mona go zaniedba. Równanie van Deemtera w chromatografii gazowej podaje si czsto w formie uproszczonej:

H = A+

gdzie:

B + Cu u

(16)

C ­ opór przenoszenia masy. Równanie Kennedy'ego i Knoxa opisujce zaleno wysokoci pólki teoretycznej od prdkoci przeplywu fazy ruchomej w chromatografii cieczowej:

138

H = Au 1/ 3 +

B + Cu u

(17)

Wysoko pólki teoretycznej H oraz prdko przeplywu fazy ruchomej u w chromatografii cieczowej mog by wyraone jako tzw. wartoci zredukowane: zredukowana wysoko pólki teoretycznej h oraz zredukowana prdko fazy ruchomej v. Wielkoci zredukowane s bezwymiarowe i umoliwiaj porównanie wlaciwoci rónych kolumn chromatograficznych w chromatografii cieczowej. Na sprawno kolumn w chromatografii cieczowej duy wplyw ma rednia rednica czstek dp wypelnienia kolumny, czyli fazy stacjonarnej. Zredukowana wysoko pólki teoretycznej w chromatografii cieczowej jest stosunkiem wysokoci pólki teoretycznej H do redniej rednicy czstek wypelnienia kolumny dp:

h=

gdzie:

H dp

(18)

h ­ zredukowana wysoko pólki teoretycznej, dp ­ rednia rednica czstek fazy stacjonarnej. Zredukowana prdko fazy ruchomej w chromatografii cieczowej:

v=

gdzie:

ud p DM

(19)

v ­ zredukowana liniowa prdko przeplywu fazy ruchomej, DM ­ wspólczynnik dyfuzji w fazie ruchomej. Wykorzystujc pojcia zredukowanej wysokoci pólki teoretycznej i zredukowanej prdkoci fazy ruchomej, równanie Knoxa mona przedstawi w nastpujcej formie:

h = Av 1 / 3 +

B + Cv v

(20)

Warto zredukowanej wysokoci pólki teoretycznej okrela liczb czstek wypelnienia kolumny tworzcych jedn pólk teoretyczn kolumny. W chromatografii cieczowej, kolumna ma dobr sprawno, gdy h ma warto w przedziale 2 ­ 3, jeeli warto h > 10 to kolumna jest le upakowana lub wypelnienie jest zlej jakoci. 1.6. Sprawno kolumn chromatograficznych Liczb pólek teoretycznych, czyli sprawno kolumny mona wyznaczy bezporednio z chromatogramu przy uyciu substancji testowej. Substancj testow moe by zwizek, dla którego wspólczynnik retencji k mieci si w granicach od 5 do 10. Pik substancji testowej powinien by symetryczny (rysunek 14). Liczb pólek teoretycznych w kolumnie wyznacza si z nastpujcych zalenoci:

t N = R

2

(21)

139

t N = 5,54 R W 1/ 2

lub

2

(22)

t N = 16 R W B

gdzie:

2

(23)

­ odchylenie standardowe krzywej Gaussa (szeroko piku na wysokoci równej

0,882 h), W1/2 ­ szeroko piku w polowie jego wysokoci, WB ­ szeroko piku przy podstawie. Wszystkie wielkoci mierzone s w jednostkach czasu i wyznaczane bezporednio z chromatogramu (rys. 14). Liczba pólek teoretycznych jest oczywicie wartoci bezwymiarow.

Rysunek 14. Wielkoci odczytywane z chromatogramu; wyznaczanie liczby pólek teoretycznych z piku chromatograficznego Efektywn liczb pólek teoretycznych w kolumnie wyznacza si z nastpujcych zaleznoci:

N ef

t - t = 5,54 R M W 1/ 2

lub

2

2

(24)

k N N ef = 1 + k

gdzie: Nef ­ efektywna liczba pólek teoretycznych,

(25)

Sprawno rozdzielenia jest wyraana take rozdzielczoci pików. Rozdzielczo pików okrela rozdzielenie dwóch pików z uwzgldnieniem ich rednich szerokoci na linii podstawy. Rozdzielczo pików liczy si z nastpujcego wzoru: 140

RS =

gdzie:

2(t R 2 - t R1 ) W B1 + W B 2

(26)

RS ­ rozdzielczo pików, nazywana te zdolnoci rozdzielcz kolumny, tR1 ­ czas retencji substancji 1, tR2 ­ czas retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1, WB1 ­ szeroko piku 1 na linii podstawy, WB2 ­ szeroko piku 2 na linii podstawy. Purnell wprowadzil zaleno lczc w sobie wielko rozdzielczoci pików (Rs), selektywno rozdzielenia (a) oraz sprawno kolumny (N):

RS =

gdzie:

1 - 1 k 2 N2 4 1 + k 2

(27)

k2 ­ wspólczynnik retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1, N2 ­ liczba pólek teoretycznych odniesiona do substancji 2, ­ wspólczynnik selektywnoci. Wspólczynnik selektywnoci liczymy z nastpujcego wzoru:

=

gdzie:

t'R2 k2 = t ' R1 k1

(28)

t'R1 ­ zredukowany czas retencji substancji 1, t'R2 ­ zredukowany czas retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1, k1 ­ wspólczynnik retencji substancji 1, k2 ­ wspólczynnik retencji substancji 2. 1.7. Analiza jakociowa Analiz jakociow technikami chromatograficznymi mona wykona dwoma sposobami: · poprzez wykorzystanie parametrów retencyjnych analitu (czas retencji, indeksy retencji), · poprzez stosowanie detekcji o duym potencjale identyfikacyjnym, takiej jak spektrometri mas czy spektroskopi w podczerwieni z transformacj Fouriera (FTIR). Parametry retencyjne slu do identyfikacji zwizków chemicznych analizowanych technikami separacyjnymi, poniewa w danych warunkach chromatograficznych okrelony zwizek chemiczny ma zawsze tak sam retencj.

Jednakowe warunki chromatograficzne oznaczaj jednakowy rodzaj i wymiary kolumny chromatograficznej, rodzaj i prdko przeplywu fazy ruchomej, temperatur analizy itd. Do identyfikacji zwizków chemicznych metod chromatografii gazowej oraz chromatografii cieczowej stosuje si wielko czasu retencji lub zredukowanego czasu retencji. Identyfikacj 141

skladnika próbki wykonuje si w ten sposób, e w stalych warunkach chromatograficznych analizuje si bezporednio po sobie badan próbk oraz wzorzec (rysunek 15), nastpnie porównuje si czasy retencji skladników próbki oraz wzorca. Jeeli s inne to na pewno mona wykluczy identyczno substancji. Jeeli s takie same to istnieje due prawdopodobiestwo, e s to identyczne substancje. Naley zwróci uwag, e pomiar czasu retencji moe by obarczony niewielkimi bldami (rzdu setnych czci minuty) wynikajcymi ze sposobu dozowania czy chociaby z opónienia w naciniciu przycisku rozpoczynajcego pomiar (rysunek 15).

a)

b)

Rys. 15. Chromatogramy GC-FID roztworu dokozanu (tR = 9,12 min) (a) oraz badanej próbki (b), pik o tR = 9,08 min na chromatogramie badanej próbki jest pikiem dokozanu, piki o tR = 2,34 min oraz o tR = 2,42 min na chromatogramie roztworu dokozanu s pikami rozpuszczalników, w których rozpuszczono wzorzec dokozanu, równie pik o tR = 2,32 min na chromatogramie badanej próbki jest pikiem rozpuszczalnika

142

Jednake niektóre zwizki chemiczne o rónej budowie mog przypadkowo wykazywa tak sam retencj. Aby uzyska wiksz pewno co do tosamoci zwizku naley powtórzy analiz jakociow, stosujc inne warunki chromatograficzne, to znaczy uywajc kolumny chromatograficznej wypelnionej faz stacjonarn o innej polarnoci. Zamiast czasów retencji mona porównywa zredukowane czasy retencji analitu i wzorca, co prowadzi do dokladniejszych wyników, ale wymaga znajomoci czasu zerowego. Niewielkie rónice warunków chromatograficznych pomidzy analiz próbki oraz analiz wzorca (rysunek 15) mog prowadzi do bldnej interpretacji wyników. Aby temu zapobiec mona doda wzorzec do badanej próbki i nastpnie sprawdzi, czy uzyskujemy jeden czy dwa piki chromatograficzne. Tak sytuacj przedstawia rysunek 19: po dodaniu wzorca do próbki pik analitu zwikszyl si, co oznacza, e jest to ta sama substancja. Wad powyszych metod jest konieczno dysponowania wzorcami wielu zwizków chemicznych oraz wstpnymi informacjami, co do charakteru próbki. Ten sposób identyfikacji stosujemy najczciej wtedy, kiedy poszukujemy w próbce okrelonej substancji. Jeeli próbka jest zupelnie nieznana to dobieranie wzorców metod ,,prób i bldów" jest praktycznie niewykonalne. Wtedy lepsz alternatyw jest stosowanie detektorów jakociowych. Do identyfikacji zwizków chemicznych metod chromatografii gazowej stosuje si take indeksy Kovátsa (nazywane równie indeksami retencji). Indeks retencji jest w znacznym stopniu niezaleny od warunków analizy chromatograficznej i przez to jest charakterystyczny dla danego zwizku w okrelonej temperaturze analizy i polarnoci fazy stacjonarnej. Identyfikacja nieznanego zwizku moe nastpi poprzez porównanie wyznaczonych indeksów retencji z danymi zamieszczonymi w literaturze naukowej. Indeks retencji substancji X wyznacza si w stosunku do retencji n-alkanów, jednego o (z) atomach wgla w lacuchu, eluowanego z kolumny przed substancj, i drugiego o (z + 1) atomach wgla w lacuchu, eluowanego z kolumny za substancj. Indeks retencji n-alkanu wynosi stukrotno liczby atomów wgla, czyli na przyklad dla npentanu indeks retencji wynosi 500. Indeks Kovátsa dla substancji X, wyznaczony w warunkach izotermicznych, oblicza si ze wzoru:

K I = 100z + 100 log t ' R X - log t ' RZ log t ' RZ + 1 - log t ' RZ

(29)

gdzie:

t' R Z ­ zredukowany czas retencji n-alkanu o (z) atomach wgla w lacuchu, t' RX ­ zredukowany czas retencji substancji X, t' RZ +1 ­ zredukowany czas retencji n-alkanu o (z + 1) atomach wgla w lacuchu, t' RZ t' RX t' RZ +1 .

W przypadku chromatografii gazowej z programowaniem temperatury analizy, indeks retencji wyznacza si stosujc bezporednio wartoci liczbowe zredukowanych czasów retencji. Indeks 143

retencji dla substancji X, wyznaczony w warunkach programowanej temperatury, oblicza si ze wzoru: t ' R X -t ' RZ R I = 100 z + 100 (30) t ' RZ +1 -t ' RZ Wyraenie w liczniku i mianowniku wzoru (30) oznacza rónic czasów retencji, wic w przypadku chromatografii gazowej z programowaniem temperatury analizy mona wyznaczy indeks retencji stosujc wartoci calkowitych czasów retencji zamiast zredukowanych czasów retencji. Wzór mona latwo przeksztalci korzystajc z zalenoci:

t' R = t R - t M

(3)

gdzie: t'R ­ zredukowany czas retencji substancji, tR ­ calkowity czas retencji substancji,

R I = 100z + 100 t R X - t RZ t RZ +1 - t RZ

(31)

gdzie:

t RZ ­ czas retencji n-alkanu o (z) atomach wgla w lacuchu, tRX ­ czas retencji substancji X, t RZ +1 ­ czas retencji n-alkanu o (z + 1) atomach wgla w lacuchu, t RZ t RX tRZ +1 .

Detektor o duym potencjale identyfikacyjnym, taki jak spektrometr mas (MS), pozwala na analiz jakociow skladników próbki, poniewa dostarcza informacji o ich masie czsteczkowej i budowie strukturalnej. W wyniku polczenia chromatografu ze spektrometrem mas uzyskuje si rozdzielenie mieszaniny skladników próbki w kolumnie chromatograficznej a nastpnie identyfikacj poszczególnych skladników próbki w spektrometrze mas. Moliwe jest polczenie chromatografu gazowego ze spektrometrem mas (GC-MS) a take chromatografu cieczowego ze spektrometrem mas (LC-MS). Wynikiem analizy technik spektrometrii mas jest widmo mas. Widmo mas zawiera informacj o masie czsteczkowej badanego zwizku oraz o budowie strukturalnej. Widmo mas jest charakterystyczne dla okrelonego zwizku chemicznego i dziki temu pozwala na jego identyfikacj, albo poprzez interpretacj widma albo poprzez proste porównanie z katalogami widm. 1.8. Analiza ilociowa Techniki chromatograficzne, podobnie jak wikszo technik instrumentalnych, nale do metod porównawczych, które wymagaj kalibracji wzgldem wzorców. Analiza ilociowa w technikach chromatograficznych opiera si na tym, e ilo (masa lub stenie) skladnika próbki jest proporcjonalna do powierzchni (lub wysokoci) jego piku. Analiz mona wykona poprzez porównywanie powierzchni (lub wysokoci) piku analitu z powierzchni (lub wysokoci) piku wzorca o znanej masie lub steniu. Wyniki analizy chromatograficznej zale od jakoci zastosowanego chromatografu oraz warunków analizy. 144

Parametr mierzony, pole powierzchni lub wysoko piku, jest funkcj stenia (lub masy) chromatografowanej substancji.

A = f (c ) h = f (c )

gdzie: A ­ pole powierzchni piku, h ­ wysoko piku, c ­ stenie substancji w próbce dozowanej do chromatografu. Najczciej stosowane s trzy metody analizy ilociowej: · metoda krzywej kalibracyjnej (kalibracja bezwzgldna), · metoda wzorca wewntrznego, · metoda dodatku wzorca. 1.8.1. Metoda krzywej kalibracyjnej

(32) (33)

W metodzie krzywej kalibracyjnej mierzony parametr (pole powierzchni lub wysoko piku) jest funkcj liniow stenia. Mona go opisa równaniem prostej:

h = ac + b

gdzie: c ­ stenie substancji w próbce dozowanej do chromatografu, a ­ wspólczynnik kierunkowy prostej, b ­ warto stala, bdca wartoci wyznaczon dla lepej próby.

(34)

Podobn posta ma równie równanie wykorzystywane w metodzie krzywej kalibracyjnej w przypadku, kiedy mierzymy pole powierzchni piku a nie jego wysoko. Zaleno mierzonego parametru (pola powierzchni lub wysokoci piku) od stenia zwizku mona przedstawi graficznie (rysunek 16).

h = ac + b

25 20 h [cm] 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 c [m g/ml]

h [cm] 20 15 10 5 0 0 2

h = ac

4

6

8

10

c [m g/ml]

Rysunek 16. Przyklady krzywych kalibracyjnych, zaleno wysokoci piku chromatograficznego (h) od stenia badanego zwizku (c)

145

Wspólczynnik a okrela czulo metody; im wiksze zmiany parametru mierzonego na jednostk stenia c, tym wiksza jego warto i tym wysza czulo metody. Metody o malym kcie nachylenia krzywych kalibracyjnych nie s przydatne do celów analitycznych. Warto stala b moe przyjmowa wartoci dodatnie, ujemne lub zero. W metodzie krzywej kalibracyjnej przygotowuje si szereg roztworów o znanych steniach substancji analizowanych oraz tzw. lep prób ­ roztwór, w którym s wszystkie skladniki roztworów wzorcowych z wyjtkiem analitu. Nastpnie wykonuje si analiz chromatograficzn kadego roztworu i mierzy si pole powierzchni (lub wysoko) piku substancji analizowanej. Pole powierzchni lub wysoko piku mierzy si równie dla próbki badanej, nanosi na krzyw kalibracyjn i odczytuje stenie analitu w próbce badanej lub oblicza si je z równania prostej. Metod krzywej kalibracyjnej stosuje si wtedy, kiedy mona z du dokladnoci wyznaczy objto dozowanych próbek. Jest to najczciej stosowana metoda analizy ilociowej w chromatografii cieczowej.

1.8.2. Metoda wzorca wewntrznego W metodzie wzorca wewntrznego do badanej próbki dodaje si okrelon ilo wzorca (substancji standardowej), dobrze oddzielajcego si w danych warunkach analizy od wszystkich badanych skladników próbki. Wzorzec powinien mie wlaciwoci fizyko-chemiczne maksymalnie zblione do wlaciwoci substancji badanej, nie moe by skladnikiem analizowanej próbki, poza tym powinien by nielotny, trwaly i dostpny w postaci czystej. Ilo dodanego wzorca powinna by porównywalna z iloci badanej substancji. Sygnal wikszoci detektorów zaley od rodzaju analizowanych zwizków i dlatego stosunek wysokoci (lub powierzchni) pików dwóch zwizków nie jest równy stosunkowi ich zawartoci w mieszaninie. W chromatografii gazowej odpowied detektora plomieniowo-jonizacyjnego (FID) jest wprost proporcjonalna do liczby atomów wgla niezwizanych z tlenem a nie do masy zwizku. Równania krzywej kalibracyjnej dla analitu i dla wzorca, który jest inn substancj, nie bd identyczne. Metod wzorca wewntrznego mona zastosowa, jeeli wartoci b w obu równaniach bd równe zeru.

ha = aa c a

h w = a w cw

gdzie: ha ­ wysoko piku analitu, aa ­ wspólczynnik kierunkowy prostej (analit), ca ­ stenie analitu w próbce dozowanej do chromatografu, hw ­ wysoko piku wzorca, aw ­ wspólczynnik kierunkowy prostej (wzorzec), cw ­ stenie wzorca w próbce dozowanej do chromatografu. Równania mona podzieli stronami: (35)

ha a c = a a hw a w c w

(36) 146

Wprowadzajc tzw. wspólczynnik odpowiedzi f:

f =

aa aw

(37)

Otrzymuje si równania stosowane w metodzie wzorca wewntrznego:

ha c = f a hw cw ha m = f a hw mw

gdzie: ca ­ stenie analitu w próbce, ma ­ masa analitu w próbce, cw ­ stenie wzorca w próbce. mw ­ masa wzorca w próbce, f ­ wspólczynnik odpowiedzi.

(38) (39)

Podobn posta maj równie równania wykorzystywane w metodzie wzorca wewntrznego w przypadku, kiedy mierzy si pole powierzchni piku a nie jego wysoko. Wspólczynnik odpowiedzi jest wartoci charakterystyczn dla okrelonej pary zwizków chemicznych, analitu i wzorca wewntrznego, zalen od warunków przeprowadzanej analizy. Wykonanie analizy sklada si z dwóch etapów. W pierwszym etapie przygotowuje si roztwór wzorcowy zawierajcy analit oraz wybrany wzorzec wewntrzny o okrelonych znanych steniach (ca' oraz cw'). Wykonuje si analiz roztworu wzorcowego i mierzy wysoko piku analitu oraz wysoko piku wzorca wewntrznego (ha' oraz hw') (rysunek 17). Znajc wartoci ca', cw', ha ' oraz hw', mona wyznaczy eksperymentalnie warto wspólczynnika detekcji f, korzystajc z wzoru (38) lub (39), stosowanego w metodzie wzorca wewntrznego. W drugim etapie dodaje si okrelon znan ilo wzorca wewntrznego do badanej próbki (cw), wykonuje analiz roztworu próbki i mierzy wysoko piku analitu oraz wysoko piku wzorca wewntrznego (ha oraz hw) (rysunek 18). Znajc warto wyznaczonego wczeniej wspólczynnika detekcji f, korzysta si z wzoru (38) lub (39), stosowanego w metodzie wzorca wewntrznego i oblicza zawarto analitu w próbce. Metoda wzorca wewntrznego jest czsto stosowana w chromatografii gazowej. Powodem jest przede wszystkim mnogo operacji wykonywanych na próbce (min. ekstrakcji i przeprowadzania jej w pochodne odpowiednie do analizowania metod GC), w których czasie moe nastpi pewna utrata próbki. Inne przyczyny to: problemy z okreleniem malych objtoci rozpuszczalnika, w którym rozpuszcza si badan próbk, niemono uzyskania powtarzalnego dozowania przy zastosowaniu dozownika z dzieleniem oraz to, e eliminuje si konieczno wykonania krzywej kalibracyjnej.

147

Rysunek 17. Chromatogram GC-FID roztworu wzorcowego, wzorzec wewntrzny (tR = 9,07 min; c = 1 mg/ml) oraz analit (tR = 12,23 min; c = 1 mg/ml); na podstawie zamieszczonych danych mona obliczy warto wspólczynnika detekcji f (sposób wyznaczania wysokoci piku chromatograficznego jest wyjaniony na rysunku 4)

Rysunek 18. Chromatogram GC-FID badanej próbki, wzorzec wewntrzny (tR = 9,08 min; c = 0,4 mg/ml) oraz analit (tR = 12,25 min) (na podstawie zamieszczonych danych oraz wyznaczonej wartoci wspólczynnika detekcji f mona obliczy stenie analitu w próbce)

148

1.8.3. Metoda dodatku wzorca Metod dodatku wzorca stosuje si, jeeli równanie krzywej kalibracyjnej ma przebieg prostoliniowy za warto b jest równa zeru. Ponadto, objto próbki wprowadzanej na kolumn chromatograficzn musi by stala. Warunek ten jest spelniony w przypadku stosowania dozowników z ptl dozownicz. Procedura oznacze w metodzie dodatku wzorca jest nastpujca:

· · ·

pobiera si dwie identyczne próbki 1 i 2, przygotowuje si próbk 1 i wykonuje analiz chromatograficzn, mierzc pole powierzchni lub wysoko piku analitu; do próbki 2 dodaje si znan ilo wzorca, który jest badan substancj (analitem), roztwór miesza i wykonuje analiz chromatograficzn, mierzc pole powierzchni lub wysoko piku analitu; warto parametru mierzonego wzrasta, a wzrost jest proporcjonalny do iloci dodanego analitu (rysunek 19).

Wynikiem dodania roztworu wzorca jest zmiana objtoci próbki badanej, std naley skorygowa stenia. W przypadku stosowania mikrostrzykawek i wprowadzania niewielkich (rzdu kilku µl) objtoci roztworu wzorca do analizowanej próbki, które nie wplywaj w zasadniczy sposób na zmian objtoci próbki, taka korekta objtoci nie jest konieczna.

Analit

Analit + wzorzec

Rysunek 19. Chromatogramy próbki 1 (z lewej) oraz próbki 2 z dodatkiem wzorca (z prawej) Stenie analitu mona wyliczy na podstawie ukladu dwóch równa:

h1 = ac

h2 = a (c + c w )

gdzie: h1 ­ wysoko piku analitu zmierzona dla próbki 1 bez dodatku wzorca, a ­ wspólczynnik kierunkowy prostej, c ­ stenie analitu w badanej próbce, 149 (40)

h2 ­ wysoko piku zmierzona dla próbki 2 po dodaniu wzorca, cw ­ stenie wzorca w badanej próbce. Z równania pierwszego oblicza si a:

a=

h1 c

(41)

Po podstawieniu a do równania drugiego otrzymuje si:

h2 =

h1 (c + cw ) c

(42)

Po rozwizaniu równania wzgldem c otrzymuje si równanie stosowane w metodzie dodatku wzorca:

c=

1.8.4. Metoda normalizacji wewntrznej

h1 cw h2 - h1

(43)

Metoda normalizacji wewntrznej polega na wyznaczeniu udzialu procentowego wszystkich substancji w próbce. Jest to najprostsza metoda analizy ilociowej, umoliwiajca oszacowanie wzgldnych iloci skladników próbki, na przyklad przy oznaczaniu czystoci próbki. Warunkiem koniecznym stosowania metody normalizacji wewntrznej jest, aby wszystkie skladniki próbki (anality) wyeluowaly z kolumny chromatograficznej i zostaly zarejestrowane na chromatogramie. Metoda normalizacji wewntrznej jest stosowana przede wszystkim w chromatografii gazowej (GC-FID) natomiast nie jest stosowana w chromatografii cieczowej. Metoda prostej normalizacji wewntrznej Powierzchnie pików chromatograficznych mierzy si, a ich sum przyjmuje za 100% próbki (pomijajc pik rozpuszczalnika, w którym rozpuszczono próbk badan. Powierzchnia sygnalu okrelonego zwizku w stosunku do sumy powierzchni wszystkich sygnalów odpowiada zawartoci zwizku w próbce: Ai %i = 100 (44) Ai

gdzie: %i ­ udzial % okrelonego analitu w próbce, Ai ­ powierzchnia piku okrelonego analitu. Jednake, aby uzyska dokladne wyniki, detektor musi wykazywa tak sam odpowied (takie same wspólczynniki detekcji) dla wszystkich analitów obecnych w próbce. Metoda normalizacji wewntrznej z zastosowaniem wspólczynników korekcyjnych Jeli analizuje si zwizki o podobnych wlaciwociach fizykochemicznych, tak jak na przyklad skladniki szeregu homologicznego, to nie jest konieczne wyznaczanie wspólczynników korekcyjnych (dla substancji o rónych wlaciwociach fizykochemicznych naley je koniecznie wprowadzi, w przeciwnym wypadku otrzyma si tylko szacunkowe wyniki ilociowe). 150

W celu wyznaczenia wspólczynników korekcyjnych sporzdza si roztwór wzorcowy, zawierajcy znane iloci wszystkich analitów wystpujcych w badanej próbce i oblicza jego sklad procentowy. Po wykonaniu analizy chromatograficznej roztworu wzorcowego wyznacza si wspólczynniki korekcyjne dla kadego analitu:

fi =

gdzie:

S i ( m) S i( chr )

(45)

fi ­ wspólczynnik korekcyjny okrelonego analitu, Si(m) ­ zawarto procentowa okrelonego analitu w roztworze wzorcowym obliczona przy uwzgldnieniu nawaek wszystkich skladników, Si(chr) ­ zawarto procentowa okrelonego analitu w roztworze wzorcowym wyznaczona na podstawie analizy chromatograficznej roztworu wzorcowego. Dysponujc wyznaczonymi wspólczynnikami korekcyjnym dla kadego analitu w próbce mona obliczy dokladn (skorygowan) zawarto procentow kadego analitu w badanej próbce:

%i = f i × Ai ( f i × Ai ) 100

(46)

gdzie: %i ­ udzial % okrelonego analitu w próbce, Ai ­ powierzchnia piku okrelonego analitu, fi ­ wspólczynnik korekcyjny okrelonego analitu.

151

2. Chromatografia cieczowa

2.1. Wstp Chromatografia cieczowa jest rodzajem chromatografii, w której faz ruchom jest ciecz, natomiast faz stacjonarn moe by cialo stale (chromatografia adsorpcyjna) lub ciecz osadzona na noniku (chromatografia podzialowa). Warunkiem stosowania chromatografii cieczowej jest rozpuszczalno w fazie ruchomej analitów rozdzielanych. Za pomoc chromatografii cieczowej mona analizowa okolo 80% znanych zwizków chemicznych, stosujc róne jej rodzaje, klasyfikowane wg kilku glównych kryteriów. Ze wzgldu na geometri ukladu chromatografi cieczow mona podzieli na:

· ·

chromatografi kolumnow, chromatografi planarn.

Chromatografi kolumnow mona dalej podzieli na:

· ·

chromatografi kolumnow niskocinieniow (zwykl, tradycyjn), wysokosprawn chromatografi cieczow (HPLC).

Ze wzgldu na mechanizm oddzialywania rozdzielanych zwizków z faz stacjonarn, chromatografi cieczow mona podzieli na:

· · · · · ·

chromatografi adsorpcyjn, chromatografi podzialow, chromatografi jonow, chromatografi jonowo-asocjacyjn, chromatografi wykluczania, chromatografi powinowactwa.

W chromatografii cieczowej na przebieg i efekty separacji zwizków wplywaj wlaciwoci zarówno fazy stacjonarnej jak i fazy ruchomej. Chromatografi adsorpcyjn oraz chromatografi podzialow dzieli si na chromatografi w normalnym ukladzie faz oraz chromatografi w odwróconym ukladzie faz. Jeeli faza stacjonarna jest polarna to faza ruchoma jest mniej polarna lub niepolarna. Jest to chromatografia w normalnym ukladzie faz (NP). W chromatografii w normalnym ukladzie faz jako skladniki fazy ruchomej stosuje si niepolarne rozpuszczalniki, takie jak: heksan, eter izopropylowy, chloroform i in. (patrz rozdzial 2.3.4). Rozpuszczalniki sklasyfikowane wedlug wzrastajcej polarnoci, a tym samym wedlug wzrastajcej mocy elucyjnej w chromatografii w normalnym ukladzie faz nazywamy szeregiem eluotropowym rozpuszczalników (por.roz. II. 2.3.4, tab. 1). Czas retencji zwizku rozdzielanego w chromatografii w normalnym ukladzie faz ulega skróceniu, jeeli zastosuje si rozpuszczalnik o wikszej sile elucyjnej (wikszej polarnoci) natomiast wydlua si, jeeli zastosuje si rozpuszczalnik o mniejszej sile elucyjnej (mniejszej W chromatografii w normalnym ukladzie faz, jako faz stacjonarn stosuje si przede wszystkim el krzemionkowy (por.roz. II.2.3.3), a take fazy zwizane chemicznie, w których struktury wchodz polarne grupy funkcyjne. 152

Jeeli faza stacjonarna jest niepolarna, to faza ruchoma jest polarna. Jest to chromatografia w odwróconym ukladzie faz (RP). W chromatografii w odwróconym ukladzie faz skladnikami fazy ruchomej s rozpuszczalniki polarne, takie jak: mieszanina woda-metanol lub woda-acetonitryl. Wzrost zawartoci wody w fazie ruchomej powoduje wydluenie czasów retencji zwizków rozdzielanych i odwrotnie ­ wzrost zawartoci modyfikatora organicznego (metanolu lub acetonitrylu) w fazie ruchomej powoduje skrócenie czasów retencji zwizków rozdzielanych w chromatografii w odwróconym ukladzie faz. Niejednokrotnie w ukladach fazy ruchomej znajduj si take odpowiednie roztwory buforowe, umoliwiajce utrzymanie odpowiedniego pH w trakcie procesu separacyjnego. Elucj, czyli wymywanie rozdzielanych zwizków z fazy stacjonarnej za pomoc fazy ruchomej, mona prowadzi jednym rozpuszczalnikiem lub jedn mieszanin rozpuszczalników o okrelonym stalym skladzie i jest to elucja izokratyczna. Elucja izokratyczna jest to rodzaj elucji, podczas której sklad jakociowy i ilociowy fazy ruchomej pozostaje staly. Elucja gradientowa polega na tym, e prowadzi si wymywanie kolejno kilkoma rozpuszczalnikami lub kolejno kilkoma mieszaninami rozpuszczalników, o wzrastajcej lub malejcej mocy elucyjnej. Elucja gradientowa jest to rodzaj elucji, w którym sklad fazy ruchomej zmienia si w sposób cigly lub stopniowo.

2.2. Chromatografia cienkowarstwowa 2.2.1. Wstp Termin chromatografia cienkowarstwowa (TLC) zostal wprowadzony przez E. Stahla w 1956 i oznacza proces chromatograficzny prowadzony na cienkiej warstwie fazy stacjonarnej, naniesionej na podloe z plytek szklanych lub z folii aluminiowych czy polimerowych (por.roz. III.1.1, rysunek 2). TLC jest rodzajem chromatografii cieczowej planarnej. Zalet chromatografii cienkowarstwowej jest przede wszystkim moliwo analizy substancji nielotnych lub o malej lotnoci, zarówno substancji niepolarnych, polarnych lub o redniej polarnoci, a take w formie zjonizowanej. Jednak przede wszystkim glównymi zaletami tej techniki wci pozostaj prostota i niska cena sprztu, niewymagajcego dostpu do elektrycznoci. Warunki analiz TLC mog by latwo modyfikowane z moliwoci stosowania realtywnie reaktywnych rozpuszczalników jak i próbek, co jest ograniczeniem w chromatografii kolumnowej (niektóre próbki czy reaktywne rozpuszczalniki mog zniszczy lub uszkodzi kolumn GC lub HPLC). Kolejn zalet jest równie latwo detekcji, dziki której wszystkie skladniki próbki mog by monitorowane, co jest wane przy sprawdzaniu czystoci próbki. Obecnie chromatografi cienkowarstwow stosuje si powszechnie w:

153

· · · · ·

analizie farmaceutycznej, glównie przy identyfikacji analitów, testach czystoci, oznaczaniu skladników aktywnych, pomocniczych i konserwantów oraz kontroli procesu produkcji, analizie medycznej, kryminalistycznej i biochemicznej przy oznaczaniu aktywnych substancji i ich metabolitów w matrycach biologicznych oraz przy diagnostyce chorób, analizie kosmetycznej przy analityce surowców i produktów, konserwantów, rodków powierzchniowo-czynnych, kwasów tluszczowych, skladników perfum i innych, analizie ywnoci przy oznaczaniu pestycydów i rodków grzybobójczych w wodzie pitnej, oznaczaniu substancji zakazanych w warzywach, misie, oznaczaniu witamin i innych, analizie zanieczyszcze rodowiska (sporadycznie).

2.2.2. Proces chromatograficzny Proces chromatograficzny przeprowadza si w odpowiednich komorach chromatograficznych (rysunek 20). Próbk nanosi si na plytk TLC w postaci roztworu o bardzo malej objtoci, tworzc mal plamk w punkcie startowym (rysunek 2). Plytki umieszcza si w komorze chromatograficznej, w której na dnie znajduje si faza ruchoma. W wyniku dzialania sil kapilarnych faza ruchoma wdruje w gór plytki. Jest to proces rozwijania chromatogramu metod wstpujc. Oddzialywanie substancji znajdujcych si w próbce z adsorbentem oraz z poruszajcym si rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie si skladników próbki na plytce. W wyniku rozdzielenia poszczególne skladniki tworz oddzielne plamki. W przedstawionym na rysunku 2 rozdziale TLC, plamka z lewej strony nie ulegla rozdzieleniu (lub jest pojedyncz substancj) natomiast plamka z prawej strony ulegla rozdzieleniu. Proces separacji skladników próbki naniesionej na plytk TLC nazywa si rozwijaniem chromatogramu. Plamki rozdzielonych skladników (o ile nie posiadaj grup chromoforowych w zakresie widzialnym) uwidacznia si, czyli wywoluje. Chromatogramy wywoluje si najczciej odczynnikami chemicznymi, które tworz barwne zwizki z analitami. Czsto oglda si chromatogramy TLC owietlane nadfioletem, aby zobaczy substancje wykazujce wlaciwoci fluorescencyjne pod wplywem promieniowania UV. W chromatografii cienkowarstwowej stosuje si takie same fazy ruchome, jak w kolumnowej chromatografii cieczowej, dlatego dobór fazy ruchomej jest oparty na tych samych zasadach (por.roz.III.2.3.4.). Fazy stacjonarne stosowane w TLC s równie podobne, jak w kolumnowej chromatografii cieczowej i s opisane w nastpnych rozdzialach. Najbardziej popularn faz stacjonarn stosowan w TLC jest el krzemionkowy (por.roz. III.2.3.3.). redni rozmiar czstek zloa fazy stacjonarnej to 11 µm w analitycznej TLC i 5 µm w wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC), natomiast w preparatywnej TLC - powyej 20 µm. W chromatografii cienkowarstwowej stosuje si równie zloa chemicznie zmodyfikowane, np. grupami NH2 (normalny uklad faz) lub grupami oktadecylowymi C-18 (odwrócony uklad faz).

154

Rysunek 20. Komora do chromatografii cienkowarstwowej Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, który okrela poloenie substancji na chromatogramie, jest wspólczynnik opónienia RF. Jest to stosunek drogi migracji substancji (a) do drogi przebytej przez faz ruchom (b):

RF =

a b

(51)

Wspólczynnik opónienia przyjmuje wartoci od 0 do 1. Jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach chromatograficznych i moe sluy do jej identyfikacji. Sposób jego wyznaczania jest pokazany na rysunku 21.

Rysunek 21. Sposób pomiaru wspólczynnika opónienia RF Jeeli dana substancja ma t sam warto wspólczynnika opónienia, jak ma wzorzec, wyznaczon w takich samych warunkach chromatograficznych, to prawdopodobnie jest identyczna ze wzorcem. Najczciej analiz jakociow wykonuje si w ten sposób, e na jedn plytk TLC nanosi si badan 155

próbk oraz obok nanosi si równie wzorzec. Po rozwiniciu plytki sprawdza si, która plamka badanej próbki ma tak sam warto wspólczynnika opónienia jak wzorzec. Na rysunku 22 przedstawiono chromatogram TLC ekstraktu barwników wyizolowanych ze szpinaku. W punkcie E naniesiono caly ekstrakt, w punkcie 1 ­ wzorzec, którym jest czysty -karoten a w punkcie 2 ­ jedn z frakcji, wydzielon z ekstraktu metod niskocinieniowej chromatografii preparatywnej. -karoten stanowi pomaraczow plamk o wartoci RF bliskiej jednoci. Podobna plamka znajduje si w calym ekstrakcie, natomiast wydzielona frakcja nie zawiera -karotenu.

Rysunek 22. Przykladowy chromatogram TLC ekstraktu barwników ze szpinaku (E), wzorca karotenu (1) i frakcji ekstraktu wydzielonej metod niskocinieniowej chromatografii preparatywnej (2)

Wyróniamy nastpujce sposoby rozwijania chromatogramów:

· ·

· ·

metoda wstpujca (rysunek 2 i 22), która jest najczciej stosowana, metoda zstpujca (splywowa), polegajca na tym, e rozpuszczalnik podawany jest od góry plytki TLC; w metodzie tej ruch fazy ruchomej wywolywany jest silami kapilarnymi i dodatkowo sil cienia (w praktyce bardzo rzadko uywana), metoda dwukierunkowa (dwuwymiarowa), 2D-TLC (rysunek 23), metoda horyzontalna, polegajca na rozwijaniu chromatogramu na plytkach uloonych poziomo w specjalnej komorze.

Niekiedy mieszaniny zwizków s trudne do rozdzielenia za pomoc jednowymiarowych technik TLC. Czsto ma to miejsce w przypadku mieszanin zwizków naturalnych. Aby uzyska pelne rozdzielenie zwizków o podobnych wlaciwociach chemicznych stosuje si technik dwuwymiarow (2D-TLC). Pojedyncz próbk nanosi si w jednym rogu plytki TLC, któr nastpnie rozwija si w pierwszym kierunku (rys. 23), uzyskujc czciowe rozdzielenie skladników próbki (cztery frakcje). 156

Chromatogram po wysuszeniu i obróceniu o 90° jest rozwijany ponownie, ale w drugim kierunku (prostopadlym do pierwszego) i z uyciem fazy ruchomej o innym skladzie. Tym samym cztery uzyskane frakcje (plamki) stanowi punkty startowe. W wyniku drugiego procesu rozdzielenia, kada z frakcji ma moliwo separacji na pojedyncze skladniki: frakcje pierwsza, trzecia i czwarta (od prawej) s mieszanin 3 substancji, frakcja druga jest pojedynczym zwizkiem. W dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej poloenie substancji na

chromatogramie okrelaj dwa wspólczynniki opónienia: RF1 = a1/b1 oraz RF2 = a2/b2.

Sposób wyznaczania obu wspólczynników przedstawiony jest na rysunku 23.

Rysunek 23. Dwuwymiarowa chromatografia cienkowarstwowa (2D-TLC); zasada rozwijania oraz sposób wyznaczania wartoci wspólczynników opónienia w obu kierunkach rozwijania: RF1 = a1/b1 oraz RF2 = a2/b2 2.2.3. Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej w TLC Plytki TLC gotowe do uycia s dostpne komercyjnie. Plytki s pakowane i przechowywane w odpowiednich pudelkach. Mona je latwo uszkodzi, co negatywnie wplywa na proces

157

chromatograficzny. Przestrzeganie pewnych zasad pozwala poprawnie przeprowadzi rozdzielanie na plytkach TLC. Zasady poprawnego rozdzialu na plytkach TLC:

· · · ·

powierzchni plytek nie wolno dotyka palcami, przy ciciu plytki noyczkami nie wolno zniszczy warstwy fazy stacjonarnej, dobrze jest usun ukruszon cz fazy stacjonarnej z brzegu, który byl plytki, dobrze jest wstpnie przemy plytk TLC metanolem lub innym rozpuszczalnikiem, uywanym póniej do rozwijania chromatogramu, aby pozby si zanieczyszcze zaabsorbowanych w fazie stacjonarnej; przemyt plytk suszy si i przechowuje w szczelnie zamknitym naczyniu,

·

faz stacjonarn (el krzemionkowy) mona aktywowa, poprzez suszenie plytki TLC w cigu 30 minut w temp. 120 °C dla usunicia czci zaadsorbowanej wody z elu krzemionkowego, obniajcej jego aktywno (aktywowane plytki przechowuje si w szczelnie zamknitym naczyniu),

·

na plytce delikatnie zaznacza si mikkim olówkiem jedynie punkt startowy i ewentualnie lini kocow czola fazy ruchomej, za pomoc niewielkiej kreski o szerokoci 0,5 cm z boku plytki. Opis nanoszonych próbek najlepiej zamieci w zeszycie laboratoryjnym a nie na plytce TLC. Zniszczenie powierzchni fazy stacjonarnej poprzez rysowanie na plytce powoduje bldy w analizach TLC.

Nanoszenie próbki na plytk TLC Punkt startowy, gdzie nanosi si próbk, nie powinien by za nisko na plytce TLC, aby plamka nie byla zanurzona w fazie ruchomej. Z tego samego powodu, przy wkladaniu plytki do komory chromatograficznej, naley unika gwaltownych ruchów. Naley ponadto pamita, e im mniejsza jest objto naniesionego roztworu próbki tym lepiej. Przy analizie jakociowej nanosi si od 0,5 do 2,0 µl roztworu próbki, przy okrelaniu czystoci próbki - okolo 10 µl nanoszonych w niewielkich porcjach. Plamka naniesionej próbki powinna by jak najmniejsza. rednica plamki nie powinna przekracza 2 mm. Naley take starannie wybra rozpuszczalnik do rozpuszczenia próbki: im mniejsza sila elucyjna rozpuszczalnika tym lepiej, bo uzyskuje si plamk o mniejszej rednicy, im lotniejszy rozpuszczalnik, tym latwiej go usun. Z plamki naniesionej próbki naley usun rozpuszczalnik. W przypadku lotnych zwizków rozpuszczonych w lotnym rozpuszczalniku, pozostawia si plytk na kilka minut w temp. pokojowej., Do suszenia nie powinno si stosowa suszarki do wlosów, cho jest do powszechnie uywana w wikszoci laboratoriów (lotne zwizki mog zosta usunite ze strumieniem powietrza). W przypadku termicznie stabilnych substancji, rozpuszczonych w chloroformie lub metanolu plytk pozostawia si na 20 minut w suszarce, w temperaturze bliskiej temperatury wrzenia rozpuszczalnika, tu stosowanie suszarki do wlosów moe by niewystarczajce.

158

Rozwijanie chromatogramów TLC W tym procesie niezbdne jest odpowiednie, wczeniejsze nasycenie komory chromatograficznej oparami fazy ruchomej. Naley pamita, i kada plytka ,,ma prawo" do swojej wlasnej fazy ruchomej. Oznacza to, e nie wolno uywa komory chromatograficznej napelnionej jedn faz ruchom do rozwijania kolejnych plytek TLC, zwlaszcza, jeli uywa si fazy ruchomej bdcej mieszanin kilku rozpuszczalników.

Podczas chromatografowania moe nastpi zmiana skladu fazy ruchomej, dlatego komor naley napelnia wie faz ruchom przed rozwijaniem kadej plytki. Jeeli faza ruchoma jest jednoskladnikowa, to sprawdza si jej czysto i ilo, i ewentualnie uzupelnia lub wymienia. Najlepiej uywa wieo przygotowanej fazy ruchomej. Przechowywane przez dlugi czas roztwory fazy ruchomej mog zmienia swój sklad i w sposób negatywny wplywa na wynik analizy. Komora chromatograficzna nie powinna sta pod wycigiem laboratoryjnym w trakcie rozwijania chromatogramu. Przeplyw powietrza zmienia temperatur, a to wplywa na rozdzielanie chromatograficzne. Nie wolno take poruszy komory chromatograficznej w trakcie rozwijania chromatogramu. 2.3. Chromatografia kolumnowa niskocinieniowa 2.3.1. Wstp Zalet niskocinieniowej chromatografii kolumnowej jest moliwo rozdzielania duych iloci próbki, zazwyczaj wikszych ni za pomoc wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Z tego powodu ten rodzaj chromatografii jest najczciej stosowany, jako rodzaj chromatografii preparatywnej pozwalajcej na separacj duych iloci zwizków. W chromatografii kolumnowej niskocinieniowej stosuje si zarówno polarne jak i niepolarne fazy stacjonarne. Stosowanie w chromatografii niskocinieniowej faz stacjonarnych niepolarnych (chromatografia w odwróconym ukladzie faz, RP) jest duo rzadsze ni stosowanie faz stacjonarnych polarnych (chromatografia w normalnym ukladzie faz, NP), ze wzgldu na zdecydowanie wysz cen takich zló chromatograficznych. Chromatografi cieczow w normalnym ukladzie faz jest chromatografia adsorpcyjna, pozwalajca na separacj zwizków organicznych na klasy zwizków wg ich polarnoci.

Rozdzielanie mieszaniny zwizków organicznych, nierónicych si grupami funkcyjnymi (nierónicych si polarnoci) wymaga wyszej, ni w chromatografii adsorpcyjnej, rozdzielczoci. Separacja w chromatografii adsorpcyjnej zaley od rónic w rodzaju i iloci grup funkcyjnych a nie od rónic w masie czsteczkowej zwizków. Zloone mieszaniny mog wic by podzielone na klasy zwizków, na przyklad: alkany, alkeny, estry, alkohole i in. Chromatografia cieczowa adsorpcyjna zostala opisana w rozdziale III.2.4.3.

159

W preparatywnej chromatografii niskocinieniowej dominuje uywanie elu krzemionkowego, jako polarnej fazy stacjonarnej. Kolejno elucji zwizków z kolumny zaley od ich polarnoci. Zwizki o niskiej polarnoci s eluuowane jako pierwsze od chwili wprowadzenia, a nastpnie eluuj zwizki o wikszej polarnoci (rysunek 24).

Kwasy karboksylowe Amidy Alkohole/Aminy Estry/Aldehydy/Ketony Zwizki nitrowe Etery Sulfidy Zwizki aromatyczne Olefiny Alkany

Rysunek 24. Kolejno elucji zwizków z elu krzemionkowego [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005] 2.3.2. Proces chromatograficzny Zasadnicz czci kadego zestawu do niskocinieniowej chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szkla obojtnego (rysunek 25), której wymiary s dostosowane do skali przeprowadzanego rozdzielenia. Najczciej mieci ona od 10 do 100 g fazy stacjonarnej, co wystarcza do separacji od 0,1 do kilku gramów próbki. Z reguly dobiera si tak ilo fazy stacjonarnej, aby masa rozdzielanej próbki wynosila 5-10% masy fazy stacjonarnej. Dla przyspieszenia przeplywu fazy ruchomej stosuje si slabe ssanie (pompka wodna) lub slabe tloczenie. Napelnianie kolumny faz stacjonarn mona przeprowadza na sucho i na mokro. W metodzie na sucho faz stacjonarn wsypuje si malymi porcjami do kolumny i ubija paleczk szklan. Nastpnie przemywa si j faz ruchom. Metoda na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny fazy stacjonarnej w fazie ruchomej. W obu metodach napelnianie naley wykona w taki sposób, by zloe bylo jednorodne, pozbawione pcherzyków powietrza i tak uloone, by nie zmienialo objtoci w czasie procesu rozdzielania. Powierzchnia zloa powinna by stale pokryta plynem od chwili nalania pierwszych porcji fazy ruchomej a do zakoczenia procesu chromatograficznego.

160

Faza stacjonarna

szot Objto martwa

Rysunek 25. Zestaw do chromatografii cieczowej niskocinieniowej Metoda napelniania kolumny na mokro jest latwiejsza i czciej stosowana. Rozpoczynajc proces chromatograficzny nanosi si badan próbk w postaci roztworu na wierzchni warstw fazy stacjonarnej, wypelniajcej kolumn. Wybór rozpuszczalnika do nanoszenia próbki zaley przede wszystkim od rozpuszczalnoci jej skladników, poza tym naley wybiera rozpuszczalnik charakteryzujcy si moliwie jak najmniejsz sil elucyjn. Nastpnie eluuje si, czyli wymywa rozdzielone skladniki próbki z fazy stacjonarnej, przepuszczajc faz ruchom przez kolumn. Faz ruchom wprowadza si do zbiornika na wierzcholku kolumny. Wyplywajc z kolumny faz ruchom zawierajc separowane skladniki próbki zbiera si, jako tzw. frakcje, do kolejnych próbówek lub cylindrów miarowych. Zbieranie frakcji zaczyna si od momentu wprowadzenia próbki na wierzch fazy stacjonarnej, czyli od pocztku procesu chromatograficznego. Poszczególne frakcje odparowuje si i bada innymi metodami. Do monitorowania skladu frakcji w chromatografii niskocinieniowej mona stosowa analiz technik TLC. Proces rozdzielania LC mona równie latwo monitorowa, jeeli zwizki rozdzielane s barwnikami. 2.3.3. el krzemionkowy jako faza stacjonarna el krzemionkowy jest polarnym adsorbentem o ogólnym wzorze sumarycznym SiO2·nH2O. Jest to material porowaty i amorficzny. Kontrolujc proces produkcji elu krzemionkowego, mona uzyska 161

Przeplyw grawitacyjny

Faza ruchoma

material o bardzo rozwinitej powierzchni wlaciwej od 200 do 800 m2/g. Na powierzchni elu krzemionkowego znajduj si nastpujce grupy:

· ·

silanolowe: siloksanowe:

Si-OH Si-O-Si.

Obecno przede wszystkim polarnych grup silanolowych powoduje, e jest on polarn faz stacjonarn, stosowan w chromatografii w normalnym ukladzie faz. Wlaciwoci rónych grup silanolowych zale od wzajemnej odlegloci i przestrzennego rozmieszczenia. Grupy zwizane, polczone ze sob wizaniem wodorowym maj wlaciwoci protonoakceptorowe natomiast grupy silanolowe swobodne oraz aktywne stanowi centra silnie protonodonorowe (rysunek 26). Uwaa si, e najwiksz rol w procesie adsorpcji odgrywaj grupy swobodne i aktywne a adsorpcja na powierzchni elu krzemionkowego polega przede wszystkim na tworzeniu z nimi wiza wodorowych.

H O Si O Si

H

O O Si

H O Si

H

swobodne

zwizane

aktywne

Rysunek 26. Typy grup silanolowych na powierzchni elu krzemionkowego [na podstawie Liquid column chromatography: a survey of modern techniques and applications. Deyl et al., 1975] Aktywno elu krzemionkowego zaley od iloci wody zaadsorbowanej na jego powierzchni, gdy powoduje ona dezaktywacj tej powierzchni. Przed uyciem mona aktywowa el krzemionkowy poprzez wygrzewanie w temp. 120 °C, aby czciowo usun zaadsorbowan wod. el krzemionkowy jest stosowany w chromatografii cieczowej równie jako nonik cieklych faz stacjonarnych (por.roz. III.2.4.4). 2.3.4. Klasyfikacja rozpuszczalników w normalnym ukladzie faz Rozpuszczalniki, które s skladnikami fazy ruchomej w chromatografii cieczowej wplywaj na rozdzielanie chromatograficzne ze wzgldu na ich polarno i selektywno. Rozpuszczalniki, które s bardziej polarne powoduj mniejsz retencj zwizków w chromatografii w normalnym ukladzie faz (NP). Efektywno wymywania zwizku z kolumny napelnionej polarn faz stacjonarn zaley od mocy elucyjnej (sily elucyjnej) rozpuszczalnika (0), która z kolei zaley od jego polarnoci (P') i mona j wyznaczy eksperymentalnie. Polarno rozpuszczalników wynosi od P'=0 dla niepolarnego rozpuszczalnika, jakim jest pentan, do P'=10,2 dla bardzo polarnej wody. W tab. 1 zamieszczone s wartoci P' oraz moc elucji popularnych rozpuszczalników, uywanych jako skladniki faz ruchomych w chromatografii cieczowej. Rozpuszczalniki sklasyfikowane wedlug wzrastajcej mocy elucyjnej nazywa si szeregiem eluotropowym rozpuszczalników.

162

Znajomo szeregu eluotropowego rozpuszczalników ulatwia dobranie odpowiedniej fazy ruchomej do rozdzielania chromatograficznego badanej mieszaniny zwizków. Wlaciwoci rozpuszczalnika, które wplywaj na selektywno to:

· · ·

wlaciwoci zasadowe, czyli zdolno do przyjmowania protonów (akceptor protonów), wlaciwoci kwasowe, czyli zdolno do oddawania protonów (donor protonów), zdolno do tworzenia dipoli.

Tabela 1. Wlaciwoci wybranych rozpuszczalników. Moc elucyjna rozpuszczalnika (0) jest podana dla elu krzemionkowego[ na podstawie Handbook of HPLC. Katz et al., 1998] Rozpuszczalnik n-Heptan n-Heksan Cykloheksan Czterochlorek wgla Eter izopropylowy Chloroform Chlorek metylenu Eter metylo-tert-butylowy Tetrahydrofuran Octan etylu Trietyloamina Acetonitryl Dioksan tert-Butanol n-Butanol Izopropanol Etanol Metanol Woda

0

0,00 0,00 0,11 0,32 0,26 0,30 0,47 0,53 0,48 0,52 0,51 0,60 0,70 -

P' 0,1 0,17 1,56 1,83 4,31 4,29 4,28 4,24 2,19 5,64 5,27 4,03 4,11 3,92 4,40 5,10 10,2

c

d

n

Grupa

0,26 0,51 0,31 0,27 0,41 0,36 0,66 0,33 0,37 0,56 0,54 0,57 0,52 0,48 0,37

0,40 0,10 0,35 0,33 0,19 0,22 0,08 0,25 0,23 0,20 0,18 0,17 0,19 0,22 0,37

0,34 0,39 0,34 0,40 0,40 0,42 0,26 0,42 0,40 0,24 0,28 0,26 0,29 0,31 0,26 VI II II II II II II VIII I VIII VII I III

163

Aby okreli udzial kadej z wlaciwoci w ogólnej polarnoci rozpuszczalnika (P') podzielono j na trzy parametry: c (akceptor protonów), d (donor protonów) oraz n (zdolno do tworzenia dipoli). Na przyklad dla chloroformu, który jest rednio polarnym rozpuszczalnikiem (P' = 4,31), wartoci poszczególnych parametrów wynosz: c = 0,31, d = 0,35, n = 0,34, co oznacza, e udzial wlaciwoci zasadowych wynosi 31%, udzial wlaciwoci kwasowych wynosi 35% za udzial oddzialywa dipolowych wynosi 34% (tabela 1). Rozpuszczalniki zostaly uporzdkowane i podzielone na grupy majce podobn selektywno. Klasyfikacja rozpuszczalników ze wzgldu na selektywno jest przedstawiana graficznie w postaci trójkta selektywnoci rozpuszczalników (rysunek 27).

akceptory H

II

d

I III VI V

c

IV VIII

VII

oddzialywania dipolowe

n

Rysunek 27. Trójkt selektywnoci rozpuszczalników Snydera [na podstawie Handbook of HPLC. Katz et al., 1998]

Grupy rozpuszczalników o podobnej selektywnoci zachodz na siebie. Przy wybieraniu rozpuszczalników, jako skladników fazy ruchomej naley przestrzega zasady, e jeeli rozpuszczalnik z jednej grupy nie ma dostatecznej selektywnoci to naley wybra drugi rozpuszczalnik z innej grupy, aby poprawi t selektywno. Dwa rozpuszczalniki z tej samej grupy maj podobn selektywno i zamienianie ich nie poprawi rozdzielania chromatograficznego. Na przyklad: zastosowanie eteru izopropylowego do separacji nie dalo zadowalajcej selektywnoci. Eter izopropylowy naley do grupy I, która znajduje blisko górnego rogu trójkta. Aby poprawi selektywno rozdzielania naley w drugiej próbie zastosowa rozpuszczalnik o odmiennych wlaciwociach, np. chlorek metylenu z grupy VII, która jest oddalona od grupy I. 164

Faza ruchoma jest czsto mieszanin rozpuszczalników. Jeeli uywa si mieszaniny dwóch rozpuszczalników, to rozpuszczalnik o mniejszej sile elucyjnej oznacza si liter A za rozpuszczalnik o wikszej mocy elucyjnej - B. W normalnym ukladzie faz, gdy niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym jest na przyklad heksan (A) a polarnym na przyklad propanol (B), to wzrost zawartoci % B w fazie ruchomej zmniejsza retencj badanego zwizku. Polarno (sila elucyjna) takiej mieszaniny jest korygowana poprzez zawarto rozpuszczalnika nieselektywnego takiego jak heksan lub inne nasycone wglowodory, które nie wplywaj na selektywno fazy ruchomej. 2.3.5. Dobór warunków rozdzielania w chromatografii kolumnowej na elu krzemionkowym za pomoc analizy TLC Warunki rozdzielania LC na elu krzemionkowym mona przetestowa i zaplanowa wczeniej za pomoc analizy TLC na plytkach pokrytych równie elem krzemionkowym. Byloby idealnie, gdyby charakterystyka zloa do LC jak i TLC byla identyczna, tzn. ten sam typ i rozmiar porów zloa. Róne ele krzemionkowe maj róne parametry. Jeeli nie dobierze si identycznego zloa w TLC i w LC, to dobór warunków rozdzielania za pomoc analizy TLC bdzie jedynie przyblieniem. Rozdzielanie w chromatografii kolumnowej zaley od fazy stacjonarnej oraz od fazy ruchomej. Skladniki fazy ruchomej dobieramy w taki sposób, aby uzyska najlepsz selektywno rozdzialu oraz dobra odpowiedni sil elucyjn fazy ruchomej. Faza ruchoma powinna by tak dobrana, aby uzyska wspólczynnik opónienia RF w zakresie 0,15 ­ 0,4 w analizie TLC dla interesujcych nas zwizków (rysunek 28). Rónica wspólczynników opónienia dla zwizków powinna by jak najwiksza; zadowalajce efekty uzyskuje si, gdy RF 0,15.

Rysunek 28. Optymalny zakres wspólczynnika opónienia wynosi od 0,15 (substancja pomaraczowa) do 0,4 (substancja niebieska) przy zastosowaniu wybranej fazy ruchomej Wspólczynnik RF = 1 oznacza, e badany zwizek eluuje z czolem fazy ruchomej w TLC i tak samo bdzie si zachowywal w LC. Opuci kolumn chromatograficzn po tym, jak opuci j jedna objto fazy ruchomej równa w tym przypadku objtoci retencji substancji niezatrzymywanej VM (dawniej 165

zwana objtoci martw lub objtoci zerow). Warto RF = 0,1 oznacza, e dystans, jaki badany zwizek pokonuje na plytce TLC od linii startu wynosi 1/10 dystansu, jaki pokonuje faza ruchoma. Czyli badany zwizek wymaga 10-krotnie wikszej objtoci fazy ruchomej (VR=10×VM, VR - objto retencji), aby opuci kolumn chromatograficzn. W doborze fazy ruchomej do LC na podstawie zachowania si zwizku w analizie TLC pomocna jest nastpujca zaleno:

VR = 1 V RF M

(52)

gdzie: VR ­ objto retencji substancji badanej, VM ­ objto retencji substancji niezatrzymywanej, RF ­ wspólczynnik opónienia substancji badanej. Zaleno t mona wyprowadzi z nastpujcych wzorów na wspólczynnik retencji:

k=

gdzie:

1 - RF RF

k =

VR - VM VM

(53, 54)

k ­ wspólczynnik retencji substancji badanej, VR ­ objto retencji substancji badanej, VM ­ objto retencji substancji niezatrzymywanej, RF ­ wspólczynnik opónienia substancji badanej. Objto retencji substancji niezatrzymywanej VM jest w przyblieniu równa objtoci fazy ruchomej znajdujcej si w kolumnie, czyli fazy ruchomej znajdujcej si pomidzy czstkami wypelnienia kolumny oraz wewntrz porów tyche czstek. W chromatografii niskocinieniowej objto fazy ruchomej w kolumnie oznacza si czsto symbolem CV (ang. column volume). W przykladzie przedstawionym na rys. 28, warto wspólczynnika opónienia zwizku pomaraczowego, wynoszca w analizie TLC - 0,15 (0,15 = VM/VR, ze wzoru 45) oznacza, e objto fazy ruchomej VR potrzebna do elucji tego zwizku z kolumny LC musi by 6,6 razy wiksza od objtoci retencji substancji niezatrzymywanej VM. Warto wspólczynnika opónienia zwizku niebieskiego, wynoszca w analizie TLC - 0,4 (0,4 = VM/VR) oznacza, e objto fazy ruchomej VR potrzebna do elucji tego zwizku z kolumny LC musi by 2,5 razy wiksza od objtoci retencji substancji niezatrzymywanej VM. Przyklad wyboru fazy ruchomej do elucji izokratycznej Rozpuszczalniki mog mie tak sam sil elucyjn a uzyskane wyniki rozdzielania mog by zupelnie róne. Wybór skladu fazy ruchomej dokonuje si najczciej w dwóch etapach: dobór rozpuszczalnika o najlepszej selektywnoci dla oznaczanych substancji, dobór odpowiedniej mocy elucyjnej fazy ruchomej, zawierajcej uprzednio wybrany, selektywny rozpuszczalnik. Proces wyboru skladu fazy ruchomej przedstawiono w poniszym przykladzie. 166

· ·

Rozdzielana próbka stanowi mieszanin czterech zwizków (A, B, C i D). W pierwszym etapie doboru skladu fazy ruchomej porównuje si rozpuszczalniki z rónych grup, korzystajc z trójkta selektywnoci rozpuszczalników (rysunek 27) i wykonuje analizy TLC w wybranych rozpuszczalnikach. Dla badanej mieszaniny wybrano cztery rozpuszczalniki i wykonano w nich analizy TLC:

· · · ·

octan etylu (TLC 1), eter diizopropylowy (TLC 2), chloroform (TLC 3), chlorek metylenu (TLC 4).

Wyniki wykonanych analiz przedstawiono na rysunku 29 oraz w tabeli 2. Na chromatogramie TLC 4 nie uzyskano separacji, co oznacza, e chlorek metylenu nie jest rozpuszczalnikiem o odpowiedniej selektywnoci do rozdzielenia badanych substancji. Najlepsze rozdzielenie (najlepsz selektywno) uzyskano przy zastosowaniu eteru diizopropylowego (TLC 2). Potwierdzaj to wyniki zebrane w tab. 2, w której zamieszczono wartoci RF dla badanych zwizków w kolejnych analizach oraz wyliczone (ze wzoru 45), odpowiadajce im wartoci VR i VR, jako krotnoci objto retencji substancji niezatrzymywanej VM. Najwiksze rónice w objtoci fazy ruchomej, potrzebnej do wymycia z kolumny kolejnych zwizków, uzyska si stosujc eter diizopropylowy.

Rysunek 29. Analizy TLC mieszaniny zawierajcej zwizki: A, B, C i D przy zastosowaniu czterech rónych faz ruchomych: 1, 2, 3, i 4 [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005] Tabela 2. Wyniki analizy TLC mieszaniny zawierajcej zwizki A, B, C i D przy zastosowaniu trzech rónych faz ruchomych [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005] TLC 1 VR 1,8 2,3 0,2 C D 0,40 0,16 2,5 3,7 6,2 0,08 12,5 0,27 3,7 8,8 0,19 5,3 TLC 2 VR 1,8 2,4 1,3 0,35 2,9 2,4 TLC 3 VR 1,7 1,8 1,1

Zwizek A B

RF 0,54 0,43

VR

RF 0,56 0,42

VR

RF 0,6 0,55

VR

0,5

0,6

0,1

167

W drugim etapie dobiera si odpowiedni moc elucyjn fazy ruchomej. Moc elucyjn fazy ruchomej mona dopasowa poprzez dodanie do niej rozpuszczalnika nieselektywnego o malej mocy elucyjnej, na przyklad niskowrzcego wglowodoru nasyconego, który nie wplywa na selektywno fazy ruchomej (eteru diizopropylowego). W podanym powyej przykladzie, z mieszaniny naley wydzieli zwizek B oraz zwizek C. Optymalny zakres wartoci wspólczynnika opónienia RF to 0,15 ­ 0,4. Z tab. 2 wynika, e sil elucyjn fazy ruchomej naley zmniejszy. Do tego celu wybrano heksan i wykonano kolejn analiz TLC badanej mieszaniny przy uyciu fazy ruchomej o skladzie: heksan-eter diizopropylowy (3:1, v/v).Wynik tej analizy przedstawiono na rys. 30 oraz w tab. 3. Uzyskano, mieszczce si w optymalnym zakresie, wartoci wspólczynnika opónienia RF nie tylko dla substancji B i C, ale i dla pozostalych, przy zachowaniu odpowiedniej selektywnoci rozdzielania. Wynikajce z wartoci RF objtoci retencji VR dla substancji A, B, i C s równie optymalne. Nie jest konieczne wymywanie substancji D du objtoci fazy ruchomej (25,2 x VM), gdy stanowi ona w podawanym przykladzie substancj zbdn. W ten sposób dobrana faza ruchoma pozwala rozdzieli na kolumnie chromatograficznej wybrane zwizki B i C z odpowiedni selektywnoci oraz przy uyciu optymalnych objtoci fazy ruchomej potrzebnych do ich elucji z kolumny. Tabela 3. Wyniki analizy TLC mieszaniny zawierajcej zwizki A, B, C i D przy zastosowaniu fazy ruchomej: heksan-eter diizopropylowy (3:1, v/v) [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005] Zwizek A B C D RF 0,37 0,25 0,12 0,04 VR 2,7 4,0 8,4 25,2

Rysunek 30. Analiza TLC mieszaniny zawierajcej zwizki: A, B, C i D przy zastosowaniu fazy ruchomej: heksan-eter diizopropylowy (3:1, v/v) [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005]

168

Przyklad wyboru fazy ruchomej do elucji gradientowej Przedstawiony wczeniej przyklad dotyczyl elucji izokratycznej, czyli takiej, gdzie sklad fazy ruchomej jest staly w cigu calego rozdzielania chromatograficznego. Jeeli zwizki róni si mocno polarnoci to trudno jest dobra taki sklad fazy ruchomej, aby uzyska sil elucyjn odpowiedni dla wszystkich skladników próbki. W takim przypadku stosuje si w chromatografii kolumnowej elucj gradientow. Sposób postpowania jest nastpujcy:

· ·

·

dobranie w analizie TLC rozpuszczalnika z odpowiedni selektywnoci, dobranie kilku faz ruchomych, skladajcych si z wybranego rozpuszczalnika selektywnego (skladnik B) i niepolarnego rozpuszczalnika organicznego (skladnik A, obniajcy moc elucji), ale rónicych si sil elucyjn dziki zastosowaniu rónego skladu procentowego (na przyklad 2% B, 5% B, 10% B, 25% B itd.) mieszaniny, sprawdzenie w analizie TLC zaproponowanych faz ruchomych a nastpnie wybranie takiej sekwencji rozpuszczalników, która pozwoli optymalnie wyeluowa badane zwizki.

Proces rozdzielania mieszaniny zwizków na kolumnie chromatograficznej wykonuje si, stosujc kolejno mieszaniny rozpuszczalników o zwikszajcej si sile elucyjnej, uzyskanej dziki zwikszajcej si procentowej zawartoci rozpuszczalnika bardziej polarnego (%B). 2.4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa 2.4.1. Wstp Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest szeroko stosowan nowoczesn technik separacyjn. Z punktu widzenia mechanizmu separacji, HPLC mona najogólniej podzieli na nastpujce rodzaje:

· · · · ·

chromatografi adsorpcyjn, chromatografi podzialow, chromatografi jonow, chromatografi wykluczania, chromatografi powinowactwa.

Wybierajc odpowiedni metod chromatograficzn naley rozway wybrane informacje o badanej próbce i jej skladnikach, takie jak: chemiczna budowa skladników próbki, masy czsteczkowe, stenia i liczebno skladników, rozpuszczalno, widma UV-Vis skladników a take inne dostpne. Po zebraniu informacji, dla ulatwienia wyboru odpowiedniej techniki chromatograficznej, stosuje si pewne zasady. Glównymi kryteriami wyboru metody chromatograficznej s wielko czsteczek rozdzielanych zwizków i ich rozpuszczalno w wodzie.

Jeli skladniki próbki, maj masy czsteczkowe mniejsze ni 2000 daltonów, to w przypadku próbki nierozpuszczalnej w wodzie i zawierajcej zwizki alifatyczne bd aromatyczne ­ stosuje si:

·

chromatografi adsorpcyjn do separacji zwizków na grupy (analiza grupowa) lub do separacji izomerów, 169

·

chromatografi podzialow w odwróconym ukladzie faz do separacji zwizków z grup homologicznych.

Jeli próbka jest rozpuszczalna w wodzie i zawiera zwizki obdarzone ladunkiem (jony lub formy zdysocjowane) ­ stosuje si chromatografi jonow. W przypadku skladników próbki, których masy czsteczkowe przekraczaj 2000 daltonów, stosuje si chromatografi wykluczania, która jest najlepszym wyborem:

· ·

dla próbek rozpuszczalnych w wodzie ­ uywa si roztworów wodnych, jako fazy ruchomej, dla próbek nierozpuszczalnych w wodzie, jako faz ruchom stosuje si inne, odpowiednie rozpuszczalniki.

Chromatografia powinowactwa jest stosowana do separacji próbek pochodzenia biologicznego. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) charakteryzuje si wysok sprawnoci, dobr rozdzielczoci, krótkim czasem analizy oraz stosowaniem wysokich cinie. W tabeli 4 przedstawiono porównanie niektórych parametrów kolumn chromatograficznych, stosowanych w chromatografii niskocinieniowej i wysokosprawnej. Tabela 4. Porównanie przykladowych parametrów kolumn do chromatografii cieczowej niskocinieniowej i wysokosprawnej Chromatografia niskocinieniowa 100­600 10­100 20­50 <100 0,001­0,01 Wysokosprawna chromatografia cieczowa 5 25 4,6 15000 5­20

Parametr Rozmiar czstek wypelnienia kolumny [µm] Dlugo kolumny [cm] rednica wewntrzna kolumny [mm] Sprawno [liczba pólek/m] Cinienie na wlocie kolumny [MPa]

Zasadnicz rónic pomidzy chromatografi kolumnow niskocinieniow a chromatografi wysokosprawn jest rozmiar czstek wypelnienia kolumny. W HPLC stosuje si drobne ziarna wypelnienia, o wymiarach rzdu 5 µm lub mniejsze. Tak male ich rozmiary poprawiaj upakowanie kolumny, co zdecydowanie zmniejsza dyfuzj wirow i pozwala osign wysok sprawno kolumny. Maly rozmiar ziaren wypelnienia wymaga jednoczenie stosowania wysokiego cinienia, aby wymusi przeplyw fazy ruchomej przez kolumn. 2.4.2. Aparatura Analiz zwizków chemicznych technik wysokosprawnej chromatografii cieczowej wykonuje si przy uyciu chromatografów cieczowych. Schemat chromatografu cieczowego przedstawiono na rysunku 31. Podstawowymi czciami kadego chromatografu cieczowego s:

· · · · ·

zbiornik fazy ruchomej, pompa, dozownik, kolumna, detektor, 170

·

komputer lub rejestrator.

Zasada dzialania chromatografu cieczowego jest nastpujca. Faza ruchoma jest pobierana przez pomp (3) ze zbiorników (1 lub/i 2) i nastpnie tloczona pod cinieniem poprzez dozownik (4) do kolumny chromatograficznej (5) i dalej do detektora (6). Próbk (x) w postaci roztworu wprowadza si do strumienia fazy ruchomej w dozowniku. Skladniki próbki wraz z faz ruchom przedostaj si do kolumny, gdzie s rozdzielane, po czym trafiaj wraz z faz ruchom do detektora. Detektor wykrywa skladniki próbki w fazie ruchomej i wysyla sygnal do komputera (7), w którym jest on zapisywany w postaci pików chromatograficznych, tworzc chromatogram (8). Kolumna dodatkowo moe by umieszczana w termostacie.

x 8 7 5 1 2 3 6

4

Rysunek 31. Schemat blokowy chromatografu cieczowego HPLC. 1, 2 ­ zbiorniki skladników fazy ruchomej, 3 ­ pompa, 4 ­ dozownik, 5 ­ kolumna, 6 ­ detektor, 7 ­ komputer lub rejestrator (linia zielona pokazuje drog fazy ruchomej, linia czerwona ­ drog rozdzielanej próbki; obie drogi lcz si w dozowniku) Chromatografy cieczowe s wyposaone w dozowniki umoliwiajce wprowadzenie cieklych próbek pod cinieniem atmosferycznym do kolumny, w której panuje zwikszone cinienie nawet rzdu kilkudziesiciu MPa. Próbk dozuje si przy uyciu szklanej mikrostrzykawki (rysunek 32), której igla ma tpo zakoczony koniec.

Próbka

!

Igla strzykawki Tloczek

Rysunek 32. Mikrostrzykawka do odmierzania malych objtoci cieczy (Uwaga! Koniec igly mikrostrzykawki stosowanej do dozowania próbki w HPLC jest tpo zakoczony)

171

Najczciej stosuje si szeciodrone zawory dozujce (rysunek 33). Kierunek przeplywu fazy ruchomej przez dozownik zaley od poloenia dwigni zaworu:

· ·

pozycja A (LOAD) ­ faza ruchoma omija ptl dozujc, mona j przepluka i napelni za pomoc szklanej mikrostrzykawki; w ptli panuje cinienie atmosferyczne, pozycja B (INJECT) ­ faza ruchoma przeplywa przez ptl dozujc i zabiera ze sob znajdujc si w ptli próbk wprowadzajc j jednoczenie do kolumny; jest to pocztek analizy chromatograficznej.

Ciekaw animacj pokazujc proces dozowania próbki na kolumn za pomoc zaworu dozujcego mona obejrze w Internecie: http://www.restek.com/info_sixport.asp

Rysunek 33. Dozownik HPLC ­ zasada dzialania; (a) - wprowadzanie próbki za pomoc mikrostrzykawki do ptli oraz (b) - dozowanie do kolumny Kolumna chromatograficzna jest zasadniczym elementem chromatografu ­ w niej zachodzi proces rozdzielenia skladników wprowadzonej próbki. Kolumny stosowane w HPLC s wykonane ze stali i fabrycznie wypelnione faz stacjonarn (rysunek 34). Uywane s kolumny o rónych wymiarach, najczciej o dlugoci od 10 do 30 cm i o rednicy od 4 do 5 mm. Czstki wypelnienia kolumny maj zazwyczaj rednic okolo 3 do 6 µm. Wspólczenie jednak coraz popularniejsze staj si zminiaturyzowane formy kolumn chromatograficznych, zwlaszcza przy zastosowaniu tzw. ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), gdzie dlugo kolumn nie przekracza 2,5 cm, a czstki wypelnienia maj rednic poniej 2µm.

172

Rysunek 34. Kolumny HPLC W chromatografii cieczowej stosuje si róne typy detektorów do wykrywania okrelonych grup zwizków chemicznych. S to przede wszystkim detektory spektrofotometryczne. Ich zasada dzialania polega na rejestrowaniu rónicy wlaciwoci fazy ruchomej oraz poszczególnych skladników chromatografowanej próbki. Faza ruchoma opuszczajc kolumn chromatograficzn przeplywa przez przeplywow komórk pomiarow w detektorze. Pojemno takiej komórki jest bardzo mala, rzdu 0,01 ­ 10 µl. Najczciej stosowanym detektorem jest detektor spektrofotometryczny UV. Mierzy on absorpcj promieniowania w zakresie UV/Vis zgodnie ze znanym prawem Lamberta-Beera:

I = I 0 10 -bc

gdzie: I ­ natenie promieniowania po przejciu przez komórk pomiarow detektora, I0 ­ natenie promieniowania przed komórk pomiarow detektora, ­ wspólczynnik absorpcji, b ­ dlugo celki pomiarowej, c ­ stenie badanej substancji w fazie ruchomej w komórce pomiarowej detektora. Detektor rejestruje bezporednio absorbancj A i podaje j jako warto bezwymiarow:

(55)

A = log

gdzie:

I0 I

(56)

A ­ absorbancja, I ­ natenie promieniowania po przejciu przez komórk pomiarow detektora, I0 ­ natenie promieniowania przed komórk pomiarow detektora. Warunkiem stosowania detektora spektrofotometrycznego UV jest zdolno badanych substancji do pochlaniania promieniowania UV. Absorpcja promieniowania z zakresu UV/Vis przez czsteczk zwizku chemicznego zwizana jest z przejciami elektronów wiza pojedynczych (), wiza wielokrotnych () oraz elektronów wolnych par elektronowych (n) z orbitalu o niszej energii na wolny orbital o wyszej energii. Przejcia elektronów wiza pojedynczych ( *) wymagaj najwyszej energii, która odpowiada zakresowi fal poniej 200 nm. W detektorach UV nie 173

wykorzystuje si zakresu promieniowania poniej 190 nm, gdy wymagaloby to ukladu próniowego. W detektorach takich wykorzystuje si natomiast absorpcj promieniowania przez ugrupowania chromoforowe. Typowymi chromoforami s sprzone wizania podwójne wgiel-wgiel i wgielheteroatom oraz ugrupowania aromatyczne, w których pochlanianie energii w zakresie UV/Vis zwizane jest z przejciami elektronów oraz n na orbital *. Aby moliwe bylo przeprowadzenie pomiaru detektorem UV/Vis w chromatografii cieczowej, faza ruchoma nie powinna absorbowa promieniowania przy zastosowanej dlugoci fali. Najprostsze detektory umoliwiaj wykrywanie rozdzielanych zwizków przy jednej dlugoci fali ­ 254 nm, natomiast inne umoliwiaj plynn regulacj dlugoci fali w zakresie UV/Vis. Popularne s równie detektory z matryc fotodiodow (ang. diode array detector, DAD). Detektor DAD umoliwia rejestracj calego widma badanej substancji w trakcie jej przechodzenia przez detektor, dziki czemu mona j zidentyfikowa. Detektor spektrofotometryczny UV jest niewraliwy na zmiany przeplywu fazy ruchomej i zmiany temperatury. Moe by take stosowany w elucji gradientowej. Detektor refraktometryczny jest detektorem uniwersalnym. Wykonuje nim si pomiar rónicy midzy wspólczynnikiem zalamania wiatla fazy ruchomej oraz rozdzielanych substancji. W detektorze refraktometrycznym znajduj si dwie komórki pomiarowe:

· ·

przez jedn przeplywa ,,czysta" faza ruchoma (eluent), przez drug przeplywa faza ruchoma opuszczajca kolumn zawierajca substancje rozdzielane (eluat z kolumny).

Im wiksza jest rónica wspólczynników zalamania wiatla midzy faz ruchom a substancj, tym lepsza jest czulo detektora. Im wiksze stenie substancji rozdzielanej, tym wiksza rónica wspólczynników zalamania wiatla i tym wikszy sygnal z detektora. Detektor refraktometryczny moe by stosowany jedynie w elucji izokratycznej, w elucji gradientowej cigla zmiana skladu fazy ruchomej powodowalaby cigl zmian wspólczynnika zalamania wiatla. Zmienno wartoci wspólczynnika zalamania wiatla powoduj równie zmiany przeplywu fazy ruchomej i zmiany temperatury, dlatego detektor refraktometryczny musi by termostatowany. Detektory refraktometryczne stosuje si midzy innymi do analiz wglowodanów. Detektor konduktometryczny (przewodnociowy) stosuje si do detekcji zwizków obdarzonych ladunkiem. Detektor konduktometryczny mierzy zmiany przewodnictwa eluatu w porównaniu z eluentem, czyli ,,czyst" faz ruchom. Pomiar polega na zmierzeniu przewodnoci cieczy znajdujcej si pomidzy dwoma elektrodami, do których podlcza si zmienne napicie. Przewodno wlaciwa jest liniow funkcj stenia rozcieczonego elektrolitu i dlatego detektor konduktometryczny znalazl zastosowanie w chromatografii jonowej. Zgodnie ze znanym prawem Kohlrauscha, przewodno elektryczna rozcieczonych roztworów elektrolitów jest sum przewodnoci poszczególnych jonów w roztworze pomnoonych przez ich wartociowoci i stenia:

=

gdzie:

0 zici i

1000

(57)

­ przewodno wlaciwa [µS/cm], 0i ­ graniczna przewodno molowa [Scm2/mol],

174

zi ­ wartociowo jonu, ci ­ stenie molowe jonu [mol/L]. 2.4.3. Chromatografia adsorpcyjna Chromatografia adsorpcyjna zachodzi w ukladzie ciecz-cialo stale (LSC, ang. liquid-solid chromatography). Faz stacjonarn jest adsorbent - cialo stale. W chromatografii adsorpcyjnej czsteczki substancji rozdzielanej konkuruj z czsteczkami fazy ruchomej o miejsca adsorpcji na powierzchni fazy stacjonarnej. Im silniejsza adsorpcja czsteczek fazy ruchomej na powierzchni fazy stacjonarnej tym mniejsza adsorpcja czsteczek substancji rozdzielanych. Czyli im oddzialywanie czsteczek fazy ruchomej z powierzchni fazy stacjonarnej jest silniejsze, tym latwiej wypieraj one z tej powierzchni czsteczki substancji zaadsorbowanej. Efektywno wymywania substancji z adsorbentu zaley od mocy elucyjnej fazy ruchomej. Im moc elucyjna fazy ruchomej jest wiksza tym czasy retencji substancji rozdzielanych s nisze. Uszeregowanie rozpuszczalników wg wzrastajcej mocy elucyjnej nosi miano szeregu eluotropowego (por.roz. III.2.3.4.). Faz stacjonarn w chromatografii adsorpcyjnej jest najczciej el krzemionkowy (por.roz. III.2.3.3.), rzadziej tlenek glinu bd wgiel aktywny. el krzemionkowy ma charakter polarny i stosowany jest jako faza stacjonarna w chromatografii w normalnym ukladzie faz. W takim przypadku kolejno elucji substancji rozdzielanych na kolumnie zaley od ich polarnoci. Substancje o niskiej polarnoci eluuj si pierwsze a nastpnie eluuj te o wikszej polarnoci. Fazy ruchome uywane w chromatografii w normalnym ukladzie faz zostaly opisane w rozdziale 2.3.4. Chromatografia adsorpcyjna pozwala na rozdzial mieszaniny zwizków na klasy zwizków o tych samych grupach funkcyjnych (analiza grupowa). Na przyklad, z uyciem tej techniki mona wydzieli klas wielopiercieniowych wglowodorów aromatycznych od wglowodorów alifatycznych. Z drugiej strony nie mona rozdzieli grupy wglowodorów alifatycznych na pojedyncze zwizki homologiczne. Chromatografia adsorpcyjna jest stosowana równie do rozdzielania izomerów strukturalnych, które róni si przestrzennym rozmieszczeniem grup funkcyjnych w czsteczkach, w odniesieniu do miejsc adsorpcji na powierzchni elu krzemionkowego. 2.4.4. Chromatografia podzialowa Chromatografia podzialowa zachodzi w ukladzie ciecz-ciecz (LLC, ang. liquid-liquid chromatography). Faz stacjonarn jest ciecz zwizana chemicznie z cialem stalym, które jest jej nonikiem. Obie ciecze, faza ruchoma i faza stacjonarna, nie mog wzajemnie rozpuszcza si w sobie, aby mógl powsta uklad dwufazowy. Ten warunek jest spelniony, gdy jedna faza jest polarna a druga niepolarna, lub odwrotnie. 175

Podstawowym nonikiem fazy stacjonarnej jest mikroporowaty el krzemionkowy o niewielkich ziarnach (3, 5 lub 10 µm). Sam el krzemionkowy jest stosowany jako faza stacjonarna w chromatografii adsorpcyjnej, natomiast w chromatografii podzialowej jest jedynie nonikiem, z którym faza stacjonarna jest chemicznie zwizana. Na powierzchni elu krzemionkowego znajduj si grupy silanolowe (Si-OH) zdolne do rónego typu reakcji chemicznych. W reakcji elu krzemionkowego z pochodnymi chlorosilanów powstaje wizanie silanolowe (silikonowe) wg poniej reakcji: Si-OH + Cl-Si(CH3)2R Si-O-Si(CH3)2R +HCl W wyniku tych reakcji, grupy hydroksylowe obecne na powierzchni elu krzemionkowego s zastpowane nowymi grupami: alkilowymi, fenylowymi, cyjanopropylowymi lub propyloaminowymi. Reakcje te slu do otrzymywania faz stacjonarnych niepolarnych oraz faz stacjonarnych polarnych. Taki typ faz stacjonarnych nazywa si ogólnie fazami zwizanymi. Mechanizm separacji zwizków na fazach stacjonarnych zwizanych ma glównie charakter podzialowy, std nazwa - chromatografia podzialowa. W chromatografii podzialowej rozdzielanie skladników próbki jest wynikiem ich rónej rozpuszczalnoci w fazach chromatograficznych. Jednake nie wszystkie grupy hydroksylowe na powierzchni elu krzemionkowego s zastpowane nowymi grupami i w konsekwencji powierzchnia elu krzemionkowego jest pokryta zwizanymi grupami oraz wolnymi grupami silanolowymi. Te grupy silanolowe, chocia czciowo ekranowane grupami organicznymi, mog jednak wplywa na proces rozdzielania chromatograficznego. Std chromatografia na fazach zwizanych przebiega w pewnym stopniu równie przy udziale procesów adsorpcyjnych. W zalenoci od tego, jakie grupy (niepolarne czy polarne) zastosuje si do modyfikacji powierzchni elu krzemionkowego, otrzymuje si:

· ·

faz stacjonarn niepolarn, stosowan w chromatografii w odwróconym ukladzie faz (RP), faz stacjonarn polarn, stosowan w chromatografii w normalnym ukladzie faz (NP).

Chromatografia w odwróconym ukladzie faz W chromatografii w odwróconym ukladzie faz najczciej stosowana jest zwizana faza oktadecylosilanowa (oznaczana skrótami: ODS, RP-18 lub C18), w której grupy alkilowe na powierzchni elu krzemionkowego maj 18 atomów wgla w lacuchach (rysunek 35). Te lacuchy alkilowe maj charakter hydrofobowy a wic zwizana faza stacjonarna bdzie równie niepolarna. Lacuch alkilowy moe by take zakoczony grup fenylow (-C6H5) lub dwoma grupami fenylowymi. Separacja substancji za pomoc chromatografii w odwróconym ukladzie faz jest podobna do ekstrakcji rónych substancji z wody do rozpuszczalnika organicznego, takiego jak na przyklad oktanol (por.roz. I.2.4). Substancje hydrofobowe (niepolarne) przechodz do niepolarnego rozpuszczalnika. Faza stacjonarna oktadecylosilanowa jest mniej polarna ni faza ruchoma o skladzie woda-metanol lub woda-acetonitryl.

176

Rysunek 35. Zwizana faza oktadecylosilanowa Substancje bardziej hydrofobowe s silniej zatrzymywane w fazie stacjonarnej i eluuj z kolumny póniej ni substancje bardziej polarne. Na przyklad wglowodory s silniej zatrzymywane na kolumnie ni alkohole. Wzrost zawartoci wody w fazie ruchomej powoduje wydluenie czasów retencji zwizków rozdzielanych i odwrotnie ­ wzrost zawartoci metanolu lub acetonitrylu (skladnika organicznego) w fazie ruchomej powoduje skrócenie czasów retencji zwizków rozdzielanych w chromatografii w odwróconym ukladzie faz. Chromatografia w odwróconym ukladzie faz jest stosowana do rozdzielania wikszoci zwizków organicznych. Pozwala na rozdzielenie mieszaniny zwizków na pojedyncze zwizki homologiczne. Z szeregu homologicznego wglowodorów, pierwsze eluuj si wglowodory o mniejszych masach czsteczkowych a potem te o wikszych masach czsteczkowych. Rozpuszczalno wglowodorów o mniejszych masach czsteczkowych w polarnej fazie ruchomej jest wiksza ni tych o wikszych masach czsteczkowych, które s silniej zatrzymywane w niepolarnej fazie stacjonarnej. Chromatografia w normalnym ukladzie faz Zwizane fazy stacjonarne o charakterze hydrofilowym (redniopolarne), które mona stosowa w chromatografii w normalnym ukladzie faz to:

· ·

fazy z grupami cyjanopropylowymi: fazy z grupami propyloaminowymi:

-(CH2)3-CN, -(CH2)3-NH2.

Fazy ruchome uywane w chromatografii w normalnym ukladzie faz zostaly opisane w rozdziale III.2.3.4. 2.4.5. Chromatografia jonowa Chromatografia jonowa jest odmian wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosowan do separacji i analizy anionów i kationów oraz innych zwizków chemicznych w formie zdysocjowanej.

177

Chromatografi jonow stosuje si midzy innymi do oznaczania anionów i kationów w wodach i ciekach. Zalety chromatografii jonowej:

· · · · · · · ·

moliwo jednoczesnego oznaczania kilkunastu jonów, moliwo oznaczania jednoczenie kationów i anionów, moliwo oznaczania jonów pierwiastka na rónych stopniach utlenienia (analiza specjacyjna), wykrywalno jonów na poziomie µmol/l lub mniejszym, wysoka selektywno oznaczania jonów w próbkach o zloonym skladzie, niewielka ilo próbki potrzebna do analizy, prosty sposób przygotowania próbek do analizy, krótki czas analizy.

Chromatografia jonowa róni si od innych rodzajów wysokosprawnej chromatografii cieczowej rodzajem stosowanych wypelnie kolumn, rodzajem eluentów oraz ewentualnie stosowaniem dodatkowego urzdzenia (kolumny tlumienia lub supresora) do obniania przewodnoci elektrycznej eluentu. Chromatografi jonow dzieli si na dwa rodzaje:

· ·

chromatografi jonow z tlumieniem przewodnoci fazy ruchomej, chromatografi jonow bez tlumienia przewodnoci fazy ruchomej.

Jeeli stosuje si obnianie przewodnoci elektrycznej eluentu to jest to chromatografia jonowa z tlumieniem przewodnoci. W chromatografii jonowej bez tlumienia przewodnoci nie ma potrzeby stosowania ani supresora, ani kolumny tlumienia. Eluent jest tak dobrany, aby jego przewodno byla odpowiednio niska i umoliwiala detekcj konduktometryczn jonów próbki. Chromatografia jonowa bez tlumienia przewodnoci jest stosowana rzadko; dominuje stosowanie chromatografii jonowej z tlumieniem przewodnoci i ten rodzaj chromatografii zostanie opisany poniej. Ze wzgldu na agresywne dzialanie faz ruchomych (eluentów), zwykly chromatograf HPLC zbudowany z metalowych czci, nie nadaje si do stosowania w chromatografii jonowej. Chromatograf jonowy sklada si z nastpujcych czci:

· · · · · · · ·

zbiornik fazy ruchomej, pompa, dozownik, przedkolumna, kolumna analityczna, supresor lub kolumna tlumienia, detektor, komputer lub rejestrator.

Zasada dzialania chromatografu jonowego jest nastpujca. Faza ruchoma jest pobierana przez pomp ze zbiornika i nastpnie tloczona pod cinieniem poprzez dozownik i przedkolumn do kolumny chromatograficznej. Próbk wprowadza si do strumienia fazy ruchomej w dozowniku. Jony obecne w próbce s rozdzielane na kolumnie. Eluat przechodzi do supresora (lub do kolumny tlumienia), gdzie w wyniku reakcji chemicznych przewodno elektryczna eluentu ulega obnieniu. Dziki temu przewodno elektryczna jonów próbki jest wysoka w porównaniu do obnionej

178

przewodnoci elektrycznej jonów eluentu. Umoliwia to odrónienie jonów próbki od jonów eluentu i ich detekcj w detektorze konduktometrycznym. Detektor wysyla sygnaly do komputera, w którym s one zapisywane w postaci pików chromatograficznych, tworzc chromatogram. W chromatografii jonowej wystpuj nastpujce mechanizmy rozdzielania jonów:

· · ·

wymiana jonowa, wykluczanie jonów, tworzenie par jonowych.

Chromatografia wymiany jonowej jest nazywana po prostu chromatografi jonow (IC), podczas gdy chromatografia par jonowych (IPC) i chromatografia wykluczania jonowego (IEC) s uwaane za techniki bardziej wyspecjalizowane. Wysokosprawna chromatografia jonowa W wysokosprawnej chromatografii jonowej zachodzi mechanizm wymiany jonowej (rysunek 36), która polega na wymianie jonów pomidzy roztworem a jonitem. Jonity, inaczej wymieniacze jonowe, s to stale substancje nieorganiczne lub organiczne zawierajce jony zdolne do wymiany na inne jony o tym samym ladunku, znajdujce si w roztworze, w którym wymieniacze jonowe s nierozpuszczalne. Jonity s wielkoczsteczkowymi cialami stalymi o strukturze przestrzennej usieciowanej. Maj zdolno wymiany jonów z roztworem, w którym si znajduj. We wspólczesnej chromatografii jonowej stosuje si jonity syntetyczne, czyli wielkoczsteczkowe polimery organiczne z wbudowanymi grupami funkcyjnymi, zdolnymi do wymiany jonów w roztworze elektrolitu. S nierozpuszczalne w wodzie i w wikszoci rozpuszczalników organicznych. Najczciej s to kopolimery styrenu i diwinylolobenzenu (PS/DVB). Jonity skladaj si z kulistych czsteczek polimerów o rednicy od 5 do 15 µm. Jonity dzieli si na nastpujce rodzaje:

· · · ·

kationity - grupami funkcyjnymi s kationy zdolne do wymiany; jeeli kationit jest polimerem organicznym to stosuje si równie nazw ywica kationowymnienna, anionity - grupami funkcyjnymi s aniony zdolne do wymiany; jeeli anionit jest polimerem organicznym to stosuje si równie nazw ywica anionowymnienna, wymieniacze amfoteryczne - w zalenoci od pH roztworu maj zdolno wymiany anionów albo kationów, wymieniacze bipolarne - mog jednoczenie wymienia aniony i kationy.

O wlaciwociach kolumny wypelnionej ywic jonowymienn decyduje rodzaj ywicy, stopie jej usieciowania, rodzaj i ilo grup jonowymiennych, stopie oddzialywa hydrofobowych oraz wielko czstek wypelnienia. Faza stacjonarna w wysokosprawnej chromatografii jonowej jest jonitem z grupami funkcyjnymi o stalym ladunku, w których bezporednim otoczeniu znajduj si odpowiednie przeciwjony, zapewniajce 179

elektryczn obojtno ukladu. Zwykle przeciwjon pochodzi z fazy ruchomej i dlatego te jest nazywany jonem eluentu. Przy wymianie anionów grupami funkcyjnymi s czwartorzdowe zasady amoniowe, za przy wymianie kationów - grupy sulfonowe lub karboksylowe. Przeciwjon moe by wymieniony przez jon substancji analizowanej, który zostanie czasowo zatrzymany w kolumnie. Jony skladników analizowanej próbk i róni si pomidzy sob czasem przebywania w kolumnie wynikajcym z ich rónego powinowactwa do fazy stacjonarnej. Na rysunku 36 pokazano schematycznie procesy wymiany jonowej. W chromatografii jonowej czas retencji analizowanych jonów zaley przede wszystkim od liczby i rodzaju grup funkcyjnych zwizanych na powierzchni jonitu, ale take od sily jonowej i rodzaju eluentu oraz pH eluentu. Ogólne zasady elucji w chromatografii jonowej:

·

· ·

ze wzrostem wartociowoci jonu analitu zwiksza si jego powinowactwo do grupy funkcyjnej jonitu - jony trójwartociowe s silniej wizane ni jony dwuwartociowe, dla elucji jonów trójwartociowych trzeba uy eluentu o wikszej sile jonowej ni dla dwuwartociowych, jeeli analizowane jony maj t sam wartociowo, to im wikszy jest promie jonowy i stopie polaryzacji, tym silniej jon jest zatrzymywany na jonicie, jony analitów, charakteryzujcych si silnymi oddzialywaniami hydrofobowymi lub van der Waalsa z faz stacjonarn, bd eluowaly póniej ni jony o slabszych oddzialywaniach, na przyklad jony polczone z piercieniem aromatycznym bd si silniej wiza z ywic polistyrenow ni pozostale jony, nieposiadajce ukladu aromatycznego.

Rysunek 36. Mechanizm wymiany jonowej (A ­ jony analitu, E ­ jony eluentu) [na podstawie Praktyczna chromatografia jonowa. Viehweger K. H. (red.), Metrohm]

180

Podobnie jak we wszystkich rozdzieleniach metod chromatografii cieczowej, równie w chromatografii jonowej faza ruchoma wplywa na separacj analitów. Dobiera si rodzaj przeciwjonu, pH oraz sil jonow eluentu. Dla mocnych kationitów i anionitów im wysza sila jonowa eluentu, tym wysza jego sila elucyjna. Natomiast pH eluentu powinno by tak dopasowane, aby zapewnialo dysocjacj jonów analitu oraz jonów zwizanych z powierzchni jonitu. Eluentami stosowanymi do rozdzielania anionów w chromatografii jonowej z tlumieniem przewodnoci s najczciej wodne roztwory wglanu sodu Na2CO3, wodorowglanu sodu NaHCO3 lub ich mieszaniny (elucja izokratyczna) lub wodne roztwory NaOH lub Na2B4O7 (elucja gradientowa). Do oznaczania kationów eluentami s glównie kwasy mineralne, takie jak HCl lub HNO3. Wysokosprawna chromatografia wykluczania jonowego W chromatografii wykluczania jonowego wykorzystane jest zjawisko równowagi membranowej Donnana. Równowaga membranowa Donnana jest to stan ustalajcy si midzy dwoma roztworami przedzielonymi membran pólprzepuszczaln. W chromatografii wykluczania jonowego funkcj pólprzepuszczalnej membrany pelni porowaty wymieniacz jonowy. Oddziela on wodn faz ruchom od wodnej fazy stacjonarnej zawartej w porach wymieniacza. Membrana jest przepuszczalna tylko dla zwizków niezjonizowanych lub slabo zjonizowanych. Ulegaj one podzialowi pomidzy faz stacjonarn i faz ruchom a tym samym wolniej migruj przez kolumn. Natomiast jony, które nie wnikaj do wntrza porów wypelnienia kolumny, nie s zatrzymywane przez kolumn.

Rysunek 37. Mechanizm wykluczania Donnana w chromatografii wykluczania jonowego na przykladzie kwasu karboksylowego [na podstawie Praktyczna chromatografia jonowa. Viehweger K. H. (red.), Metrohm] Najwaniejszym zastosowaniem chromatografii wykluczania jonowego jest analiza slabych kwasów, takich jak kwasy karboksylowe, lub zasad. Na rysunku 37 pokazano mechanizm separacji metod IEC na przykladzie kwasu karboksylowego R-COOH. Wypelnieniem kolumny jest sulfonowany wymieniacz kationowy, którego grupy sulfonowe z protonami, jako jonami przeciwnymi s elektrycznie obojtne. Grupy funkcyjne s uwodnione za uwodniona warstwa jest ograniczona przez hipotetyczn, ujemnie 181

naladowan membran Donnana. Przez membran przenika swobodnie woda natomiast organiczne kwasy karboksylowe mog przenikn, jeeli bd w postaci niezdysocjowanej. Kwasy karboksylowe, majce niskie wartoci stalych kwasowych (pKA), s w mocno kwanych eluentach praktycznie calkowicie niezdysocjowane. Faz ruchom jest w takim przypadku roztwór mocnego kwasu mineralnego. Chromatografia par jonowych W chromatografii par jonowych, zwanej równie chromatografi jonowo-asocjacyjn, do fazy ruchomej dodawany jest tak zwany odczynnik pary jonowej. Sklada si on ze zwizków powierzchniowoczynnych (anionowych lub kationowych), takich jak sole tetraalkiloamonowe lub kwasy n-alkilosulfonowe. Jony analitu X oddzialuj z jonami L odczynnika pary jonowej. Tworzy si kompleks typu XL. Kompleks XL moe zwiza si w sposób odwracalny z niepolarn powierzchni fazy stacjonarnej S, tworzc z kolei kompleks XLS. Jeeli rozdzielane jony próbki (w postaci kompleksów XL) róni si powinowactwem do niepolarnej fazy stacjonarnej, to bd eluowaly z kolumny w rónym czasie i ulegn rozdzieleniu. W chromatografii par jonowych stosuje si hydrofobowe fazy stacjonarne, takie same jak w chromatografii podzialowej, np. RP-18 czy RP-8. Na rysunku 38 pokazano schematycznie mechanizm wymiany jonowej w chromatografii par jonowych.

Faza ruchoma Jon eluentu Jony analitów XL LS Odczynnik pary jonowej

XLS

Faza stacjonarna

Rysunek 38. Mechanizm wymiany jonowej w chromatografii par jonowych [na podstawie Praktyczna chromatografia jonowa. Viehweger K. H. (red.), Metrohm] 2.4.6. Chromatografia wykluczania W chromatografii wykluczania rozdzielanie skladników próbki zaley od rónic w wymiarach czsteczek i/lub w ich ksztalcie. Próbka wprowadzana jest do kolumny wypelnionej faz stacjonarn o okrelonych wymiarach czstek i o okrelonych wymiarach porów. Czsteczki skladników próbki, o wymiarach mniejszych ni wymiary porów czstek wypelnienia kolumny, penetruj wewntrz porów i zostaj zatrzymane na kolumnie natomiast czsteczki o wikszych wymiarach eluuj si z kolumny pierwsze.

182

2.4.7. Chromatografia powinowactwa Chromatografia powinowactwa (AC, ang. affinity chromatography) pozwala na rozdzielenie mieszanin substancji dziki wykorzystaniu specyficznych oddzialywa biologicznych. Takie oddzialywania mona zaobserwowa pomidzy przeciwcialami i antygenami (zasada klucza i dziurki do klucza), enzymami i substratami, enzymami i inhibitorami lub hormonami i receptorami. S to bardzo specyficzne oddzialywania midzy dwiema substancjami, decydujce o bardzo dobrej selektywnoci rozdzielenia. Jedna z tych substancji jest reaktywnym ligandem, zwizanym chemicznie z powierzchni nonika i tworzy faz stacjonarn, drug substancj jest analit, wykazujcy powinowactwo do ligandu. W chromatografii powinowactwa wykorzystuje si najczciej przeciwciala lub enzymy unieruchomione na noniku. Jeli w próbce wystpuje odpowiedni antygen lub substrat, to jest on selektywnie zatrzymywany na kolumnie.

Rysunek 39. Mechanizm rozdzielenia skladników próbki w chromatografii powinowactwa Chromatografia powinowactwa jest czsto stosowana w analizie i preparatyce substancji aktywnych biologicznie, na przyklad w farmakologii.

183

3. Chromatografia gazowa

3.1. Wstp W chromatografii gazowej (GC) faz ruchom jest gaz, zwany w tym przypadku gazem nonym. Faz stacjonarn w chromatografii gazowej moe by ciecz osadzona na noniku stalym w postaci jednorodnego filmu (warstwy) lub cialo stale ­ adsorbent. W pierwszym przypadku uklad nazywamy chromatografi podzialow (ang. gas-liquid chromatography, GLC) natomiast w drugim, chromatografi adsorpcyjn (ang. gas-solid chromatography, GSC). Chromatografia gazowa jest stosowana do analiz zwizków chemicznych, które w warunkach analizy chromatograficznej, maj posta gazów lub par. S to substancje gazowe, ciekle i stale, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie przekracza 350 - 400°C. Typowy chromatogram otrzymywany poprzez analiz roztworu próbki badanej metod chromatografii gazowej zamieszczony jest na rysunku 15b. Najczciej pierwszy pik, jaki pojawia si na chromatogramie próbki jest pikiem rozpuszczalnika, w którym zostala ona rozpuszczona. Zwykle pik rozpuszczalnika jest te najwikszym sygnalem na chromatogramie. 3.2. Aparatura Analiz zwizków chemicznych technik chromatografii gazowej wykonuje si przy uyciu chromatografów gazowych. Schemat chromatografu gazowego przedstawiono na rysunku 40. Gaz nony (faza ruchoma) doprowadzony z butli (1) plynie przez regulator przeplywu (2) do dozownika (3), a nastpnie przez kolumn (4) i detektor (5), skd jest usuwany na zewntrz do atmosfery. Kolumna jest umieszczona w termostacie (piecu chromatograficznym) (6). Temperatura dozownika, detektora i kolumny jest odpowiednio regulowana. Do dozownika wprowadza si próbk, która po przejciu w stan pary w dozowniku, miesza si ze strumieniem gazu nonego i nastpnie jest przenoszona do kolumny. W kolumnie nastpuje rozdzielenie chromatograficzne skladników próbki, które opuszczaj kolumn wraz z gazem nonym i trafiaj kolejno do detektora. Skladniki próbki generuj w detektorze sygnal elektryczny i w ten sposób s monitorowane. Sygnaly elektryczne po wzmocnieniu we wzmacniaczu mog by rejestrowane w komputerze lub rejestratorze (7) w postaci chromatogramu (8). Gaz nony W chromatografii gazowej faz ruchom stanowi gazy o malej gstoci, niskiej lepkoci, w których wspólczynniki dyfuzji s due. Najczciej jest to: wodór, azot, argon lub hel. Gazy te przechowywane s w postaci spronej w butlach stalowych (1 na rysunku 40). Rodzaj gazu nonego ma niewielki wplyw na wynik rozdzialu chromatograficznego. Zadaniem gazu jest transport próbki przez dozownik, kolumn i detektor. Ruch gazu przez kolumn wymuszany jest jego cinieniem w butli i ustalany do odpowiedniej prdkoci przeplywu za pomoc reduktora cinienia, umieszczonego na butli (2 na rysunku 40). Przy wyborze gazu nonego naley si kierowa przede wszystkim rodzajem wybranego detektora oraz cen, dostpnoci i czystoci gazu. Wymagana czysto gazów wynosi >99,999%. 184

7

8

2 3 6 1 9 5

2

10

4

Rysunek 40. Schemat blokowy chromatografu gazowego z detektorem plomieniowo-jonizacyjnym FID; 1 ­ butla z gazem nonym, 2 ­ zawór redukcyjny, 3 - dozownik, 4 ­ kolumna, 5 ­ detektor, 6 ­ piec chromatograficzny, 7 ­ komputer lub rejestrator, 8 ­ chromatogram, 9 ­ butla z wodorem, 10 ­ butla z powietrzem; linia niebieska pokazuje drog gazu nonego, linia czerwona ­ drog chromatografowanej próbki, obie drogi lcz si w dozowniku Dozownik Dozownik jest elementem umoliwiajcym wprowadzenie próbki w strumie gazu nonego, który przenosi j do kolumny. Stosujc chromatografi gazow mona analizowa substancje, które w warunkach chromatografowania maj posta gazów lub par. Okolo 20% znanych zwizków chemicznych spelnia ten warunek i mona je analizowa technik chromatografii gazowej. S to substancje gazowe oraz ciekle i stale, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie jest wysza ni 350°C ­ 400°C. Klasyczne dozowanie próbki do typowej kolumny kapilarnej polega na wprowadzeniu niewielkich objtoci (0,1 ­ 2 µl) cieczy (roztworu próbki) do dozownika za pomoc strzykawki. Prawidlowy sposób odmierzenia w strzykawce danej objtoci roztworu próbki przedstawia rysunku 41. Próbka ! Igla strzykawki Powietrze Tloczek

Rysunek 41. Mikrostrzykawka do odmierzania malych objtoci cieczy (Uwaga! Koniec igly mikrostrzykawki stosowanej do dozowania próbki w chromatografii gazowej jest ostro zakoczony) 185

Po wprowadzeniu roztworu próbki do dozownika nastpuje gwaltowne przejcie rozpuszczalnika i próbki w stan gazu, który po zmieszaniu z gazem nonym jest wprowadzany na kolumn. Praktyczne zasady dozowania próbki za pomoc mikrostrzykawki:

· ·

strzykawk naley trzyma za cz szklan a nie za tloczek, strzykawka jest bardzo delikatna, upuszczenie jej na tward powierzchni powoduje jej zniszczenie,

·

nie napelnia si calej strzykawki roztworem próbki, poniewa w trakcie dozowania do chromatografu gazowego cz roztworu moe wydosta si na zewntrz,

·

przed nabraniem roztworu próbki do strzykawki dobrze jest zwily j za pomoc rozpuszczalnika, w którym jest rozpuszczona (napelniajc strzykawk rozpuszczalnikiem i usuwajc go), pozwoli to na dokladniejsze odmierzenie wlaciwej objtoci roztworu próbki,

· ·

naley nabiera niewielkie iloci (0,1 ­ 2 µl) roztworu próbki do strzykawki, nie naley zostawia roztworu próbki w igle strzykawki, naley przesun tloczek tak, aby zobaczy powietrze w strzykawce (rys. 44); w igle strzykawki o pojemnoci 10 µl mieci si okolo 0,5 µl cieczy, pozostawiona w igle ciecz, po wprowadzeniu do gorcego dozownika moe spowodowa wyrzucenie zawartoci strzykawki w wyniku

gwaltownego wzrostu cinienia,

·

igl strzykawki przed dozowaniem próbki do chromatografu naley wytrze, najlepiej papierowym rcznikiem, zapobiegnie to zabrudzeniu membrany,

·

tloczek jest dluszy od szklanej czci strzykawki i nie naley go naciska zbyt mocno przy dozowaniu próbki, poniewa mona go zgi lub zlama,

·

strzykawk naley umy rozpuszczalnikiem od razu po dozowaniu próbki i schowa do wlaciwego opakowania,

·

mycie strzykawki polega na wielokrotnym napelnianiu czystym rozpuszczalnikiem i usuwaniu go, stosowane tradycyjnie trzykrotne umycie jest niewystarczajce.

Dla wikszoci kolumn kapilarnych, dopuszczalna objto próbki wynosi 0,01 do 0,001 µl cieczy, dlatego w chromatografii kapilarnej stosuje si czsto dozowniki z dzieleniem strumienia gazu nonego (rysunek 42). Takim dozownikiem dozuje si do kolumny tylko niewielk cz próbk, np. 1/100 ­ 1/300, a pozostala cz jest usuwana na zewntrz i tracona. Dzielenie próbki powinno pozwoli przede wszystkim zredukowa rozmycie piku chromatograficznego, które jest zwizane z procesem gwaltownego odparowywania substancji w dozowniku i w ten sposób polepszy rozdzielczo, dlatego tzw. stosunek dzielenia jest wanym parametrem, który charakteryzuje ten

186

sposób dozowania. Okrela on stosunek objtociowy szybkoci wyplywu gazu nonego zaworem odprowadzajcym na zewntrz do szybkoci przeplywu gazu nonego przez kolumn.

Rysunek 42. Schemat dozownika z dzieleniem strumienia gazu nonego (a) oraz proces dozowania za pomoc mikrostrzykawki (b) [na podstawie Quantitative Chromatographic Analysis. Beesley et al., 2000] Kolumna chromatograficzna W kolumnie chromatograficznej zachodzi wlaciwy proces chromatografowania i dlatego jej rodzaj ma wplyw decydujcy na wynik analizy chromatograficznej, czyli na jako rozdzielenia skladników próbki. Rozrónia si nastpujce rodzaje kolumn (rysunek 43): · pakowane (kolumny z wypelnieniem): analityczne, mikropakowane i preparatywne, · kolumny o przekroju otwartym ­ kapilarne.

187

Kolumny pakowane napelnione s zloem zawierajcym faz stacjonarn w calej swojej objtoci. Ten rodzaj kolumn jest najczciej stosowany do preparatywnego otrzymywania niewielkich iloci czystych zwizków chemicznych. Kolumny kapilarne pozwalaj na osignicie duo wyszych sprawnoci ni kolumny pakowane i obecnie wikszo analiz chromatograficznych wykonuje si przy zastosowaniu kolumn kapilarnych. Kolumny kapilarne maj okolo 100 tys. pólek teoretycznych. Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych mog by zarówno adsorbentami, jak i cieczami i mog by osadzone na ciankach kapilar w róny sposób. a) b)

Rysunek 43. Kolumna pakowana (a) oraz kolumna kapilarna (b) Wyrónia si nastpujce rodzaje kolumn kapilarnych (rysunek 44):

·

· ·

WCOT (ang. wall-coated open tubular) ­ kapilary ze ciankami wewntrznymi pokrytymi nielotn ciekl faz stacjonarn, najczciej zwizan chemicznie ze ciankami kolumny; jest to najbardziej popularny typ kolumn, PLOT (ang. porous layer open tubular) ­ kapilary ze ciankami pokrytymi warstw ziaren adsorbenta, SCOT (ang. support-coated open tubular) ­ ziarna wypelnienia pokryte s ciekl faz stacjonarn, obecnie rzadko stosowane.

Ziarna adsorbenta Ciekla faza stacjonarna

Rysunek 44. Schematyczne przekroje kolumn kapilarnych 188

Kolumny kapilarne do GC s najczciej wykonane ze stopionego kwarcu, czyli ditlenku krzemu. Stopiony kwarc jest latwy do formowania, elastyczny i duo wytrzymalszy ni inne szkla, co powoduje, e mona wyprodukowa kapilary o rednicy wewntrznej od 0,1 do 1 mm i dlugoci od 10 do 60 m. rednica wewntrzna kolumn kapilarnych wynosi najczciej: 0,1 mm, 0,25 mm, 0,32 mm lub 0,53 mm. Najczciej uywane s kolumny o wymiarach 0,25 mm × 30 m. Kolumny kapilarne przechowuje si w postaci zwoju, w uchwytach chronicych je przed uszkodzeniem (rys. 43b). Adsorbenty stosowane w chromatografii gazowej to adsorbenty wglowe, ele krzemionkowe, sita molekularne i polimery porowate. Adsorbenty stosuje si do analiz gazów i wglowodorów o niskich masach czsteczkowych. Ciekle fazy stacjonarne w chromatografii gazowej to najczciej:

· ·

· ·

fazy niepolarne ­ wglowodory, bdce dobrymi rozpuszczalnikami substancji niepolarnych, np. skwalan, fazy redniopolarne, tzw. silikony, s to siloksany o rónej masie czsteczkowej, z których najczciej stosowane s polidimetylosiloksan, polimetylofenylosiloksan i policyjanoalkilosiloksan, fazy polarne - glikole polietylenowe (np. Carbowax) oraz estry, fazy polarne oparte o kopolimery styrenu i diwinylobenzenu (np. Porapak Q).

Detektory Substancje rozdzielane w kolumnie chromatograficznej s wykrywane przez detektor w miar, jak eluuj z kolumny. Detektor reaguje sygnalem elektrycznym na obecno chromatografowanego zwizku chemicznego w gazie nonym opuszczajcym kolumn. Detektory mona podzieli na: · nieselektywne - detektory uniwersalne, reaguj na wszystkie skladniki próbki, · selektywne - reaguj na pewn grup zwizków, które maj podobne wlaciwoci chemiczne lub fizyczne, · specyficzne - reaguj na pojedynczy zwizek chemiczny. Najczciej uywanym detektorem jest detektor plomieniowo-jonizacyjny (FID). Jest to detektor uniwersalny, czyli taki, który jest czuly na prawie wszystkie zwizki organiczne. Detektor plomieniowo-jonizacyjny FID nie wykrywa obecnoci zwizków nieorganicznych oraz niektórych zwizków wgla, jak: CO, CO2, CS2, HCOOH, COCl2. Zasada dzialania detektora FID przedstawiona jest na rysunku 45. Do detektora doprowadzane s z butli dwa gazy: wodór i powietrze (9 i 10 na rysunku 40). Natenie przeplywu wodoru i powietrza regulowane s reduktorami (2 na rysunku 40). Gaz nony wyplywajcy z kolumny jest mieszany z wodorem i kierowany przez dysz do komory, przez któr przeplywa powietrze. Wodór spala si tworzc plomie. Skladniki próbki doprowadzone wraz z gazem nonym do plomienia ulegaj spaleniu. Niewielka cz atomów wgla (okolo 0,0018 %) ulega jonizacji w trakcie spalenia, co odpowiada wytworzeniu okolo dwóch jonów lub elektronów na 105 czsteczek analitu dostarczonych 189

do detektora. W komorze znajduj si dwie elektrody: jedn jest dysza palnika, drug (zbierajc) stanowi piercie umieszczony w odpowiedniej odlegloci od dyszy. Powstajcy prd jonowy jest wzmacniany i rejestrowany przez potencjometr. Sygnal z detektora jest proporcjonalny do liczby atomów wgla niezwizanych z tlenem a wic w przyblieniu jest proporcjonalny do masy substancji (atomy wgla zwizane z tlenem lub siark nie tworz w detektorze jonów, dlatego FID nie jest czuly na wymienione wyej tlenowe i siarkowe zwizki wgla). Chromatograf gazowy moe by sprzony ze spektrometrem mas (GC/MS), który w takim polczonym ukladzie bdzie pelnil funkcj detektora. Uklad GC/MS zostal opisany w rozdziale III.4.

Rysunek 45. Schemat detektora FID [na podstawie Quantitative Chromatographic Analysis. Beesley et al., 2000] 3.3. Wybór parametrów analizy GC Parametry analizy metod chromatografii gazowej dobierane s do konkretnego analitu i konkretnej próbki. Najwaniejsze parametry pracy ukladu chromatograficznego to:

· · · · · ·

rodzaj fazy stacjonarnej, wymiary kolumny, temperatura pieca chromatograficznego, rodzaj detektora i dozownika, temperatura detektora i dozownika, wielko dozowanej próbki.

Wybór fazy stacjonarnej do analizy nie jest spraw latw i cigle jeszcze bywa dokonywany eksperymentalnie. Najwaniejsz cech faz stacjonarnych, decydujc o oddzialywaniu z czsteczkami zwizków rozdzielanych jest ich polarno. 190

Ogólne zasady wyboru cieklych faz stacjonarnych (GLC) s nastpujce:

· · ·

do rozdzialu substancji niepolarnych stosuje si faz stacjonarn niepolarn, do rozdzialu substancji polarnych stosuje si faz stacjonarn polarn, zwizki niepolarne s rozdzielane na niepolarnej fazie stacjonarnej zgodnie z uszeregowaniem ich wedlug temperatur wrzenia (lotnoci),

·

na fazie stacjonarnej polarnej zwizki niepolarne s eluowane przed zwizkami polarnymi o tej samej temperaturze wrzenia,

·

na fazie stacjonarnej niepolarnej zwizki polarne s eluowane przed zwizkami niepolarnymi o tej samej temperaturze wrzenia.

Wplyw dlugoci kolumny na wyniki analizy jest nastpujcy: im dlusza kolumna, tym czasy retencji s wiksze i tym wyraniejsze s rónice midzy czasami retencji dwóch substancji. Jednak dluszy czas analizy powoduje, e piki s bardziej rozmyte. Temperatura kolumny ma ogromny wplyw na wynik analizy. Proces chromatograficzny mona prowadzi w stalej temperaturze (tzw. analiza izotermiczna) lub metod programowanej temperatury (analiza z programowan temperatur). T drug chromatografi stosuje si wtedy, gdy skladniki mieszaniny róni si znaczco temperaturami wrzenia, np. wglowodory z ropy naftowej lub szereg homologiczny alkoholi. W analizie z programowan temperatur roztwór próbki jest wprowadzany do kolumny chromatograficznej utrzymywanej w stosunkowo niskiej temperaturze ­ niszej (o okolo 90°C) ni temperatura wrzenia najbardziej lotnego skladnika próbki. Nastpnie temperatura kolumny chromatograficznej jest stopniowo podwyszana. Narost temperatury jest odpowiednio programowany, moe by staly, na przyklad 4°C/min. Kocowa temperatura kolumny powinna by bliska temperaturze wrzenia najmniej lotnego skladnika próbki, ale nie moe przekracza dopuszczalnego limitu temperaturowego pracy kolumny, okrelanego przez jej producenta. Dozowana próbka powinna by bardzo mala, wówczas strefa startowa jest bardzo wska. Wielko próbki wprowadzonej do kolumny nie moe by wiksza od pojemnoci sorpcyjnej kolumny, poniewa przeladowanie kolumny prowadzi do zlego rozdzielenia skladników próbki i powstawania niesymetrycznych, szerokich pików. Pojemno kolumny zwykle nie przekracza okolo 40 ng dla pojedynczego skladnika próbki.

191

4. Polczenie chromatografii ze spektrometri mas

Identyfikacja analitów jedynie na podstawie parametrów retencji, typowa w technikach chromatograficznych (GC i HPLC), jest na ogól metod niewystarczajc, poniewa wystpuje wiele rónych substancji, które mog mie bardzo zbliony lub nawet identyczny czas retencji jak anality. W celu dokonania poprawnej analizy jakociowej stosuje si lczenie technik, np. chromatografi w polczeniu ze spektrometri mas. Substancje rozdzielane w kolumnie chromatograficznej kierowane s wraz z faz ruchom do spektrometru mas, gdzie nastpuje ich jonizacja i ewentualnie fragmentacja, natomiast identyfikacja poszczególnych zwizków potwierdzana jest na podstawie analizy ich widm mas. Spektrometria mas (MS) jest uywana do identyfikacji zwizków organicznych oraz do ich detekcji i oznacze ilociowych. Ujmujc najprociej, spektrometr mas jest urzdzeniem do wytwarzania jonów, czyli jonizacji czsteczki a nastpnie mierzenia stosunku masy powstalych jonów do ich ladunku (m/z). Rejestracja iloci powstalych jonów (wielkoci prdu jonowego) i wartoci stosunku m/z poszczególnych jonów daje zapis analizy - widmo mas. Uzyskiwane widma mas, a tym samym rodzaj informacji o zwizku, zale przede wszystkim od sposobu jonizacji. Widmo mas jest charakterystyczne dla okrelonego zwizku chemicznego i zawiera informacje o jego masie czsteczkowej i budowie strukturalnej.

Spektrometr mas sklada si z kilku istotnych elementów:

· · · ·

uklad wprowadzenia próbki (na przyklad wprowadzenie bezporednie lub poprzez chromatograf gazowy czy chromatograf cieczowy), komora jonizacyjna i uklad przyspieszania jonów, analizator jonów, detektor jonów i rejestrator.

Najczciej w spektrometrii mas stosuje si jonizacj strumieniem elektronów. Jest to te jonizacja zwykle stosowana w spektrometrii mas polczonej z chromatografi gazow (GC/MS). Jonizacja strumieniem elektronów (ang. electron impact, EI) polega na bombardowaniu wizk elektronów analizowanych czsteczek, znajdujcych si w stanie gazowym (pary) (rysunek 46) w komorze jonizacyjnej. Jonizacja przebiega w próni rzdu 10-6 do 10-5 Tr (1,33·10-4 ÷ 1,33·10-3 Pa). Wizka elektronów jest emitowana z katody wykonanej z trudno topliwych metali, wolframu lub renu oraz ogrzewanej prdowo do temperatury kilku tysicy stopni. Energi elektronów mona zmienia poprzez zmian napicia midzy katod a anod, do której kierowana jest wizka elektronów z katody. Zwykle wszystkie pomiary wykonuje si przy standardowej energii 70 eV. Strumie elektronów wchodzi w kolizj z czsteczkami badanego zwizku bdcymi w stanie pary. W wyniku bombardowania wizk elektronów czsteczek substancji organicznej, bdcej w stanie gazowym, powstaj jony zwane molekularnymi M+·, które mog rozpada si, czyli fragmentowa (rysunek 47). 192

Jon molekularny jest kationorodnikiem o masie czsteczkowej niemal identycznej jak masa czsteczkowa zwizku chemicznego, z którego powstal. Pomijalna rónica masy wynika z utraty jednego elektronu z molekuly zwizku.

Rysunek 46. Schemat ródla jonów w jonizacji EI [na podstawie Mass spectrometry: a foundation course. Downard K., 2004]

Rysunek 47. Powstawanie i drogi fragmentacji jonu molekularnego w jonizacji EI, M ­ molekula badanego zwizku, M+· ­ jon molekularny Drugi sposób jonizacji, stosowany w technice GC/MS, to jonizacja chemiczna (ang. chemical ionization, CI). Czynnikiem jonizujcym czsteczki analitu s jony, powstale w wyniku jonizacji wizk 193

elektronów specjalnie do tego celu wprowadzonego do komory jonizacyjnej, gazu reagujcego. Jonizacja chemiczna nastpuje w wyniku reakcji czsteczki analitu z jonem pierwotnym gazu reagujcego (rysunek 48). S to reakcje przeniesienia protonu pomidzy jonem pierwotnym a czsteczk analitu. Gazem reagujcym jest metan, izobutan, amoniak lub woda. Warunki jonizacji s bardzo lagodne, tote fragmentacja zachodzi w niewielkim stopniu.

Rysunek 49. Powstawanie pozornego jonu molekularnego w jonizacji CI - nawiasy prostoktne oznaczaj, e miejsce lokalizacji ladunku nie jest okrelone, M ­ molekula badanego zwizku, [M + H]+ ­ pozorny jon molekularny W widmach mas uzyskanych technik CI obserwuje si intensywne tzw. pozorne jony molekularne [M + H]+, które slu do wyznaczenia masy czsteczkowej badanego zwizku. W widmach mas uzyskanych technik CI obserwuje si intensywne tzw. pozorne jony molekularne [M + H]+, które slu do wyznaczenia masy czsteczkowej badanego zwizku. Masa pozornego jonu molekularnego jest o jednostk wiksza ni masa czsteczkowa zwizku chemicznego, z którego powstal. Pozorne jony molekularne nazywamy te jonami pseudomolekularnymi. Wad jonizacji CI, podobnie jak EI, jest konieczno przeprowadzenia analitu w stan pary. Powstale w komorze jonizacyjnej jony s przypieszane polem elektrostatycznym o potencjale 60008000 V i nastpnie kierowane poprzez szczelin ogniskujc do analizatora. W analizatorze strumie jonów zostaje rozdzielony wedlug stosunku ich masy do ladunku (m/z) a nastpnie w detektorze nastpuje pomiar natenia prdu jonowego, odpowiadajcego rozdzielonym poszczególnym jonom. Wynikiem analizy MS jest widmo mas. Widma mas s rejestrowane kolejno dla kadej substancji, eluujcej si z kolumny chromatograficznej. Widmo mas EI przedstawia wzgldne intensywnoci jonów fragmentacyjnych oraz jonu molekularnego, uporzdkowanych wedlug stosunku ich masy do ladunku (m/z).

194

Fragmentacja jest procesem charakterystycznym dla kadego zwizku i dlatego widmo mas pozwala na jego identyfikacj. Badan substancj mona zidentyfikowa korzystajc z regul fragmentacji lub przez porównanie z widmami mas substancji wzorcowych, zebranych w atlasach (katalogach) widm. Widmo mas EI zawiera informacj, na jakie fragmenty rozpadl si badany zwizek. Jego interpretacja przypomina prac archeologa, który na podstawie zachowanych fragmentów stara si odtworzy pierwotny ksztalt rozbitego naczynia. Jon molekularny odpowiada masie czsteczkowej tych czsteczek zwizku, które s zbudowane z najlejszych izotopów pierwiastków, wchodzcych w sklad zwizku, np. z izotopów 1H, 12C, 14N,

16

O, 32S, 35Cl i 79Br.

Znalezienie jonu molekularnego pozwala na okrelenie masy czsteczkowej analizowanego zwizku. Przy zastosowaniu innych technik jonizacji, takich jak CI, APCI (jonizacja chemiczna pod cinieniem atmosferycznym, ang. atmospheric pressure chemical ionization) czy ESI (jonizacja na drodze elektrorozpraszania, ang. electrospray ionization), zamiast jonu molekularnego uzyskuje si pozorne jony molekularne (jony pseudomolekularne), z których równie mona obliczy mas czsteczkow analizowanego zwizku. Wikszo pierwiastków zawiera dodatkowe izotopy, np. podstawowemu izotopowi wgla 12C (98,931% rozpowszechnienia) towarzyszy izotop 13C (1,069%). Sklad izotopowy pierwiastków jest praktycznie staly w naturze. W badanej próbce, czsteczki zwizków chemicznych s zbudowane z rónych izotopów danego pierwiastka. Powoduje to, e obok czsteczek zbudowanych z najlejszych izotopów pierwiastków wchodzcych w sklad danego zwizku chemicznego bd znajdowa si te czsteczki zawierajce równie cisze izotopy, np. metan: 12 1 C H4 (masa czsteczkowa 16 Da) oraz 13C1H4 (17 Da). W spektrometrze mas zostan zmierzone dokladne masy jonów a wic bd rozrónione te dwa typy czsteczek. Sygnaly w widmie mas odpowiadajce jonom zawierajcym cisze izotopy nazywa si pikami izotopowymi. Piki izotopowe maj mniejsz intensywno w widmie mas ni piki molekularne, ze wzgldu na mniejsze rozpowszechnienie ciszych izotopów. Stosunek intensywnoci jonu molekularnego do piku izotopowego w widmie mas metanu wynosi jak 99 do 1. Przykladowe widmo mas EI jest zamieszczone na rysunku 50. Nie zawsze jon molekularny jest widoczny na widmie mas EI. Jeeli dany zwizek chemiczny ulega silnej fragmentacji, to jon molekularny moe nie by intensywny lub moe w ogóle nie wystpowa. W takiej sytuacji okrelenie masy czsteczkowej badanego zwizku nie jest moliwe i naley zastosowa inn metod jonizacji np. jonizacj chemiczn. Widmo mas CI zawiera przede wszystkim pozorny jon molekularny natomiast jony fragmentacyjne s nieliczne i malo intensywne, gdy jest to tzw. lagodna technika jonizacji. Chromatografia gazowa polczona ze spektrometri mas (GC/MS) jest stosowana zarówno do identyfikacji skladników analizowanych próbek jak i do oznaczania ilociowego poszczególnych zwizków. Obie techniki doskonale si uzupelniaj. W technice GC/MS preferowane s kolumny kapilarne, poniewa umoliwiaj bezporednie wprowadzenie eluatu z kolumny do komory jonizacyjnej spektrometru. Gazem nonym w technice GC/MS jest hel. Technika GC/MS z jonizacj strumieniem elektronów bd z jonizacj chemiczn jest stosowana do analizy zwizków 195

organicznych, które mog by przeprowadzone w stan pary. Z tego wzgldu badane substancje musz wykazywa w temperaturze pokojowej lub po ogrzaniu prno par, co najmniej 10-7 do 10-6 Tr (1,33·10-5 ÷ 1,33·10-4 Pa). Jest to istotne ograniczenie tej metody, która nie moe by zastosowana do analizy zwizków wielkoczsteczkowych bd polarnych, takich jak aminokwasy, peptydy, bialka, wglowodany czy zwizki jonowe.

Rysunek 50. Widmo mas (EI) 2-heptakozanolu; jon molekularny 2-heptakozanolu ma niewielk intensywno i nie jest widoczny na zamieszczonym widmie mas natomiast widoczne s jony fragmentacyjne, w tym jon o wartoci m/z 45, tzw. pik glówny, który jest jonem o najwikszej intensywnoci w widmie Wysokosprawna chromatografia cieczowa w polczeniu ze spektrometri mas (LC/MS) lub tandemow spektrometri mas (MS/MS) jest jedn z najpopularniejszych technik do oznaczania wielu zwizków organicznych w próbkach o zloonej matrycy. Wród wielu zalet tej techniki najwaniejsza to moliwo analizy zwizków polarnych oraz wielkoczsteczkowych. W technice LC/MS anality rozdzielane w kolumnie chromatograficznej, ze wzgldu na róne powinowactwo do fazy stacjonarnej, s eluowane za pomoc odpowiednio dobranych faz ruchomych do komory jonizacyjnej spektrometru mas. W wielu przypadkach preferowane jest stosowanie rozdzielania w odwróconym ukladzie faz (RP), przy zastosowaniu kolumn z niepolarn faz stacjonarn oraz polarnych faz ruchomych. Najczciej stosowane s mieszaniny metanol/woda oraz acetonitryl/woda przy odpowiednio dobranym pH, z dodatkiem octanu amonu, mrówczanu amonu lub/i kwasu mrówkowego czy octowego, których dodatek powoduje zwikszenie czuloci oznaczenia i popraw jonizacji próbki. W technice LC/MS moliwe jest stosowanie ródla jonów typu ESI lub komory jonizacyjnej typu APCI. Jonizacja ESI jest najczciej stosowan technik jonizacji zwizków polarnych natomiast dla redniopolarnych i mniej polarnych zwizków bardziej odpowiednia jest technika APCI. Jonizacja na drodze elektrorozpraszania, ESI polega na tym, e w silne pole elektryczne wprowadza si strumie cieczy (eluatu z kolumny chromatograficznej) pod cinieniem atmosferycznym (rysunek 51). Pole elektryczne jest wytwarzane poprzez przyloenie napicia 3 ­ 6 kV pomidzy kapilar a elektrod. Nastpuje odparowywanie kropelek rozpuszczalnika, co powoduje wzrost gradientu potencjalu przy powierzchni kropli i prowadzi w efekcie do desorpcji jonów z kropli. Jonizacja ESI jest lagodn technik jonizacji. Widma mas ESI zawieraj serie wielokrotnie protonowanych pozornych 196

jonów molekularnych [M + zH]z+. Jony z wieloma ladunkami s zalet tej metody jonizacji. W spektrometrze mas mierzona jest warto m/z, czyli warto stosunku masy do liczby ladunków. Dziki temu, zwizki o duej masie czsteczkowej i na przyklad tworzce jony z 2 lub 3 ladunkami s analizowane przy odpowiednio niszych wartociach m/z, odpowiadajcych masie czsteczkowej podzielonej odpowiednio przez 2 lub 3. Metod ESI mona analizowa zwizki chemiczne o masie czsteczkowej nawet rzdu 100 ­ 300 tys. u.

Rysunek 51. Schemat ródla jonów typu ESI [na podstawie Spektrometria mas. de Hoffmann E. et al., 1998] Jonizacja APCI ródlo jonów APCI (rysunek 52) sklada si z:

· · ·

kapilary, przez któr przeplywa faza ruchoma z HPLC zamieniajca si w aerozol, ogrzewanej rurki, igly wyladowawczej, która produkuje jony z powstalego aerozolu.

APCI jest metod jonizacji, w której zachodzi reakcja w fazie gazowej pod cinieniem atmosferycznym pomidzy jonem pierwotnym a czsteczk analitu. Jest to metoda podobna do jonizacji chemicznej stosowanej w technice GC/MS. Rónica polega na tym, e jony pierwotne powstaj ze skladników fazy ruchomej poprzez wyladowania koronowe. Zaostrzona elektroda (igla wyladowawcza) wytwarza gradient potencjalu. Przy wyladowaniach koronowych powstale napicie jest wystarczajce, aby medium uleglo czciowej jonizacji natomiast za niskie, aby powstal luk elektryczny. W atmosferze azotu i w obecnoci wody, pod wplywem wyladowa koronowych zachodz reakcje, które prowadz do powstania jonów pierwotnych. Nastpnie powstaj protonowane pozorne jony molekularne [M + H]+, poprzez przeniesienie protonu z jonu pierwotnego do czsteczki analitu. Chocia APCI jest 197

lagodn technik jonizacji, wystpujc niewielk fragmentacj czsteczek mona wykorzysta do badania struktury zwizku.

Rysunek 52. Schemat ródla jonów typu APCI [na postawie Spektrometria mas. de Hoffmann E. et al., 1998]

5. Chromatografia z faza ruchom w stanie nadkrytycznym

5.1. Wstp Chromatografia z faz ruchom w stanie nadkrytycznym (ang. supercritical fluid chromatography, SFC) jest technik rozdzielania mieszanin zwizków chemicznych posiadajc wlaciwoci porednie midzy chromatografi gazow a cieczow. W literaturze spotyka si równie inne terminy na okrelenie tej techniki, jak: chromatografia fluidalna czy chromatografia nadkrytyczna. Faz ruchom w stanie nadkrytycznym jest medium znajdujce si w warunkach powyej warunków punktu krytycznego, tzn. ma temperatur wysz od temperatury krytycznej i jest pod cinieniem wyszym od cinienia krytycznego. Punkt krytyczny jest wielkoci charakterystyczn dla danej substancji. Poniej wartoci punktu krytycznego, w zalenoci od zmian wartoci cinienia i temperatury, mog istnie trzy stany skupienia substancji ­ gazowa, ciekla i stala. Powyej wartoci cinienia i temperatury okrelanych przez punkt krytyczny, substancja znajduje si w stanie nadkrytycznym, w którym zanika rónica midzy gazem a ciecz. Powyej tego punktu, niezalenie od zmian cinienia i temperatury, stan skupienia substancji nie zmienia si. Powysze obrazuje diagram przemian fazowych przedstawiony na rysunku 37 w rozdziale II.5.2.11. Substancja w stanie nadkrytycznym ma wlaciwoci porednie midzy gazem a ciecz. Ma ona gsto zblion do gstoci cieczy, lepko zblion do lepkoci gazu a wspólczynnik dyfuzji mniejszy ni dla gazu, ale wyszy ni dla cieczy. Porównanie wlaciwoci gazu, cieczy i plynu w stanie nadkrytycznym przedstawiono w tabeli 5. Gsto plynu w stanie nadkrytycznym sprawia, e ma on dobre wlaciwoci rozpuszczalnikowe, substancje rozpuszczaj si w nim jak w cieczy, podobnie jak w chromatografii cieczowej. Mala lepko plynu i niskie napicie powierzchniowe powoduj, e jego wspólczynnik dyfuzji jest wyszy ni dla cieczy, co skutkuje szybszym przenoszeniem masy, podobnie jak w chromatografii gazowej. 198

Tabela 5. Porównanie niektórych wlaciwoci gazu, cieczy i plynu w stanie nadkrytycznym [na podstawie Podstawy chromatografii, Witkiewicz Z., WNT, Warszawa, 2000] Parametr Wspólczynnik dyfuzji [cm2/s] Lepko [g/s cm] Gsto [g/cm3] Gaz Ciecz Plyn w stanie nadkrytycznym (0,5 ­ 3,3) · 10-4 (0,5 ­ 3,5) · 10-4 0,2 ­ 0,9

0,01 ­ 1,0 (2,0 ­ 9,9) · 10-4 (0,6 ­ 2,0) · 10-3

(0,5 ­ 2,0) · 10-5 (0,3 ­ 2,4) · 10-2 0,8 ­ 1,0

Wymienione cechy plynu w stanie nadkrytycznym s bardzo korzystne dla procesu chromatograficznego. Umoliwiaj rozdzielanie substancji o malej trwaloci termicznej, o malej lotnoci i duych masach czsteczkowych. Chromatografia z faz ruchom w stanie nadkrytycznym jest technik uzupelniajc, ulatwiajc rozdzielanie takich mieszanin substancji, których rozdzielenie innymi technikami chromatograficznymi jest trudne, dlugotrwale lub wrcz niemoliwe. 5.2. Fazy ruchome W chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym due znaczenie w procesie rozdzielania maj lotno oraz rozpuszczalno substancji badanych w fazie ruchomej. Wiele substancji w stanie nadkrytycznym posiada dobre wlaciwoci rozpuszczania. Rozpuszczalno analitów w plynie nadkrytycznym zaley przede wszystkim od temperatury i gstoci, a w mniejszym stopniu od cinienia. Odpowiedni rozpuszczalno oraz niskie parametry punktu krytycznego, umoliwiajce zastosowanie jako fazy ruchomej w stanie nadkrytycznym posiadaj m.in.: freony, pentan, amoniak, podtlenek azotu i ditlenek wgla. Najpowszechniej stosowany jest ditlenek wgla (CO2), przede wszystkim dlatego, e ma nisk temperatur krytyczn (31,3°C), niskie cinienie krytyczne (7,29 MPa), jest nietoksyczny i niepalny oraz latwy do otrzymania w wysokiej czystoci. Gsto ditlenku wgla w punkcie krytycznym wynosi 0,448 g/cm3. Ditlenek wgla w stanie nadkrytycznym posiada wlaciwoci protonowo-akceptorowe, posiada zdolno tworzenia wiza wodorowych i ma nisk polarno (porównywaln z polarnoci heksanu). W przypadku stosowania chromatografii z kolumnami kapilarnymi, polarno ditlenku wgla jest wystarczajca nawet dla zwizków polarnych. Przy zastosowaniu kolumn pakunkowych, polarno ditlenku wgla w stanie nadkrytycznym umoliwia chromatografi zwizków niepolarnych i redniopolarnych. Dla zwizków polarnych stosuje si polarne modyfikatory fazy ruchomej, np. alkohole, aminy, wod. Modyfikator polarny dodany w malych ilociach (1÷10%) do ditlenku wgla zwiksza rozpuszczalno polarnych analitów, tym samym sil elucji fazy ruchomej, selektywno procesu rozdzielania i sprawno kolumny. Dodatek modyfikatora zmienia jednak parametry krytyczne ditlenku wgla, np. podwysza temperatur punktu krytycznego. Zbyt wysoka temperatura moe by powodem rozkladu substancji analizowanych. 5.3. Proces rozdzielania chromatograficznego W chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym na retencj zwizków rozdzielanych ma wplyw znacznie wicej czynników ni w pozostalych rodzajach chromatografii. Czas retencji zaley od: · wlaciwoci analitów, 199

· · · · ·

wlaciwoci wypelnienia kolumny (rodzaju fazy stacjonarnej), rozmiarów kolumny, rodzaju, gstoci i prdkoci przeplywu fazy ruchomej, temperatury i cinienia w kolumnie, rodzaju i iloci zastosowanego modyfikatora.

Zmieniajc parametry procesu, zmienia si wlaciwoci plynu w stanie nadkrytycznym. Gsto plynu jest podstawowym czynnikiem wplywajcym na retencj, od gstoci plynu zaley jego zdolno do rozpuszczania analitów. Gsto plynu w stanie nadkrytycznym ulega zmianie ze zmian cinienia oraz temperatury. Plyn o mniejszej gstoci ma wlaciwoci rozpuszczalników niepolarnych, natomiast o duej gstoci ­ wlaciwoci rozpuszczalników bardziej polarnych, jak np. dichlorometanu. Zmiany gstoci fazy ruchomej powoduj zmiany czasu retencji analitów. Wspólczynnik retencji zmniejsza si ze wzrostem gstoci w stalej temperaturze oraz ze wzrostem temperatury przy stalej gstoci. Wplyw wzrostu temperatury na wspólczynnik retencji analitu moe by odmienny dla niskich i wysokich temperatur stanu nadkrytycznego. W niszych temperaturach stanu nadkrytycznego wspólczynnik retencji wzrasta ze wzrostem temperatury, natomiast w wyszych temperaturach ­ maleje ze wzrostem temperatury dla tych samych analitów. Fakt ten tlumaczy si tym, e w niszych temperaturach stanu nadkrytycznego na retencj ma wplyw glównie proces rozpuszczania, natomiast w wyszych temperaturach stanu nadkrytycznego, którym towarzyszy wysokie cinienie, wiksze znaczenie ma lotno analizowanych zwizków. Przeciwne dzialanie tych dwóch efektów: lotnoci i rozpuszczalnoci powoduje, e w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym przy stalym cinieniu, w zalenoci wspólczynnika retencji od temperatury istnieje wyrane maksimum. Warunki separacji technik chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym mog by stale lub zmienne. Opracowanie warunków procesu rozdzielania polega na:

· · ·

ustaleniu temperatury kolumny, programowaniu jej wzrostu lub obniania, jak w chromatografii gazowej, programowaniu zmiany cinienia i gstoci fazy ruchomej, ustaleniu skladu fazy ruchomej, zaprogramowanie zmiennoci skladu jak w elucji gradientowej w chromatografii cieczowej.

Zmienia mona kolejno poszczególne parametry rozdzielania lub programowa jednoczesne zmiany wszystkich lub wybranych parametrów. 5.4. Aparatura Chromatograf Aparaty do chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym skladaj si z tych samych podstawowych elementów, co kady chromatograf, gazowy czy cieczowy. Nowym i istotnym elementem jest restryktor, który umoliwia utrzymanie w kolumnie odpowiednio wysokiego cinienia. Nowoczesne chromatografy, dostpne obecnie na rynku, dostosowane s do pracy w trzech systemach: z gazow faz ruchom, jako chromatograf gazowy, z faz ruchom w stanie nadkrytycznym oraz z ciekl faz ruchom, jako chromatograf cieczowy. Schemat chromatografu do pracy z faz w stanie nadkrytycznym przedstawiono na rysunku 53. Pompy

200

Odpowiedni przeplyw fazy ruchomej wymuszaj pompy, takie jak stosowane w chromatografii cieczowej. W przypadku stosowania ditlenku wgla, w pompach tlokowych stosuje si chlodzenie glowic do temperatury -10°C, aby zapobiec odparowywaniu fazy ruchomej i utrzymaniu jej w stanie plynnym. W przypadku stosowania pomp strzykawkowych, tloczenie fazy ruchomej odbywa si za pomoc spronego helu z butli gazowej. Dozowniki Do wprowadzania substancji na kolumn stosuje najczciej zawór z ptl, podobnie jak w chromatografii cieczowej. Do kolumn kapilarnych stosuje si zawory o pojemnoci ptli ok. 0,1­0,2 µL z dzieleniem strumienia. Wlaciwe dozowanie próbki, zwlaszcza w analizie ilociowej jest trudne i wymaga wlaciwego polczenia zaworu z kolumn dla zachowania odpowiedniego cinienia i temperatury.

Zawór

Manometr

Pompa Zbiornik fazy ruchomej Zbiornik modyfikatora

Dozownik

Kolumna chromatograficzna Termostat Komputer, rejestrator

Detektor Manometr

Restryktor

Rysunek 53. Schemat budowy chromatografu do pracy z faz ruchom w stanie nadkrytycznym Kolumny i fazy stacjonarne Do pracy z faz ruchom w stanie nadkrytycznym stosuje si kolumny pakowane, mikropakowane i kapilarne. Rozmiary kolumn pakowanych s podobne do rozmiarów kolumn stosowanych w chromatografii cieczowej. Kolumny kapilarne maj rednice 100 µm lub mniejsze i dlugo do kilku 201

metrów Dla zapewnienia dobrego rozdzielenia na kolumnie kapilarnej, dozowane próbki powinny by jak najmniejszej wielkoci oraz konieczna jest stala prdko przeplywu fazy ruchomej przy programowanym cinieniu. Kolumny mikropakowane s to pakowane kolumny kapilarne o rednicach 0,25 ­ 0,5 mm. Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym to, podobnie jak w HPLC, el krzemionkowy i chemicznie zwizane fazy z elem krzemionkowym, jak oktadecylosilan (RP-C18) czy el krzemionkowy zwizany z grupami propyloaminowymi i inne. Od rodzaju fazy stacjonarnej zaley zakres temperaturowy pracy z faz w stanie nadkrytycznym. Faza stacjonarna RP-C18 wytrzymuje temperatur do 150°C, natomiast aminopropylowa - tylko 75°C. Sprawno kolumn pakowanych jest porównywalna ze sprawnoci kolumn do HPLC z tym, e t sam sprawno uzyskuje si przy przeplywach fazy ruchomej 5-10 razy wikszych ni w HPLC, co oznacza zdecydowanie krótsze analizy w chromatografii z faz w stanie nadkrytycznym. W kolumnach mikropakowanych wypelnieniem mog by porowate kulki szklane, sluce równie jako nonik dla rónych polimerów siloksanowych. Detektory Detektory stosowane w chromatografii gazowej i cieczowej mog by wykorzystane w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym. W przypadku zastosowania detektorów do chromatografii gazowej, plyn wychodzcy z kolumny chromatograficznej musi mie obnione cinienie (dekompresja), obnion temperatur (schlodzony) i przeksztalcony w gaz. Przy stosowaniu detektorów do chromatografii cieczowej, eluat z kolumny moe wplywa do detektora w stanie nadkrytycznym.

Wród wielu detektorów uywanych w chromatografii gazowej najwiksze zastosowanie w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym ma detektor plomieniowo jonizacyjny (FID). Na rysunku 54 przedstawiono schemat takiego detektora. Jest on wyposaony dodatkowo w przetwornik cinieniowy i odpowiednie zawory, umoliwiajce wprowadzanie eluatu z kolumny w postaci gazu (por.roz. III.3.2 rys. 48). Ograniczeniem detektora FID jest niemono stosowania modyfikatorów organicznych, gdy tworz one karbojony. W chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym z detektorem FID modyfikatorami mog by jedynie zwizki nietworzce karbojonów, jak kwas mrówkowy czy woda.

Detektory optyczne stosowane w chromatografii cieczowej s równie wykorzystywane w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym. Najczciej, tak samo jak w HPLC, stosowany jest detektor UV. Jednak najlepszym detektorem w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym jest spektrometr mas. Polczenie spektrometru mas z tym rodzajem chromatografii jest latwiejsze ni polczenie z HPLC. Restryktory Aby utrzyma faz ruchom w stanie nadkrytycznym naley zachowa w czasie separacji warunki cinienia i temperatury powyej wartoci krytycznych. Utrzymanie wlaciwej temperatury jest osigane w piecu chromatograficznym, natomiast do uzyskania wlaciwego cinienia stosuje si urzdzenia zwane restryktorami. Restryktor znajduje si przed detektorem, jak w przypadku detektorów stosowanych w chromatografii gazowej, np. FID lub za detektorem, jak w przypadku detektorów stosowanych w chromatografii cieczowej, np. detektora UV. Najprostszym restryktorem, o stalych parametrach pracy jest przewenie w postaci krótkiego odcinka kapilary na drodze przeplywu fazy ruchomej, jest to restryktor liniowy o dlugoci zwykle 10­15 cm i rednicy do kilkunastu 202

mikrometrów. W cienkiej kapilarze plyn plynie szybciej ni przez przewód o wikszej rednicy przed kapilar, co pociga za sob spadek cinienia w kapilarze (równanie Bernoulliego). Wane, by spadek cinienia nastpowal na bardzo krótkim odcinku restryktora, co zapobiega kondensacji analitów. Restryktory liniowe wykonane s ze szkla, kwarcu lub stali nierdzewnej. Zmian warunków pracy restryktora liniowego mona osign przez programowanie jego temperatury. Restryktory mechaniczne lub elektryczne s lepsze od restryktorów liniowych, umoliwiaj plynn regulacj cinienia, ale s bardzo skomplikowanymi urzdzeniami. Gazy wylotowe

Polczenie elektryczne elektrod

Elektroda Plomie palnika Dysza palnika

Wodór

Powietrze

Do przetwornika cinieniowego Wylot Zawór Z kolumny Rysunek 54. Schemat detektora plomieniowo-jonizacyjnego (FID) stosowanego w chromatografie z faz ruchom w stanie nadkrytycznym [na podstawie Podstawy chromatografii, Witkiewicz Z., WNT, Warszawa, 2000] 5.5. Zastosowanie chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym Chromatografi z faz ruchom w stanie nadkrytycznym mona stosowa w rónych ukladach polcze: z chromatografi gazow, cieczow lub ekstrakcj plynem w stanie nadkrytycznym. Ten rodzaj chromatografii ma zastosowanie do rozdzielenia substancji nielotnych lub nietrwalych termicznie. Przykladami zastosowania chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym s oznaczanie leków i substancji biologicznie czynnych, pestycydów i herbicydów, mieszanin wglowodorów nasyconych, nienasyconych i aromatycznych w mieszaninach, nitropochodnych i hydroksynitropochodnych wglowodorów policyklicznych, wolnych kwasów tluszczowych, amin, materialów wybuchowych, oligomerów, oznaczanie zwizków chiralnych i wielu innych zwizków chemicznych.

203

6. Literatura

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Ahuja, S. Chromatography and separation science; Academic Press: 2003. Beesley, T. E.; Buglio, B.; Scott, R. P. W. Quantitative Chromatographic Analysis; Marcel Dekker: New York, 2000; e-ksiki. Cazes, J.; Scott, R. P. W. Chromatography theory; Marcel Dekker: New York, 2002. de Hoffmann, E.; Charette, J.; Stroobant, V. Spektrometria mas; Wydawnictwo NaukowoTechniczne: Warszawa, 1998. Deyl, Z.; Macek, K.; Janák, J. Liquid column chromatography: a survey of modern techniques and applications; Elsevier: Amsterdam, 1975. Downard, K. Mass spectrometry: a foundation course; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2004. Ettre, L. S. Pure Appl. Chem. 1993, 65, 819-872, http://www.iupac.org/publications/pac/65/4/0819/ Fried, B.; Sherma, J. Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker: New York, 1999; e-ksiki. Hahn-Deinstrop, E. Applied Thin-Layer Chromatography: Best Practice and Avoidance of Mistakes; Wiley-VCH: Weinheim, 2007. Katz, E.; Eksteen, R.; Schoenmakers, P.; Miller, N. (red) Handbook of HPLC; Marcel Dekker: New York, 1998. Kocjan, R. (red.) Chemia analityczna. Podrcznik dla studentów; Wydawnictwo Lekarskie PZWL: Warszawa, 2000; Tom 2. Lindsay, S. High performance liquid chromatography; Analytical Chemistry by Open Learning; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1997. Michalski, R. Chromatografia jonowa: podstawy i zastosowania; Wydawnictwo NaukowoTechniczne: Warszawa, 2005. Patnaik, P. Dean's Analytical Chemistry Handbook; McGraw-Hill: New York, 2004; e-ksiki. Sadek, P. C. Illustrated pocket dictionary of chromatography; John Wiley & Sons Inc.: New York, 2004. Scott, R. P. W. Techniques and practice of chromatography; Chromatographic Science Series; Marcel Dekker: New York, 1995. Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to modern liquid chromatography; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1979. Snyder, L. R.; Kirkland, J. J.; Glajch, J. L. Practical HPLC method development; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1997. Szczepaniak, W. Metody instrumentalne w analizie chemicznej; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 1996. Talamona, A. Laboratory Chromatography Guide; Büchi Labortechnik AG: Flawil, Switzerland, 2005. Viehweger, K. H. (red.) Praktyczna chromatografia jonowa; Metrom: Herisau, Szwajcaria, 2010. Willard, H. H.; Merritt, L. J.; Dean, J. A.; Settle, F. A. Instrumental Methods of Analysis; Wadsworth Publishing Company: Belmont, USA, 1988. Witkiewicz, Z.; Hepter, J. Chromatografia gazowa; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2001. Witkiewicz, Z. Podstawy chromatografii; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1992. Witkiewicz, Z. (red.); Soczewiski, E. (red.); Suprynowicz, Z. (red.) Nomenklatura 204

chromatograficzna; Polskie Towarzystwo Chemiczne: Warszawa, 1996. 26. Zieliski, W.; Rajca, A.; Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji zwizków organicznych; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1995.

205

IV. Techniki elektromigracyjne

1. Wstp

Przyloenie pola elektrycznego do wodnego roztworu elektrolitu zawsze powoduje ruch jonów w kierunku elektrod o przeciwnym znaku ladunku elektrycznego. Jeli w roztworze elektrolitu znajduj si makroczsteczki obdarzone niezrównowaonym ladunkiem elektrycznym (makrojony), bd si one równie przemieszczaly w kierunku elektrod, ale z inn prdkoci. Rónice w prdkoci poruszania si jonów w polu elektrycznym s podstaw rozdzielania za pomoc technik elektromigracyjnych. Migracji jonów i makrojonów towarzysz zjawiska fizyczne okrelane mianem elektrolizy oraz elektroforezy. Elektroliza - proces zachodzcy przy powierzchni elektrod, polegajcy na odkladaniu si substancji, pochodzcych z elektrolitu, na elektrodach pod wplywem przeplywajcego prdu (reakcje utleniania i redukcji). Procesy te opisywane s ilociowo prawami elektrolizy Faraday'a. Elektroforeza (grecki: elektron ­ elektryczno + phoresis ­ przenoszenie) jest zjawiskiem elektrokinetycznym, zachodzcym w objtoci elektrolitu, w którym makroczsteczki obdarzone niezrównowaonym ladunkiem elektrycznym przemieszczaj si pod wplywem przyloonego pola elektrycznego w kierunku elektrody o przeciwnym ladunku. Jony w rodowisku wodnym posiadaj otoczk hydratacyjn, czyli uklad dipoli wodnych, zwizanych z jonem do slabymi silami oddzialywania elektrostatycznego. Zarówno obecno otoczki hydratacyjnej, jak i jej wielko w istotny sposób wplywaj na moliwo ruchu jonów i makrojonów w otaczajcym je rodowisku. Wlaciwoci otoczki hydratacyjnej zale od rozmiaru jonu i zgromadzonego na nim niezrównowaonego ladunku elektrycznego oraz od wlaciwoci elektrolitu, tj. jego sily jonowej oraz wartoci pH. O ile rozmiar jonu i zgromadzony na nim ladunek ju nie mog by zmieniane, to wlaciwoci elektrolitu mog by latwo modyfikowane dla uzyskania lepszej rozdzielczoci. Sila jonowa () - jest funkcj stenia jonów elektrolitu (buforu) i równa jest polowie sumy iloczynów ste molowych i kwadratów ladunków wszystkich jonów znajdujcych si w roztworze:

µ=

1 n i=1 ci zi2 2

(1)

gdzie: n ­ liczba rodzajów jonów, ci ­ stenie i-tego jonu [mol/dm3], zi ­ ladunek i-tego jonu. Dla elektrolitów o niewielkim steniu, gdy odlegloci pomidzy jonami, a cilej pomidzy otoczkami jonów s due, wzrost wartoci sily jonowej powoduje wzrost wartoci przewodnoci jonowej elektrolitu, spowodowany wzrostem liczby noników ladunku elektrycznego. Dalszy wzrost wartoci sily jonowej powoduje zagszczenia jonów i ich otoczek hydratacyjnych. Pojawiajce si tarcie pomidzy otoczkami zaczyna odgrywa decydujc rol w ich ruchu w polu elektrycznym, w zwizku z tym przewodnictwo elektryczne elektrolitu znaczco spada. Wplyw wartoci sily jonowej na zachowanie jonów w polu elektrycznym naley uwzgldnia przy doborze skladu elektrolitów 206

przeznaczonych do elektroforezy Biorc pod uwag wplyw wartoci sily jonowej na zachowanie jonów w polu elektrycznym naley podkreli wag doboru skladu elektrolitów przeznaczonych do elektroforezy. Istotne jest zachowanie rozsdnego stosunku liczby jonów do liczby makrojonów tak, aby przenoszony przez elektrolit ladunek elektryczny rozkladal si korzystnie na wszystkie obecne tam jony. Zbyt wysokie stenie jonów powoduje ograniczenie ich ruchliwoci, natomiast zbyt niskie, wplywa na niedobór noników ladunku elektrycznego. Wzrost opornoci elektrycznej roztworu spowodowany niedoborem noników ladunku elektrycznego, podczas elektroforezy przeprowadzanej w warunkach stalego natenia prdu, wymusza wzrost napicia niezbdnego dla przeplywu prdu. To z kolei powoduje zwikszenie iloci ciepla wydzielanego w obrbie elektrolitu, która moe mie istotny wplyw na rozdzielczo. Warto pH, czyli miara stenia jonów wodorowych (hydroniowych) w elektrolicie, ma szczególnie istotne znaczenie w odniesieniu do separacji bialek i peptydów. Zwizki te posiadaj wlasnoci amfoteryczne, czyli s obdarzone wypadkowym ladunkiem elektrycznym dodatnim albo ujemnym, w zalenoci od warunków rodowiskowych. Ladunek elektryczny bialek pochodzi z, zalenej od wartoci pH, jonizacji bocznych lacuchów grup karboksylowych oraz grup aminowych: -COOH COO- + H+ -NH2 + H+ -NH3+ - rodowisko zasadowe - rodowisko kwasowe

Wypadkowy ladunek elektryczny czsteczki peptydu lub bialka zaley od wartoci pH roztworu i jest równy zero przy wartoci pH, charakterystycznej dla danego bialka lub peptydu, zw. punktem izoelektrycznym (pI). W rodowisku o wartoci pH < pI bialko obdarzone jest ladunkiem dodatnim, wic migruje w kierunku elektrody ujemnej. W celu uzyskania odpowiedniej separacji amfoterycznych skladników mieszaniny, konieczne jest utrzymywanie stalej wartoci pH elektrolitu. W trakcie rozdzielania elektroforetycznego warto pH elektrolitu zmienia si na skutek zachodzcej elektrolizy wody, w której wyniku na katodzie generowane s jony H+, natomiast na anodzie - OH-. Dlatego stal warto pH podczas rozdziele elektroforetycznych osiga si poprzez buforowanie stosowanych elektrolitów. Zachowanie si makrojonu w polu elektrycznym zaley od jego parametrów. Na makrojon dziala sila F, która jest proporcjonalna do natenia wytworzonego pola elektrycznego oraz ladunku zgromadzonego na molekule

F = Eq

gdzie: q ­ ladunek zgromadzony na makrojonie [C], E - natenia pola elektrycznego [V/cm].

(2)

Natenie wytworzonego pola elektrycznego E jest proporcjonalne do przyloonego napicia U oraz odwrotnie proporcjonalne do odlegloci pomidzy elektrodami:

E=

gdzie:

U I

(3)

U ­ przyloone napicie elektryczne (rónica potencjalów), l - odleglo pomidzy elektrodami (przyloonymi potencjalami).

207

Polczenie obu powyszych równa daje wyraenie na sil F dzialajc na makrojon o ladunku q umieszczony w ukladzie, do którego przyloone jest napicie U:

F=

qU I

(4)

Z powyszego wzoru wynika, e wzrost wartoci przyloonego napicia U powoduje zwikszenie natenia wytworzonego pola F, a wic zwikszenie sily dzialajcej na makrojon, co powoduje szybsz jego migracj. Natomiast zwikszenie odlegloci l pomidzy elektrodami wplywa na zmniejszenie natenia wytworzonego pola elektrycznego, czyli spowalnia migracj makroczsteczki. Makrojon osiga prdko graniczn, która jest wypadkow oporu rodowiska i wytworzonego pola elektrycznego. Dla makrojonu o ksztalcie kulistym (zgodnie z prawem Stokesa) mona zapisa nastpujc zaleno:

Eq = 6rv

gdzie: - lepko rodowiska, w którym migruje jon, r - promie makrojonu, - prdko ruchu makrojonu.

(5)

Podstaw rozdzialów elektroforetycznych jest rónica w prdkociach migracji czstek obdarzonych ladunkiem w polu elektrycznym o stalym nateniu. Prdko migracji v [cm·s-1] w kierunku elektrod jest róna dla rónych czsteczek i zaley od natenia pola elektrycznego E [V/cm] oraz ruchliwoci elektroforetycznej danej czsteczki µef :

v = µef E

(6)

Prdko przemieszczania si naladowanych elektrycznie makroczsteczek zaley od ich ladunku, rozmiaru, ksztaltu oraz oporów ruchu rodowiska. Dana molekula bdzie porusza si ze stal prdkoci, jeeli w trakcie analizy nastpujce parametry nie ulegn zmianie:

· · · · · ·

rónica potencjalów, natenie prdu, pH rodowiska, temperatura roztworu, przewodno roztworu, lepko roztworu.

Ruchliwo elektroforetyczna µef [m2·V-1·s-1] jest wielkoci charakterystyczn dla makrojonu w danym orodku. Jest ona proporcjonalna do wartoci ladunku czsteczki q [C], natomiast odwrotnie

208

proporcjonalna do lepkoci rodowiska [kg·m-1·s-1] i promienia czstki r [cm] (mniejsze czsteczki obdarzone wikszym ladunkiem wykazuj szybsz migracj):

µ ef =

q 6r

(7)

Czynniki wplywajce na ruchliwo elektroforetyczn makrojonu, to: · rodzaj i stenie buforu, · pH buforu, · temperatura, · natenie pola elektrycznego, · wlaciwoci i rodzaj rozdzielanego materialu. Przy rozwaaniu procesów zachodzcych w technikach elektromigracyjnych naley pamita o oporze elektrycznym elektrolitu, opisywanym prawem Ohma. Prawo to przedstawia zaleno pomidzy przyloonym napiciem U, a plyncym w wyniku tego prdem I [A] oraz oporem elektrycznym (rezystancj) R [] elektrolitu: U = IR (8) Podczas przeplywu prdu elektrycznego, w wyniku wykonywania pracy przesunicia ladunku elektrycznego przez pole, na opornociach obwodu tracona jest moc P [W]. Pracy tej towarzyszy wydzielanie si ciepla, zwanego cieplem Joule'a. Ilo wydzielonego ciepla QJ [J] opisuje równanie:

QJ = UIt

(9)

W czasie trwania elektroforezy nastpuje wzrost temperatury elektrolitu na skutek wydzielania ciepla Joule'a. Zwykle ze wzrostem temperatury obnia si oporno elektrolitu, co powoduje wzrost prdkoci migracji makrojonów, dlatego utrzymywanie stalej temperatury w czasie seapracji jest konieczne dla osigania zadowalajcych i powtarzalnych rezultatów elektroforetycznej separacji. Zmienna temperatura podczas separacji elektroforetycznych wplywa na jako uzyskanych wyników: · powoduje znaczne poszerzenie pasma migrujcej substancji, co obnia rozdzielczo procesu separacji, · powoduje nierównomierne przemieszczanie si frontu elektroforezy; makrojony w centralnej czci nonika, gdzie moe by wysza temperatura ni przy bocznych jego krawdziach, migruj znacznie szybciej z powodu niszego oporu ni ich odpowiedniki znajdujce si poza centrum nonika. Zbyt wysoka temperatura moe powodowa tzw. przegrzanie ukladu, co moe by ,,szkodliwe" zarówno dla rozdzielanych substancji jak i samego sprztu: · moe nastpi strata analitów, np. na skutek ich denaturacji i inaktywacji w podwyszonej temperaturze, · moe nastpi uszkodzenie zestawu do elektroforezy, na skutek termicznych odksztalce lub nawet pkni niektórych jego elementów. Dobrej jakoci aparaty do elektroforezy maj moliwo odprowadzania lub rozpraszania nadmiaru ciepla z ukladu, w celu zapobieenia ewentualnym zniszczeniom.

209

2. Podzial technik elektroforetycznych

Ze wzgldu na sposób prowadzenia separacji stosowane w praktyce metody elektroforetyczne s pochodnymi lub kombinacjami trzech podstawowych rodzajów separacji (Rysunek 1):

· · ·

elektroforeza strefowa (ZE - zone electrophoresis), izotachoforeza (ITP - isotachphoresis), ogniskowanie izoelektryczne (IEF - isoelectric focusing).

Rysunek 1. Zasady rozdziele: a) - elektroforeza strefowa, b) ­ izotachoforeza, c) - ogniskowanie izoelektryczne

Elektroforeza strefowa - rozdzielanie makrojonów odbywa si na podstawie rónic w ich ruchliwoci przy stalej wartoci pH (staly uklad buforów) i przy stalym nateniu pola elektrycznego. Izotachoforeza - rozdzielanie prowadzone jest w nieciglym systemie buforów. Zjonizowana próbka wdruje pomidzy ,,szybkim" elektrolitem wiodcym a ,,wolnym" elektrolitem koczcym. Makrojony o najwyszej ruchliwoci elektroforetycznej poruszaj si tu za jonami elektrolitu

210

wiodcego, a te o najmniejszej ruchliwoci elektroforetycznej wdruj bezporednio przed jonami elektrolitu koczcego. Ogniskowanie izoelektryczne - metoda stosowana do rozdzielania substancji amfoterycznych np. bialek i peptydów, których ladunek elektryczny zaley od wartoci pH. Rozdzielanie prowadzone jest w gradiencie pH. Przy pH powyej i poniej wartoci punktu izoelektrycznego czstka jest obdarzona ladunkiem, wic przesuwa si w kierunku anody lub katody do momentu dotarcia do punktu, w którym warto pH odpowiada wlaciwemu jej punktowi izoelektrycznemu. W punkcie tym sumaryczny ladunek czstki substancji amfoterycznej wynosi zero, wic jest czstk obojtn i zatrzymuje si (ogniskuje w jednym miejscu). Ze wzgldu na ,,rodowisko", w którym poruszaj si jony wyrónia si: · · elektroforez swobodn - bezporednio w roztworze elektrolitu (np. elektroforeza kapilarna), elektroforez w noniku elektroforetycznym (bibula, azotan celulozy, agaroza, poliakryloamid i innych), wypelnionym odpowiednim elektrolitem.

Elektroforeza swobodna, nie liczc elektroforezy kapilarnej, jest rzadko uywana, ze wzgldu na dyfuzj termiczn oraz konwekcj rozdzielanych czstek. Skutkiem tego jest rozmycie próbki jeszcze przed rozpoczciem wlaciwego procesu separacji, w zwizku z tym uzyskuje si bardzo slab jako rozdzielania analizowanych substancji. Problem ten zostal rozwizany przez zastosowanie nonika, np. elu lub bibuly, stabilizujcego elektrolit, ale równie wplywajcego na lepsz separacj makroczsteczek przez ich dodatkowe frakcjonowanie na zasadzie chromatografii wykluczania. Sporód wymienionych powyej noników najpowszechniej wykorzystywany jest obecnie el poliakrylamidowy (ze wzgldu na jego wlaciwoci), który zostal szczególowo omówiony w podrozdziale 2.2.1. Ze wzgldu na geometri nonika elektroforetycznego (przestrze, w której umieszczony jest nonik nazywa si komor elektroforetyczn) mona wyróni: · · elektroforez kapilarn (ang. capillary electrophoresis), elektroforez elow na plaszczynie: pionow (ang. vertical electrophoresis) oraz poziom (ang. horizontal electrophoresis).

2.1. Elektroforeza kapilarna Pocztki elektroforezy kapilarnej sigaj lat 30 ubieglego wieku, kiedy to szwedzki uczony Tisselius zbudowal zestaw skladajcy si z rurki w ksztalcie litery U, do której koców przylczyl ródlo zasilania prdem elektrycznym a w rodku umiecil mieszanin bialek. W wyniku tego eksperymentu zaobserwowal, e bialka migruj do koców elektrod z rónymi prdkociami. Uzyskiwane przez niego rozdzielenia nie byly zbyt udane na skutek malej rozdzielczoci, wynikajcej z dyfuzji termicznej oraz konwekcji rozdzielanych czsteczek. Z powodu tych ogranicze, przez nastpne lata rozwój tej techniki dotyczyl tylko elektroforezy, w której elektrolit umieszczany byl we wspomnianych ju wczeniej nonikach. Dopiero w latach 70 ubieglego wieku, po zastosowaniu kapilar o bardzo malej rednicy, rozpoczl si szybki rozwój elektroforezy kapilarnej. Schemat zestawu do elektroforezy kapilarnej przedstawiony jest na rysunku 2. Aparat sklada si z dwóch zbiorników z elektrolitem podstawowym, w którym zanurzone s koce kapilary oraz dwie elektrody platynowe z podlczonym napiciem prdu elektrycznego. 211

Rysunek 2. Schemat zestawu do elektroforezy kapilarnej Niewielka ilo analizowanego materialu, rzdu kilku nanogramów, zawarta w roztworze próbki o objtoci 10-100 nL, dozowana jest do anodowego koca kapilary. Do dozowania tak malych objtoci próbki, najczciej wykorzystywany jest jeden z trzech podstawowych sposobów (rysunek 3): · · hydrodynamiczno-grawitacyjny (najczciej stosowany), polega na umieszczeniu anodowego koca kapilary w naczyniu z roztworem próbki, znajdujcym si wyej wzgldem katodowego koca kapilary, hydrodynamiczno-cinieniowy, polega na umieszczeniu wlotu kapilary w szczelnym zbiorniku z próbk i zastosowaniu wysokiego cinienia, lub umieszczenie wylotu kapilary w szczelnym zbiorniku, w którym wytworzone jest podcinienie, elektrokinetyczny, polega na umieszczeniu anody w naczyniu z próbk i przyloeniu do koców kapilary napicia rzdu 5 kV - rozdzielana mieszanina zostaje wprowadzona do kapilary dziki przeplywowi elektroosmotycznemu.

kapilara

·

a)

[lub prónia]

cinienie próbka kapilara

b)

próbka

c)

+ kapilara

próbka

Rysunek 3. Sposoby dozowania próbek do kapilary: a) hydrodynamiczno-cinieniowy; b) hydrodynamiczno-grawitacyjny; c) elektrokinetyczny 212

W elektroforezie kapilarnej powszechnie wykorzystuje si kapilary ze szkla krzemowego o wewntrznej rednicy 20-100 m i dlugoci 20-100 cm (rysunek 4). W zalenoci od rodzaju elektroforezy, stosuje si kapilary z wypelnieniem (el) lub bez wypelnienia. Wewntrzna powierzchnia kapilar, w zalenoci od potrzeb, moe by pozostawiona bez obróbki lub pokryta substancjami chemicznymi (polimetylosiloksanem, glikolem polietylenowym, polietylenem, amidem poliakrylowym, metyloceluloz i in.). Wlaciwoci rozdzielcze kolumny zale od uytej substancji, np. uycie polimetylosiloksanu zwiksza przeplyw elektroosmotyczny, natomiast uycie glikolu polietylenowego przeplyw ten zmniejsza.

Otoczka poliimidowa

Stopiona krzemionka

Wntrze kapilary

Rysunek 4. Przekrój poprzeczny kolumny kapilarnej

Do obu koców kapilary zanurzonych w pojemnikach z odpowiednimi elektrolitami (buforami) przykladane jest wysokie napicie (do 30 kV i 10 mA), co powoduje powstanie we wntrzu kapilary pola elektrycznego o wartoci do 500 V/cm. W zwizku z mal wewntrzn objtoci kapilary, która limituje ilo wprowadzanych analitów, elektroforeza kapilarna wymaga ekstremalnej czulo detektora. Detekcja prowadzona jest u wylotu kapilary przy pomocy detektorów o konstrukcji zblionej do przeplywowych detektorów stosowanych w chromatografii cieczowej. Oczywicie, w zwizku z mal iloci wprowadzonych analitów, wykrywalno ich jest znaczco mniejsza w porównaniu do klasycznej chromatografii cieczowej. Zestawienie sposobów detekcji wykorzystywanych w elektroforezie kapilarnej przedstawione jest w tab. 1. Czas analizy jednej próbki wynosi okolo 10-20 minut. Proces separacji jest sterowany a dane zbierane za pomoc komputera.

Tabela. 1. Zestawienie najczciej stosowanych detektorów w elektroforezie kapilarnej

Detektor UV/Vis Z laserowym wzbudzeniem fluorescencji MS Amperometryczny Konduktometryczny Wymagania Obecno chromoforów Obecno fluoroforów (derywatyzacja) Ladunek Identyfikacja Tak/nie Nie granica oznaczalnoci [mol] 10-5-10-7 10-13-10-16

Tak Nie Nie

10-8-10-10 10-7-10-10 10-7-10-9

213

Kapilarne techniki elektroforetyczne s stosunkowo blisko spokrewnione z chromatografi cieczow. Posiadaj szereg zalet w porównaniu z HPLC, np. wysok sprawno i szybko rozdzielania, trwale i uniwersalne kapilary, moliwo separacji bardzo malych iloci substancji i w zwizku z tym, niewielkie zuycie rozpuszczalników. Wad kapilarnych metod elektroforetycznych jest mala czulo, wynikajca ze wspomnianych wczeniej niewielkich ste analizowanych substancji i malej objtoci próbki wprowadzanej do detektora, zamontowanego u wylotu kapilary. Szacuje si, e czulo elektroforezy kapilarnej jest 10-100 razy mniejsza od HPLC. W elektroforezie kapilarnej, podobnie jak w chromatografii gazowej lub cieczowej, sprawno elektroforezy mona wyrazi liczb pólek teoretycznych, która moe by wyliczona z wyraenia:

N=

gdzie:

µ ef V

2D

(10)

D - wspólczynnik dyfuzji.

Z równania wynik, e liczba pólek jest proporcjonalna do przyloonego napicia, jednak naley pamita, e przyloenie wysokiego napicia powoduje wydzielanie duej iloci ciepla co znacznie obnia sprawno ukladu. W HPLC liczba pólek teoretycznych wynosi najczciej do 10 000, natomiast w elektroforezie nawet do 250 000. Sprawno mona równie wyliczy bezporednio wykorzystujc zalenoci znane z chromatografii: z

2

zarejestrowanego

elektroforegramu

t N = 5,545 m W 1/ 2

gdzie:

2

lub

t N = 16 m W b

(11)

tm- czas migracji, W1/2 ­ szeroko piku w polowie wysokoci, Wb ­ szeroko piku w podstawie.

Rozdzielczo Rs dwóch sygnalów moe by obliczona ze wzoru:

RS = 1 / 4

gdzie:

µ ef

µ ef

N

(12)

µ ef - rónica w ruchliwoci elektroforetycznej dwóch rozdzielanych substancji,

µ ef - rednia ruchliwo elektroforetyczne dwóch rozdzielanych substancji.

który po uwzgldnieniu równania 10 moe by przedstawiony w postaci:

R S = (0,177 )

µ ef V µef D

(13)

Selektywno w elektroforezie kapilarnej mona wyznaczy z zalenoci:

=

t m 2 - t0 tm1 - t0

(14)

214

gdzie:

tm1 i tm2 ­ czasy migracji ssiednich pików, t0 ­ czas migracji substancji, której czsteczki nie maj ladunków. Zjawisko elektroosmozy

W elektroforezie kapilarnej na szybko migracji analitów w kapilarze, oprócz wspomnianej wczeniej ruchliwoci elektroforetycznej, decydujcy wplyw ma zjawisko osmozy i zwizana z nim ruchliwo elektroosmotyczna µeo. Wysokie napicie przyloone do koców kapilary wypelnionej roztworem elektrolitu, powoduje tzw. przeplyw elektroosmotyczny, czyli przemieszczanie si calej masy elektrolitu w kierunku jednej z elektrod. Przeplyw elektroosmotyczny zaley od ladunków rozmieszczonych na powierzchni kapilary. Obecno tych ladunków a take ich rodzaj i ilo zwizana jest z jonizacj cianki kapilary lub adsorpcj jonów buforu. Wewntrzna cianka kapilary wykonana ze stopionej krzemionki i przy pH > 3 posiada ladunek ujemny, z powodu dysocjacji grup silanolowych SiOH (przy niszej wartoci pH jonizacja nie jest calkowita). Kationy elektrolitu podstawowego przycigane s przez ladunki ujemne na ciankach kapilary (SiO-), w wyniku czego na granicy faz roztwór/kapilara powstaje wewntrzna (zwizana) oraz zewntrzna (dyfuzyjna) warstwa kationów, tworzca podwójn warstw elektryczn (rysunek 5). Kationy warstwy zewntrznej przycigane s przez ujemn katod, a poniewa kationy te s solwatowane przez czsteczki rozpuszczalnika ,,porywaj" one razem ze sob ,,cal mas roztworu" znajdujcego si w kapilarze.

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

- - - - - - - - - - - - - - - -

cianka kapilary Wewntrzna (zwizana) warstwa kationów Zewntrzna (dyfuzyjna) warstwa kationów

,,Glbia" roztworu

Rysunek 5. Schematyczne przedstawienie podwójnej warstwy elektrycznej w kapilarze elektroforetycznej

Pomidzy warstwami wytwarza si tzw. potencjal zeta ( ), którego warto mona wyliczy z zalenoci:

=

gdzie:

4e

(15)

e ­ ladunek jednostki powierzchni, - grubo dyfuzyjnej warstwy podwójnej, - stala dielektryczna.

215

Natomiast szybko przeplywu elektroosmotycznego z uwzgldnieniem potencjalu mona wyrazi wzorem:

eo =

E 4

(16)

Szybko przeplywu elektroosmotycznego jest zazwyczaj wiksza od szybkoci elektroforetycznych poszczególnych jonów, co powoduje, e zarówno kationy, czstki obojtne jak i aniony poruszaj si w kierunku katody. Szybko, z jak dany jon porusza si w kierunku katody vobs [cm/s] (szybko obserwowana) jest wypadkow ruchliwoci elektroforetycznej oraz elektroosmotycznej i jest opisywana nastpujc zalenoci:

v obs = ( µef + µeo ) E

gdzie:

(17)

µeo ­ ruchliwo elektroosmotyczna, µef ­ ruchliwo elektroforetyczna.

W ,,klasycznej elektroforezie" ruchliwo elektroforetyczna anionów µef przyjmuje wartoci ujemne (aniony wdruj w kierunku anody, a kationy w kierunku katody). W elektroforezie kapilarnej, w wyniku istnienia przeplywu elektroosmotycznego oraz faktu, e w wikszoci przypadków ruchliwo elektroosmotyczna przyjmuje wiksz warto od ruchliwoci elektroforetycznej, w detektorze na kocu kapilary pojawiaj si kolejno wszystkie czsteczki analitu, niezalenie od zgromadzonego na nich ladunku (rysunek 6). I tak kolejno, w jakiej rozdzielane czsteczki docieraj do katodowego koca kapilary przedstawia si nastpujco: · male obdarzone duym ladunkiem kationy, · wiksze kationy o mniejszym ladunku, · nierozdzielone czsteczki obojtne, · due aniony o malym ladunku, · male aniony posiadajce duy ladunek elektryczny.

Anoda (+)

-- -

-

n

+

+

++

Katoda (-)

Kierunek przeplywu elektroosmotycznego Prdko Prdko Prdko obserwowana elektroosmotyczna elektroforetyczna

kation

czsteczka

obojtna

anion

+ + +

= = =

216

Rysunek 6. Kolejno czsteczek docierajcych do katody w elektroforezie kapilarnej

Przeplyw elektroosmotyczny jest generowany przy ciankach kapilary na calej jej dlugoci, dlatego te charakteryzuje si on stal szybkoci przeplywu w calym jego przekroju. Plaski profil przeplywu elektroosmotycznego jest bardziej korzystny od przeplywu laminarnego, spotykanego, np. w technikach chromatograficznych (rysunek 7). W przeplywie laminarnym, który jest wymuszany przez zastosowanie cinienia na jednym z koców kapilary, roztwór znajdujcy si w rodku porusza si szybciej ni roztwór bdcy bliej cianek, co powoduje poszerzenie strefy zajmowanej przez próbk w kapilarze i co za tym idzie równie poszerzenie sygnalów z detektora.

a)

b)

Rysunek 7. Porównanie HPLC i CE; a) - porównanie przeplywu elektroosmotycznego (CE) i laminarnego (HPLC), b) ­ porównanie uzyskiwanych rozdzielczoci Analiza ilociowa i jakociowa

W elektroforezie kapilarnej analiza ilociowa i jakociowa wykonywana jest w podobny sposób jak w chromatografii gazowej czy cieczowej. Identyfikacji dokonuje si poprzez porównanie czasów migracji oznaczanych substancji z czasami migracji odpowiednich wzorców lub poprzez polczenia z detektorami takimi jak spektrometr mas lub spektrofotometr UV-Vis. Analiz ilociow wykonuje si wykorzystujc metod krzywej kalibracyjnej, metod wzorca wewntrznego lub metod wzorca zewntrznego opisanych w rozdziale III. Techniki chromatograficzne.

Zalety elektroforezy kapilarnej

Kapilarne techniki elektromigracyjne, które s blisko spokrewnione z HPLC, posiadaj szereg istotnych zalet, z których na podkrelenie zasluguj:

· · · · · · ·

moliwo analizowania zwizków zarówno o duej jak i o malej masie czsteczkowej, obdarzonych ladunkiem lub obojtnych, dua czulo metody (przy wykorzystaniu odpowiednich detektorów) umoliwiajca analizowanie bardzo malych iloci substancji, stosunkowo dua niezawodno, wysoka sprawno i selektywno, latwo przygotowania próbek (czsto wystarczy odpowiednie rozcieczenie), krótki czas analizy i moliwo automatyzacji rozdziele, niewielka ilo odczynników potrzebna do analizy, trwale i dlugo przydatne do analizy kapilary.

217

2.1.1. Strefowa elektroforeza kapilarna Strefowa elektroforeza kapilarna (ang. capillary zone electrophoresis, CZE) - podstawowa i najczciej wykorzystywana odmiana elektroforezy kapilarnej, która zostala omówiona na pocztku tego podrozdzialu (Elektroforeza kapilarna). Separacja polega na wykorzystaniu rónicy w szybkociach migracji poszczególnych jonów. Technika ta ma zastosowanie do rozdzielenia substancji posiadajcych ladunek. Niemoliwe jest jej wykorzystanie do rozdzielania substancji elektrycznie obojtnych. 2.1.2. Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (ang. micellar electrokinetic capillary chromatography, MEKC) - odmiana elektroforezy kapilarnej pozwalajca na separacj czsteczek obojtnych, aczkolwiek moe by równie wykorzystywana do czstek obdarzonych ladunkiem. Stosowane s jonowe zwizki powierzchniowo czynne (surfaktanty), które w steniu przekraczajcym krytyczne stenie micelarne tworz micele. Gdy w roztworze brak jest surfaktanta, lub jego stenie nie jest wystarczajce, aby powstaly micele, czstki obojtne poruszaj si w kierunku katody z szybkoci równ szybkoci przeplywu elektroosmotycznego. W przypadku obecnoci miceli, rozdzielana substancja elektrycznie obojtna ulega podzialowi midzy roztwór elektrolitu, a niepolarne wntrze miceli (separacja dokonuje si na podstawie rónic stalych podzialu analitów elektrolit/hydrofobowa faza wntrza miceli (rysunek 8). Substancje hydrofobowe przemieszczaj si wewntrz miceli z prdkoci inn ni znajdujce si w roztworze substancje hydrofilowe. Polarno elektrolitu (faza wodna) moe by zmieniana w zalenoci od potrzeb przy wykorzystaniu rónych modyfikatorów organicznych np. metanol lub acetonitryl. Równie wlaciwoci fazy micelarnej mog by modyfikowane przez dobór odpowiednich detergentów, np. dodecylosulfonian sodu (SDS), sole kwasów ólciowych, sole amoniowe z lacuchem wglowodorowym. Przy najczciej stosowanym surfaktancie anionowym SDS, micele posiadaj sumaryczny ladunek ujemny, co powoduje, e czsteczka niepolarna, znajdujca si we wntrzu takiej miceli porusza si wolniej od przeplywu elektroosmotycznego. Wynika to z faktu, i kierunek migracji miceli i przeplywu elektroosmotycznego s przeciwne. Jednak przeplyw elektroosmotyczny jest wikszy od ruchliwoci miceli i przenosi je wraz z ,,zawartymi" analitami w kierunku katody.

czsteczka obojtna

Rysunek 8. Schemat tworzenia miceli z czsteczek surfaktanta

Rozdzielczo w MEKC moe by przedstawiona za pomoc równania: 218

1 - t0 t N - 1 k2 mc RS = 4 1 + k 2 1 + t0 k 1 t mc

(18)

gdzie:

t0 ­ czas migracji markera przeplywu elektroosmotycznego, najczciej metanolu, tmc ­ czas migracji miceli. 2.1.3. Kapilarna elektroforeza elowa Kapilarna elektroforeza elowa (ang. capillary gel electrophoresis, CGE) - wypelnienie kapilary stanowi el, który dziala jak sito molekularne. Najczciej stosowany jest omawiany ju wczeniej el poliakryloamidowy, którego usieciowanie dobiera si na podstawie wielkoci rozdzielanych molekul. Skladniki próbki migruj wzdlu kapilary z szybkoci zalen od ich wielkoci (mniejsze migruj szybciej). Separacja skladników mieszanin odbywa si najczciej w wyniku mechanizmu mieszanego, tzn. rozdzielania w elektroforezie kapilarnej zwizanego z obecnoci ladunku na molekule oraz efektu wykluczania, zwizanego z obecnoci porowatego elu w kapilarze. 2.1.4. Ogniskowanie izoelektryczne Ogniskowanie izoelektryczne (ang. capillary isoelectric focusing, CIEF) - modyfikacja elektroforezy wykorzystywana jest do separacji czsteczek amfiprotycznych (posiadajcych zarówno ladunki dodatnie jak i ujemne, jak aminokwasy, peptydy, bialka). Przy pewnej charakterystycznej wartoci pH (punkt izoelektryczny pI, charakterystyczny dla kadego bialka lub peptydu), ladunek dodatni czsteczki jest równy ladunkowi ujemnemu, w zwizku z tym elektrycznie obojtna molekula nie migruje w polu elektrycznym. W metodzie tej kapilara wypelniona jest roztworem buforowym o rónej wartoci pH (gradient pH we wntrzu kapilary pozostaje staly w czasie analizy). Próbka wprowadzana jest do koca kapilary o niszej wartoci pH, skladniki mieszaniny posiadajce ladunek dodatni wdruj w kierunku katody i detektora. Dany skladnik mieszaniny zatrzymuje si, gdy dotrze do tej czci kapilary, gdzie warto pH odpowiada jego punktowi izoelektrycznemu. Jeeli czsteczki w wyniku dyfuzji przejd do ssiedniej strefy, to w wyniku zmiany pH, uzyskaj ladunek i ponownie migruj do strefy izoelektrycznej. W wyniku ogniskowania anality skupiane s w wskich strefach w kapilarze, skd mog by latwo usuwane za pomoc pneumatycznej pompy. Proces monitorowania ,,uzyskanych stref" odbywa si w detektorze umieszczonym na kocu kapilary. Rozdzielczo CIEF moe by przedstawiona za pomoc wyraenia:

pI = 3

gdzie:

D (dpH / dx ) E (- dµ / dpH )

(19)

pI - rónica pI pomidzy dwoma ssiednimi pasmami amfolitów, D - wspólczynnik dyfuzji amfolitu, E - natenie pola elektrycznego, dpH / dx - gradient pH, - dµ / dpH - spadek mobilnoci.

219

Z powyszego równania wynika, e rozdzielczo tej techniki moe by poprawiona poprzez zwikszenie natenie pola elektrycznego, obnienie wspólczynnika dyfuzji, wski gradient pH oraz wysoki spadek mobilnoci.

2.1.5. Izotachoforeza kapilarna

W izotachoforezie kapilarnej (ang. capillary isotachophoresis, CITP) wykorzystuje si dwa róne uklady buforowe. Próbk umieszcza si pomidzy elektrolitem wiodcym, o wikszej ruchliwoci od jonów próbki a terminujcym, o mniejszej ruchliwoci od jonów próbki. Podczas jednorazowej analizy technik izotachoforezy mog by rozdzielane tylko jony o tym samym znaku. Elektrolit podstawowy dobiera si w taki sposób, aby kation lub anion elektrolitu wiodcego (ang. Leading Electrolyte, LE) i terminujcego (ang. Terminating Electrolyte, TE) mial odpowiednio najwysz i najnisz ruchliwo () w stosunku do oznaczanych analitów, co oznacza, e warunkiem rozdzielenia metod izotachoforezy jest nastpujca zaleno

µLE > µanalitu > µTE Skladniki próbki rozdzielaj si zgodnie ze swoj ruchliwoci w formie odrbnych stref. W wyniku przeprowadzonego rozdzielenia otrzymuje si izotachoferogram schodkowy. Wysoko schodka, mierzona od podstawy, czyli sygnalu (schodka) elektrolitu wiodcego jest charakterystyczna dla danego jonu i na podstawie jej porównania z wysokoci wzorca mona zidentyfikowa badan substancj. Szeroko danego schodka jest proporcjonalna do iloci analitu i jest wykorzystywana do oznacze ilociowych. Schemat aparatu to przeprowadzania izotachoforezy kapilarnej przedstawiono na rysunku 9. 4 1

5 1 2 6 7 1 8 1 3 9 Rysunek 9. Analizator elektroforetyczny ItaChrom EA 101 (Merck): 1 ­ zbiornik elektrolitu terminujcego, 2, 3 ­ zbiorniki elektrolitu wiodcego, 4 - zawór dozujcy z ptl, 5 ­ kolumna wstpnego rozdzielania (przedkolumna) w obudowie, 6 ­ blok rozgalziajcy z zaworem, 7 ­ kolumna analityczna w obudowie, 8 ­ detektor spektrofotometryczny, 9 ­ blok rozdzielajcy z zaworem, 10 ­ detektor konduktometryczny przedkolumny, 11 ­ detektor konduktometryczny kolumny analitycznej, 12 ­ zbiornik na zlewki

220

Izotachoforeza, jako jedna z najszybciej rozwijajcych si technik elektromigracyjnych, znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach, m.in. w oznaczeniach zanieczyszcze rodowiska oraz analizie ywnoci, które z punktu widzenia chemii analitycznej zajmuj si analiz niejednorodnych próbek zawierajcych trudne do usunicia matryce. Przykladowy izotachoferogram z separacji mieszaniny anionów jest przedstawiony na rysunku 10. Szeroko schodka (L) oznacza dlugo kroku odpowiadajca jednemu analitowi i jest proporcjonalna do jego zawartoci w próbce badanej. Do oznacze jakociowych wykorzystuje si wysoko sygnalu danego analitu (h - wysoko mierzona od podstawy elektrolitu wiodcego) oraz wysoko calkowit mierzon od podstawy, czyli elektrolitu wiodcego, do maksimum krzywej, czyli elektrolitu terminujcego (H - elektrolitu terminujcego). W celu zidentyfikowania analitu naley wykona analiz wzorców oraz oznaczanych analitów, a nastpnie porówna wartoci stosunku h/H (wzgldna wysoko kroku), która jest charakterystyczna dla danego analitu.

Rysunek 10. Izotachoferogram przedstawiajcy rozdzielenie mieszaniny anionów: 1 ­ NO3- 2 ­ ClO3-, 3 ­ PF6-, 4 ­ [N(CN)2]-, 5 ­ [F3CSO3]- 6 ­ HPO4 2-, 7 ­ [(F3CSO2)2N]-. Uklad buforów: LE 10 mM L­histydyna, 10 mM L­histydyny monochlorowodorek; TE 5 mM kwas glutaminowy, 5 mM L­histydyna; detekcja konduktometryczna

2.1.6. Elektrochromatografia kapilarna Elektrochromatografia kapilarna (ang. capillary electrochromatography, CEC) jest polczeniem elektroforezy kapilarnej (CE) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Technika ta oferuje polczenie wysokiej sprawnoci CE z szerokim zakresem parametrów, które mog by modyfikowane w HPLC, zwlaszcza z moliwoci doboru rónych faz stacjonarnych oraz stosowania gradientu fazy ruchomej. Migracja analitów przez kolumn odbywa si dziki przeplywowi elektroosmotycznemu, który zaley od natenia pola elektrycznego, rodzaju wypelnienia kolumny, skladu fazy ruchomej oraz pH i sily jonowej zastosowanego buforu. Wykorzystanie przeplywu elektroosmotycznego, w odrónieniu od przeplywu hydraulicznego w HPLC, umoliwia stosowanie kolumne z wypelnieniami rzdu 3 µm, co znacznie polepsza rozdzielczo tej techniki. Wykorzystywane fazy stacjonarne i fazy ruchome s

221

podobne do RP HPLC (modyfikacje C8 i C18 jako fazy stacjonarne oraz wodne bufory z organicznymi modyfikatorami jako fazy ruchome). W tabeli 2 przedstawiono zastosowanie omówionych modyfikacji elektroforezy kapilarnej do analizy rónych klas zwizków chemicznych. Tabela. 2. Zastosowanie odmian elektroforezy kapilarnej do analizy rónych klas zwizków chemicznych

Elektroforeza strefowa (CZE) Ogniskowanie izoelektryczne (CIEF) Kapilarna elektroforeza elowa (CGE) Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna ( MEKC) Male czsteczki Peptydy Elektrochromatografia kapilarna (CEC) Izotachoforeza kapilarna (CITP)

Jony Male molekuly Peptydy Bialka Wglowodany

Peptydy Bialka

Kwasy nukleinowe

Male molekuly Peptydy Bialka Wglowodany

Jony Male molekuly Peptydy Bialka

2.2. Elektroforeza elowa na plaszczynie Elektroforeza elowa na plaszczynie (elektroforeza plytowa) ­ jest najpopularniejsz odmian elektroforezy ze wzgldu na stosunkowo niewielki koszt aparatury i szeroki wachlarz zastosowa. Podstaw tej techniki jest obecno nonika (el poliakryloamidowy, el agarozowy, bibula, azotan celulozy) ,,wypelnionego elektrolitem". Najczciej, jako nonik wykorzystuje si ele poliakryloamidowe lub agarozowe w postaci plyt umieszczonych pomidzy plytkami szklanymi. W zalenoci od uloenia plyt wyróniamy elektroforez elow pionow lub poziom (rys. 11).

a)

b)

Rysunek 11. Elektroforeza plytowa; a) ­ pionowa, b) ­ pozioma

222

W wyniku rozdzielania substancje wystpuj w postaci prków (pasm) na plytach nonika (rysunek 12).

Rysunek 12. Przykladowe rozdzielenie elektroforetyczne Rozdzielenie elektroforetyczne z wykorzystaniem eli sklada si z kilku etapów: · · · · · · przygotowanie elu o odpowiednim usieciowaniu, zanurzenie elu w elektrolicie. wprowadzenie analizowanych próbek do wskich studzienek na czole elu, podlczenie elektrod ­ przeprowadzenie rozdzielenia, wylczenie zasilania, wizualizacja rozdziele.

2.2.1. ele stosowane w elektroforezie ele agarozowe i poliakryloamidowe maj posta przestrzennie usieciowanych struktur, zajmujcych zaledwie okolo 0,5÷1,0 % objtoci komory rozdzielczej ukladu do elektroforezy. Pozostala przestrze wypelniona jest przez elektrolit. Rozmiary porów mog by modyfikowane na etapie przygotowania eli a ich wielko powinna by porównywalna z rozmiarami rozdzielanych jonów czy molekul (wiksze czstki doznaj wikszych oporów ruchu w polu elektrycznym, co znaczco poprawia separacj analizowanych substancji). Powszechnie wykorzystuje si ele poliakryloamidowe oraz ele agarozowe. ele akryloamidowe umoliwiaj przygotowania noników o bardzo gstym usieciowaniu i niewielkich porach, co umoliwia separacj makroczsteczek bialkowych o masach rzdu 5 kD - 300 kD lub polinukleotydów o wielkoci 5-2000 par zasad. Noniki agarozowe wykazuj mniejsze usieciowanie i wiksze pory ni ele poliakryloamidowe, dlatego mog by wykorzystywane do rozdzielania wikszych czsteczek. ele agarozowe przygotowywane s z agarozy, liniowego polisacharydu zbudowanego z 3,6-anhydroD-galaktozy i L-galaktozy, izolowanej z agaru (substancja wyodrbniana z krasnorostów). Agaroza w postaci handlowej jest bialym lub lekko óltawym proszkiem, latwo rozpuszczajcym si we wrzcej wodzie. W temperaturze poniej 40oC zestala si w postaci porowatego elu. Po zestaleniu ulega ponownemu topnieniu w temperaturze wrzcej wody. Rozmiary porowatoci mona regulowa 223

wykorzystujc roztwory agarozy o rónych steniach. Wiksze stenie agarozy powoduje powstanie eli bardziej usieciowanych i o drobniejszych porach, czyli nadajcych si do rozdzielania molekul o odpowiednio mniejszych masach czsteczkowych. Zwykle przygotowuje si ele o steniach agarozy od 0,4 do 4,0 %. Zaletami eli agarozowych jest latwo i szybko przygotowania oraz moliwo separacji duych makroczsteczek. Do wad zalicza si slab wytrzymalo mechaniczn oraz trudno ich utrwalania po rozdziale (wyschnite ele rozsypuj si pod wplywem bardzo niewielkich sil). ele poliakrylamidowe s obecnie najczciej wykorzystywanymi elami ze wzgldu na bardzo dobre wlaciwoci fizykochemiczne. Po raz pierwszy taki el zostal zrobiony przez Raymonda i Weitrauba w 1959. ele poliakrylamidowe przygotowywane s z roztworu monomerów akryloamidu i substancji sieciujcych (ang. cross-linkers) (rys. 13). Najczciej, jako substancji sieciujcej uywa si N,N'metylenobisakryloamidu (bis-akryloamid). Przy przygotowaniu elu naley zawsze pamita, e akryloamid w postaci monomerycznej jest bardzo siln neurotoksyn i nawet po procesie polimeryzacji stanowi powane zagroenie dla zdrowia ze wzgldu na pozostaloci swobodnych monomerów w objtoci elu. Reakcja polimeryzacji inicjowana jest chemicznie (nadsiarczan amonu w obecnoci katalizatora N,N,N,N-tetrametyletylenodiaminy - TEMED) lub fotochemicznie (nawietlanie promieniowaniem UV w obecnoci ryboflawiny, równie w obecnoci katalizatora - TEMED).

O NH2

akrylamid akryloamid

O

O NH NH

+

N,N'-metylenobisakrylamid

chemiczna lub fotochemiczna inicjacja reakcji polimeryzacji

CONH 2 CONH 2 HN

CONH 2 CONH2 O

HN CONH2 CONH2 O CONH2 CONH2

Rysunek 13. Schemat powstawania eli poliakryloamidowych Gsto usieciowania oraz rozmiary porów regulowane s poprzez odpowiedni dobór stenia akryloamidu i bisakryloamidu. Wlaciwoci te opisywane s za pomoc calkowitego stenia akryloamidu ­ T (ang. total), oraz dopelniajcego parametru, którym jest wagowy stosunek iloci substancji sieciujcej do sumy akryloamidu i substancji sieciujcej:

224

· ·

T [%] = ((akryloamid + bis-akryloamid) [g] / objto [ml]) x 100 C [%] = (bis-akryloamid [g] / (akryloamid + bis-akryloamid) [g]) x 100

Wybór parametrów elu uzaleniony jest od mas czsteczkowych analizowanych substancji. Do analizy substancji wielkoczsteczkowych przygotowuje si ele o mniejszym usieciowaniu (mniejszej gstoci) natomiast do analizy substancji o malych masach czsteczkowych przygotowuje si ele bardziej usieciowane. Najczciej el poliakryloamidowy wykorzystywany w rozdzieleniach elektroforetycznych sklada si z opisanego powyej elu rozdzielajcego oraz umieszczonej na nim cienkiej warsty elu zagszczajcego. Warstwa elu zagszczajcego jest mniej usieciowana, co umoliwia szybkie wnikanie naniesionych próbek w zloe, a co za tym idzie uzyskiwanie wskich pasm analizowanych zwizków. 2.2.2. Przygotowanie próbek Przygotowanie próbek jest równie wane jak wlaciwa polimeryzacja elu oraz sporzdzenie elektrolitów. Separowana próbka nie moe zawiera zbyt duej iloci soli, które w postaci zjonizowanej powoduj zaklócenie migracji makrojonów (powstawanie smug i niejednorodnoci prków). Niezmiernie wane jest równie naniesienie odpowiedniej iloci rozdzielanych substancji. Zbyt mala ilo makrojonów w próbce utrudnia detekcj, natomiast zbyt dua pogarsza warunki separacji (rozlegle i nakladajce si prki). 2.2.3. Rozdzielenie Przygotowane plytki z elem umieszcza si w odpowiednich aparatach do elektroforezy, w których elektrody zanurzone s w zbiornikach wypelnionych buforami o odpowiednim pH. Po naniesieniu rozdzielanych próbek elektrody podlcza si do ródla zasilania. Czsto nanosi si niewielk ilo barwnika, który wdruje wraz z buforem wzdlu elu i pozwala okreli moment zakoczenia analizy. Jedna z regul mówi, e ilo makroczsteczek przypadajcych na jeden prek powinna znajdowa si w przedziale 1-10 g. Po zakoczeniu analizy el wyjmuje si ostronie z aparatu i poddaje obróbce w celu wizualizacji rozdzielonych substancji.

2.2.4. Wizualizacja Wikszo bialek i kwasów nukleinowych, które s najczciej separowane za pomoc elektroforezy elowej, nie jest widoczna w wietle widzialnym. W zwizku z tym, prki substancji uzyskane po rozdziale na elach czy membranach naley wybarwi (wizualizowa), w celu uzyskania informacji o dystansie ich migracji oraz ich iloci. Do wizualizacji moe by wykorzystywane barwienie za pomoc tzw. barwników naturalnych, fluoroforów, a take barwienie enzymatyczne, immunobarwienie oraz znakowanie radioizotopowe. Naturalne barwniki, takie jak blkit kumassi (ang. coomassie brilant blue) czy czer amidowa, pozwalaj wykry 1 g bialka w prku, natomiast metod barwienia srebrem - nawet 10 ng bialka w prku. 225

Fluorofory, jak np. tradycyjnie stosowany bromek etydyny. Barwnik ten wykazuje wlaciwoci fluorescencyjne, co pozwala na obserwacj sygnalów w wietle UV (przy okolo 300 nm). Barwienie enzymatyczne dotyczy wizualizaji bialek enzymatycznych. Jest to barwienie przez przeprowadzenie specyficznej reakcji katalitycznej, w której w wyniku enzym staje si barwny. Znakowanie radioizotopowe charakteryzuje si bardzo wysok czuloci detekcji. Znakowanie makroczsteczek radioizotopami odbywa si zawsze przed procesem separacji elektroforetycznej, czsto na etapie ich syntezy. Bialka i peptydy zwykle znakuje si izotopami jodu 125I lub 131I, rzadziej izotopami wgla 14C, wodoru 3H lub siarki 35S. Oligonukleotydy najczciej znakowane s izotopem fosforu 32P lub siarki 35S. Immunobarwienie jest wysoce selektywnym barwieniem bialek i peptydów na membranach, przy zastosowaniu specyficznych przeciwcial, znakowanych fluorescencyjnie, enzymatycznie lub radioizotopowo (odpowiednie wykrywanie to detekcja: immunofluorescencyjna, immunoenzymatyczna lub radioimmunologiczna). 2.2.5. Dokumentacja rozdziele Bardzo istotna jest dokumentacja uzyskanych rezultatów oraz przechowywanie otrzymanych ,,eli". ele poliakrylamidowe, po ich wysuszeniu, mona przechowywa dowolnie dlugo bez widocznego uszczerbku pomidzy warstw bibuly i celofanu lub pomidzy dwoma warstwami celofanu. ele agarozowe nie mog by przechowywane, poniewa ulegaj zniszczeniu ju na etapie ich suszenia. W obu przypadkach najlepszym sposobem dokumentacji uzyskanych separacji jest wykonanie fotografii lub zeskanowanie.

3. Wykorzystanie technik elektromigracyjnych

Elektroforeza jest wykorzystywana do analizowania wielu indywiduów, poczynajc od calych komórek i czstek poprzez kwasy nukleinowe, bialka, peptydy, aminokwasy, organiczne kwasy i zasady, a po narkotyki, pestycydy, nieorganiczne kationy i aniony. Zastosowanie elektroforezy obejmuje m.in.: · preparatywne i ilociowe wydzielanie czystych frakcji z badanych mieszanin, · okrelanie czystoci i jednorodnoci badanych substancji, · oznaczanie punktu izoelektrycznego badanych substancji, · oznaczanie masy czsteczkowej badanych substancji, · zastosowanie do celów diagnostycznych i badawczych. Bialka, sporód wielu klas zwizków wymienionych powyej, s najczciej rozdzielanymi substancjami za pomoc elektroforezy elowej. Separacj prowadzi si przy zastosowaniu tzw. elektroforezy natywnej albo elektroforezy w obecnoci SDS. Elektroforeza natywna jest to rodzaj elektroforezy prowadzony zwykle w elu poliakryloamidowym w warunkach, w których makroczsteczki pozostaj niezdenaturowane. Zalet tej techniki jest moliwo odzyskania czsteczek bialkowych w stanie pelnej aktywnoci biologicznej, wad natomiast stosunkowo slaba rozdzielczo metody.

226

Elektroforeza w obecnoci siarczanu dodecylu sodu jest najczciej stosowan metod elektroforetyczn do separacji bialek. Zastosowanie substancji powierzchniowo czynnej SDS, prowadzi do powstania kompleksów bialko-SDS o ustalonym stosunku ladunku elektrycznego do masy (rysunek 14). SDS skutecznie maskuje oryginalny ladunek bialka, co umoliwia latwe i dokladne oznaczenie mas czsteczkowych rozdzielonych bialek (1 g bialka wie 1,4 g SDS).

-

bialko

Rysunek 14. Tworzenie kompleksów bialko-SDS

4. Literatura

Everaerts, F. M.; Beckers, J. L.; Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, Instrumentation and Applications; Elsevier: Amsterdam, 1976. 2. Kocjan, R. (red.) Chemia analityczna. Podrcznik dla studentów; Wydawnictwo Lekarskie PZWL: Warszawa, 2000; Tom 2. 3. Landers, J. P. Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated Microtechniques; CRC Press: Boca Raton, London, New York , 2008. 4. Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications; Elsevier Biomedical Press: New York , 1983. 5. Weinberger, R. Practical Capillary Electrophoresis; Academic Press: New York , 2000. 6. Westemeier, R. Electrophoresis in Practice, John Wiley & Sons Inc.: New York, 1997. 7. Witkiewicz, Z. Podstawy chromatografii; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2005. 8. Witkiewicz, Z.; Hepter, J. Slownik chromatografii i elektroforezy; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 2004. 9. Rilbe, H. Electrophoresis 1995, 16, 1354­1359. 10. Tiselius, A. Trans. Faraday Soc. 1937, 33, 524-531. 11. Piotr Diakowski; http://chemfan.pg.gda.pl/Badania/ce.html 12. Walkowiak, B.; Kochmaska, V. (red.) Elektroforeza: przyklady zastosowa; http://www.biofizyka.p.lodz.pl/elektroforeza.pdf 1.

+ SDS

227

Na stronie internetowej www.chem.univ.gda.pl/analiza w sposób cigly aktualizowane s instrukcje do wicze laboratoryjnych oraz zada rachunkowych z technik separacyjnych ­ Zapraszamy do korzystania z tych materialów Autorzy

228

Information

Microsoft Word - Techniki_separacyjne_roz.docx

228 pages

Find more like this

Report File (DMCA)

Our content is added by our users. We aim to remove reported files within 1 working day. Please use this link to notify us:

Report this file as copyright or inappropriate

543320

You might also be interested in

BETA
Microsoft Word - Techniki_separacyjne_roz.docx