Read Microsoft Word - TLC_2009.doc text version

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Celem wiczenia jest zapoznanie si z technik chromatografii cienkowarstwowej na podstawie rozdzialu barwników zawartych w liciach.

Wstp

(na podstawie: Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, 1995)

chromatografia

gazowa

cieczowa

kolumnowa

planarna

bibulowa

Rysunek 1: Ogólny podzial technik chromatograficznych

cienkowarstwowa

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC, z ang. Thin Layer Chromatgraphy) jest jedn z odmian chromatografii planarnej. Chromatografia planarna jest z kolei odmian chromatografii cieczowej ­ metody rozdzialu mieszaniny substancji rozpuszczonych w cieczy bdcej faz ruchom (eluentem) na odpowiednio dobranej fazie stacjonarnej (adsorbencie). W chromatografii planarnej faza stacjonarna jest uformowana w postaci plytki lub plasko rozprowadzona na noniku, najczciej szklanej lub plastikowej plytce.

Zasada analizy Analizowan próbk w postaci roztworu rónych zwizków skladowych umieszcza si blisko krawdzi plytki chromatograficznej, któr zanurza si w eluencie tak jak pokazano na Rysunku 2. Dzialanie sil kapilarnych powoduje unoszenie eluenta. Jest to tak zwany sposób wstpujcy analizy. Eluent przenosi próbk wzdlu adsorbenta (fazy stacjonarnej). W trakcie przechodzenia przez faz stacjonarn próbka rozdziela si na skladniki rónice si powinowactwem do adsorbenta. Skladniki, które silniej oddzialuj z faz stacjonarn s rozmieszczone w pobliu linii startu, a slabiej oddzialujce z adsorbentem ­ rozmieszczaj si w pobliu czola 1

fazy ruchomej. Dodatkowo rozdzial stymulowany jest przez obecno par eluenta w komorze analitycznej, w której osadzona jest plytka. W ten sposób otrzymuje si obraz rozdzielanych skladników wzgldem czasu dotarcia do przeciwleglej krawdzi plytki (czasu retencji) w postaci chromatogramu.

Rysunek 2: Zasada rozdzialu substancji w chromatografii planarnej

Analiz jakociow skladników prowadzi si na podstawie poloenia na chromatogramie odpowiednich plamek, a ilociow ­ na podstawie wielkoci plamek i intensywnoci ich zabarwienia. Wielkoci charakteryzujc przesuwanie si badanej substancji jest wspólczynnik retencji (Rf), który okrela stosunek drogi migracji danego skladnika (A) do calkowitej drogi przebytej przez faz ruchom (B):

Rf

A B

Techniki analizy Rozrónia si szereg technik chromatografii planarnej w zalenoci od typu fazy stalej i sposobu uformowania nonika. Na przyklad w chromatografii bibulowej rozdzial chromatograficzny wykonuje si na odpowiednio dobranej bibule, a w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) ­ na cienkiej warstwie sorbentu osadzonej na podlou w postaci plytki lub folii. Przy uyciu TLC mona bada substancje, których analiza jest równie moliwa przy uyciu chromatografii kolumnowej ­ techniki w której adsorbent stanowi wypelnienie kolumny chromatograficznej. W odrónieniu od chromatografii kolumnowej TLC posiada nastpujce zalety: próbki nie musz by idealnie oczyszczone, plytk chromatograficzn uywa si tylko raz, a zanieczyszczenia nie przeszkadzaj w analizie jakociowej i ilociowej,

2

próbki mona nanosi na plytk w duej objtoci, zatem mog one by rozcieczone, a rozpuszczalnik moe by usuwany podczas nanoszenia próbek poprzez odparowanie, na jednej plytce mona rozdzieli do kilkudziesiciu próbek jednoczenie, a zatem TLC jest technik bardzo szybk w przeliczeniu na jedn próbk, identyfikacja skladników próbki i ich analiza nie zaley od rodzaju fazy ruchomej, a zatem nie jest konieczne zwracanie uwagi na odpowiednio fazy ruchomej do zastosowanego detektora, moliwe jest obserwowanie przebiegu rozdzielania chromatograficznego, cena analiz nie jest tak wysoka, jak w przypadku wysokosprawnej chromatografii kolumnowej HPLC.

Chromatogram plamkowy TLC mona przeksztalci w chromatogram pikowy. Przeksztalcenia tego dokonuje si metod densytometryczn, poprzez pomiar stopnia zaczernienia plytki w wyniku dzialania wiatla, a uzyskany wykres okrela si mianem densytogramu. Niekiedy TLC stosuje si razem z chromatografi kolumnow. Chromatografia cienkowarstwowa wykorzystywana jest wówczas do wstpnego, szybkiego przegldu próbek, a kolumnowa ­ do wlaciwej analizy. Koszt badania jest wtedy znacznie niszy, a czas ­ krótszy. Ponadto obecno wykrywanych skladników jest wówczas potwierdzona dwukrotnie. Inn odmian planarnej chromatografii cieczowej jest chromatografia HPTLC (z ang. High Performance Thin Layer Chromatography, Wysokosprawna Chromatografia Cienkowarstwowa). W HPTLC stosuje si plytki o drobniejszym uziarnieniu i wszych porach, opory przeplywu s znacznie wiksze, a czas analizy dluszy ni w zwyklej TLC. Droga rozwijania chromatogramu jest krótsza, rozdzial substancji analizowanych ­ lepszy, a rozmycie plamek ­ male. Dziki temu moliwe jest wykrywanie nanogramowych iloci substancji.

Adsorbenty Jako adsorbent stosuje si najczciej el krzemionkowy ­ tlenek krzemu modyfikowany grupami wodorotlenowymi. Rozdzial odbywa si dziki obecnoci w elu grup hydroksylowych, z którymi analizowane substancje tworz wizania wodorowe. Drugim czynnikiem zapewniajcym rozdzial jest stopie rozwinicia powierzchni adsorbentu. Im wiksza jest powierzchnia wlaciwa fazy stacjonarnej, tym silniejsze jest oddzialywanie midzy faz stacjonarn, a substancj rozdzielan i tym lepiej rozdzielony jest chromatogram. W celu zwikszenia efektyw-

3

noci rozdzielania powierzchni elu krzemionkowego mona pokry zwizkami srebra, olejem parafinowym lub glikolem etylenowym. Innymi polarnymi fazami stacjonarnymi (stosowanymi w tzw. normalnym ukladzie faz TLC) mog by: niemodyfikowany tlenek krzemu, krzemian magnezu, poliamidy czy celuloza. Przykladem fazy stacjonarnej o charakterze lipofilowym (w tzw. odwróconym ukladzie faz) jest acetylowana celuloza. Jeeli skladniki analizowanego roztworu s bezbarwne, to mona je wywola spryskujc plytk z adsorbentem odpowiednio dobranym odczynnikiem chemicznym powodujcym powstanie zwizku barwnego. Adsorbent moe równie zawiera czynnik fluoryzujcy (np. siarczek kadmu lub krzemian cynku). Wówczas przy zastosowaniu do obserwacji chromatogramu lampy o dlugoci fali powodujcej fluorescencj tego czynnika, widoczne bd plamki substancji gaszcych fluorescencj czynnika fluoryzujcego, albo majcych inn dlugo fali wiatla emitowanego pod wplywem wzbudzenia. Adsorbent moe by osadzany na podlou przy pomocy rodka wicego (np. gipsu lub skrobi), który moe przeszkadza podczas rozwijania chromatogramu lub jego wizualizacji Eluenty W TLC stosuje si takie same eluenty jak w chromatografii kolumnowej. Bez wzgldu na charakter analizowanych zwizków (polarne lub niepolarne) faza stacjonarna moe by polarna lub niepolarna, jednak faza ruchoma powinna spelnia nastpujce warunki: do rozdzialu wykorzystuje si prost zaleno, e polarne przyciga polarne ­ zatem do analizy zwizków polarnych stosowane bd bardziej polarne eluenty ni do analizy zwizków niepolarnych, eluent do TLC powinien by tak dobrany, aby plamki skladników mieszaniny rozloone byly równomiernie. Sklad eluentu moe by staly lub zmieniany podczas rozwijania chromatogramu.

4

Problemy do rozwizania przed wykonaniem wiczenia kurkumina, smocza krew

Zadanie bdzie polegalo na rozdziale mieszaniny dwóch historycznych barwników ­ kurkuminy i smoczej krwi. Glównymi barwnymi skladnikami smoczej krwi s drakorodyna i drakorubina. W poniszej tabeli zestawiono wspólczynniki retencji dla rónych barwników: Barwnik kurkumina 1 frakcja smocza krew 2 frakcja 3 frakcja Wspólczynnik retencji 0.91 0.92 0.81 0.72

W jakiej kolejnoci na chromatogramie TLC powinny pojawia si powysze barwniki? 2) Co mona powiedzie o wzajemnej polarnoci wymienionych powyej barwników,

jeeli wiadomo, e faza stacjonarna TLC ma charakter polarny, a faza ruchoma ­ charakter slabo polarny? 3) Z czego mog wynika niewielkie rónice pomidzy wartociami wspólczynnika Rf

dla danego zwizku uzyskanymi w dwóch eksperymentach z zastosowaniem takich samych faz stacjonarnych i eluentów? 4) cie? Dlaczego ciany komory chromatograficznej wyklada si bibul zanurzon w eluen-

Materialy, sprzt i odczynniki

mieszanina barwników plytka do TLC pokryta SiO2 komora chromatograficzna kapilara cylinder zlewka

butelka na eluent aceton metanol olówek linijka bibula

pseta

Prac naley wykonywa pod dygestorium, w fartuchu, okularach i rkawiczkach ochronnych. 5

Wykonanie wiczenia

Rozdzial chromatograficzny Prosz przygotowa eluent bdcy mieszanin acetonu i metanolu w stosunku objtociowym 1:1 (sklad eluentu zostal wczeniej tak dobrany, aby rozdzial byl efektywny). ciany komory chromatograficznej wyloy bibul, do komory wla niewielk ilo eluentu ­ tak, aby powierzchnia cieczy nie sigala wyej ni 0,5 cm od dna komory. Na plytce chromatograficznej zaznaczy lini startu w odlegloci ok. 1 cm od krawdzi plytki. Roztwory dwóch barwników i ich mieszaniny nanie przy uyciu kapilary na plytk w miejscu linii startu ­ tak, aby powstaly 3 plamki (k, l, m) o rednicy do 2 mm oddalone od siebie o ok. 0.5 cm. Umieci plytk w komorze chromatograficznej i poczeka okolo 25, a rozwinie si chromatogram. W momencie gdy czolo eluenta znajdzie si w odlegloci ok. 0.5 cm od górnej krawdzi, plytk naley wyj pset i olówkiem zaznaczy czolo fazy ruchomej i delikatnie obrysowa plamki.

Rozwizanie problemów:

6

7

Analiza uzyskanych wyników

Na poniszym rysunku przedstawiajcym plytk chromatograficzn prosz zaznaczy uzyskane po rozdziale plamki poszczególnych barwników, gdy chromatogram nie jest trwaly. Nastpnie zmierzy na plytce chromatograficznej odlegloci A1, A2, A3 oraz A4 (odpowiadajce poszczególnym barwnikom) oraz B dla kadej z naniesionych plamek k, l, m i wpisa je do poniszej tabeli. Obliczy wartoci wspólczynników retencji, porówna z wartociami podanymi powyej i wycign wnioski.

plamka ,,k" B A1

plamka ,,l" B A1 A2 A3

plamka ,,m" B A1 A2 A3 A4

barwnik ----------------

8

Information

Microsoft Word - TLC_2009.doc

8 pages

Find more like this

Report File (DMCA)

Our content is added by our users. We aim to remove reported files within 1 working day. Please use this link to notify us:

Report this file as copyright or inappropriate

543143