Read Microsoft Word - Instrukcja chemia biologiczna.doc text version

Zastosowanie pomiarów fluorescencji w biochemii i chemii bionieorganicznej

Lukasz Orzel, Janusz Dbrowski

Zespól Fizykochemii Koordynacyjnej i Bionieorganicznej, Wydzial Chemii UJ

FLUORESCENCJA

Energia wzbudzenia czsteczki mo e zosta wykorzystana do pokonania bariery aktywacji w procesie fotochemicznym. Najczciej zdarza si jednak, e zostaje ona oddana, a czsteczka wraca do swojego stanu podstawowego. Jednym ze sposobów dezaktywacji wzbudzonych stanów elektronowych jest emisja fotonu. W przypadku, gdy jest ona nastpstwem absorpcji wiatla mamy do czynienia z fotoluminescencj. W zale noci od rodzaju stanu wzbudzonego, z którego nastpuje emisja, wyró nia si fluorescencj i fosforescencj. Fluorescencja jest szybkim procesem fotofizycznym, zachodzcym w czasie ~10-8 s. Poniewa bezpromienista dezaktywacja wy szych stanów oscylacyjnych wzbudzonego stanu elektronowego zachodzi jeszcze szybciej (ok. 10-12 s), fluorescencj obserwuje si jedynie z najni szego oscylacyjnego poziomu pierwszego elektronowego stanu wzbudzonego. W przeciwiestwie do znacznie wolniejszego procesu fosforescencji, fluorescencja nie pociga za sob zmiany multipletowoci. Podobnie jak w przypadku absorbancji, intensywno fluorescencji jest proporcjonalna do st enia substancji emitujcej (w zakresie niskich st e; dla wysokich st e charakterystyczne jest zjawisko autowygaszania). Zale no ta ma posta:

I F = k I0 c s

k ­ stala proporcjonalnoci I0 ­ nat enie promieniowania wzbudzajcego c ­ st enie s ­ grubo warstwy absorbujcej Poprzez porównanie widm absorpcyjnych i fluorescencyjnych danej substancji, mo emy wyznaczy energi pierwszego wzbudzonego stanu singletowego S1, gdy energia przej 0­0 jest jednakowa w przypadku absorpcji i emisji.

a b s o rp c ja

' = 4 ' = 2 ' = 0 ' = 3 ' = 1 ' = 4 ' = 2 ' = 0

gdzie:

e m is ja

' = 3 ' = 1

S1

S1

Schemat poziomów energetycznych i widm obrazujcych przesunicie maksimum emisji w kierunku fal dlu szych w stosunku do maksimum absorpcji.

= 4 = 2 = 0 0 ­ 3 = 3 = 1

= 4 = 2 = 0 0 ­ 3

= 3 = 1

S0

S0

0 ­ 2 0 ­ 4 0 ­ 1 0 ­ 5 0 ­ 0 0 ­ 1

0 ­ 2 0 ­ 4 0 ­ 5 0 ­ 6

W przypadku obecnoci w badanym ukladzie innych czstek zwanych wygaszaczami (np. I­, O2, akrylamid) mo liwy jest jeszcze jeden sposób powrotu ukladu do stanu podstawowego poprzez przekazanie energii czsteczce wygaszacza. Wplyw wszystkich tych procesów mo na opisa calociowo równaniem Sterna­ Volmera (zakladamy stan równowagi): D + h D(S1) D(S1) D + h D(S1) D D(S1) D(T1) D(S1) + Q D + Q* absorpcja fluorescencja konwersja wewntrzna przejcie interkombinacyjne wygaszanie fluorescencji Va = I a Vf = kf[S1] VIC = kIC[S1] VISC = kISC[S1] VQ = kQ[Q][S1]

1

gdzie:

kf, kIC, kISC, kQ ­ stale szybkoci Ia ­ nat enie padajcego promieniowania [Q] ­ st enie wygaszacza [S1] ­ st enie substancji w stanie singletowym D ­ substrat

Wykres Sterna­Volmera dla dynamicznego wygaszania fluorescencji. Wykres Sterna­Volmera z definicji musi mie punkt przecicia I0/I = 1 dla zerowego st enia wygaszacza. Je eli wykres taki jest nieliniowy, mechanizm wygaszania jest bardziej zlo ony i przy wy szych st eniach wygaszacza istotniejsze mo e si sta wygaszanie statyczne. Nieliniowy, mechanizm wygaszania jest bardziej zlo ony i przy wy szych st eniach wygaszacza istotniejsze mo e si sta wygaszanie statyczne.

I = 1 + K SV [Q ] Iw

gdzie:

K SV =

kq = k q 0 k f + k IC + k ISC

I ­ nat enie fluorescencji bez wygaszacza. Iw ­ nat enie fluorescencji w obecnoci wygaszacza. 0 ­ czas fluorescencji bez wygaszacza. Kq ­ stala wygaszania. W przypadku wystpowania wicej ni jednego fluoroforu nale y uwzgldni poszczególne udzialy. Wobec tego ogólne równanie Sterna­Volmera przyjmuje posta:

n fi Iw = 1 + K [Q] eV[Q] I i=1 SV

I0 ­ nat enie fluorescencji bez wygaszacza I ­ nat enie fluorescencji w obecnoci wygaszacza fi ­ ulamek calkowitej fluorescencji ukladu [Q] ­ st enie wygaszacza V ­ stala gaszenia statycznego KSVi ­ stala Sterna-Volmera charakteryzujca proces dynamicznego wygaszania Gdy KSVi znaczco ró ni si od siebie, wystpuj odchylenia ujemne od wykresów Sterna­Volmera. Zale no ta jest liniowa dla wygaszania dynamicznego (kolizyjnego). Jednak e mo e mie miejsce tak e wygaszanie statyczne (bardzo szybkie 10-15 s), polegajce na utworzeniu niefluoryzujcego kompleksu z wygaszaczem, lub na ,,natychmiastowym" odebraniu energii przez znajdujc si bardzo blisko (promie Van der Waalsa) czstk wygaszacza. Wystpowanie takiego wygaszania daje odchylenia od linii prostej (odchylenie dodatnie). Aby uzyska peln charakterystyk widm fluorescencyjnych zbiera si dwa rodzaje widm: emisyjne i ekscytacyjne. Pierwsze z nich - widmo emisyjne - jest zale noci intensywnoci emisji w funkcji dlugoci fali przy zadanej dlugoci fali wzbudzenia. Natomiast widmo wzbudzenia przedstawia zale no intensywnoci emisji od dlugoci fali przy zadanej dlugoci fali emisji. Jest wic widmem wzbudzenia ,,czystego" zwizku. W takim przypadku widmo wzbudzenia slu y weryfikacji czystoci próbki dla której wykonano widmo absorpcyjne (a zatem powinno mie taki sam ksztalt jak widmo absorpcyjne). gdzie:

FLUORESCENCJA ZWIZKÓW BIOLOGICZNIE CZYNNYCH.

Substancjami wykazujcymi zjawisko fluorescencji wród zwizków biologicznie czynnych s midzy innymi: · Aminokwasy aromatyczne: tryptofan, tyrozyna, fenyloamina · Zasady nukleinowe w DNA i RNA: adenina, guanina, cytozyna, tymina, uracyl · Barwniki rolinne: chrofile, bakteriochlorofile i karotenoidy · Witaminy i hormony: np. ryboflawina

2

Zwizki fluoryzujce mo na podzieli na nastpujce grupy: · Wewntrzne. Przykladem niech bdzie jeden z aminokwasów ­tryptofan, zawierajcy w swojej strukturze grup indolow. Wykazuje on fluorescencj przy dlugoci fali wzbudzenia 280 nm i dlugo fali emisji 340 nm). · Zewntrzne. W przypadku, gdy badany zwizek nie wykazuje fluorescencji, mo liwa jest jego modyfikacja chemiczna za pomoc fluoroforu zewntrznego. Jednym z przykladów jest izotiocyjanian fluoresceiny, który reaguje z wolnymi grupami aminowymi obecnymi w strukturach bialek. · Wskaniki fluorescencyjne. Grupa wskaników chemicznych stosowanych w analityce medycznej- w punkcie kocowym miareczkowania nastpuje zmiana fluorescencji próbki, lub biologii komórki- barwienie komórek apoptotycznych i nekrotycznych. Przykladami mog by stosowane do barwienia komórkowego oran akrydyny, jodek propidyny, blkit trypanu.

tryptofanu,

izotiocyjaninan fluoresceiny,

oran akrydyny

Wysoka czulo spektroskopii fluorescencyjnej pozwala na jej zastosowania kliniczne. Rutynowo wykonuje si oznaczanie aminokwasów, ryboflawiny, tiaminy czy kwasu foliowego we krwi i innych plynach fizjologicznych w szczególnoci, gdy jest dostpna niewielka ilo próbki. Przykladem zastosowania fluorymetrii w biotechnologii jest badanie aktywnoci enzymów. W takich pomiarach monitoruje si reakcj, w której nie fluoryzujcy lub slabo fluoryzujcy substrat przeksztalcany jest w fluoryzujcy produkt. W nowoczesnych laboratoriach szeroko stosuje si mikroskopy fluorescencyjne np. do wizualizacji obiektów biologicznych. Przykladem s barwniki u ywane do sprawdzania ywotnoci komórek pozwalajce na procentowe okrelenie iloci komórek ywych i martwych (barwienie jodkiem propidyny i oran em akrydyny). Metoda fluorescencji jest równie niezwykle przydatna w badaniach biodystrybucji i farmakokinetyki leków zawierajcych fluorofor bd polczonych z zewntrznym fluoroforem. Innym zastosowaniem medycznym mo e by obrazowanie nowotworów, chorób immunologicznych, neurologicznych czy cukrzycy.

WYKORZYSTANIE FLUORESCENCJI STRUKTURALNYCH BIALEK.

DO

OKRELANIA

ELEMENTÓW

Spektroskopia fluorescencyjna jest metod czsto stosowan w badaniach bialek. Z analizy widm fluorescencyjnych danej czsteczki bialkowej oraz z ich zale noci od ró nych czynników rodowiskowych (takich jak pH, temperatura, lepko) mo na wycign szereg ciekawych wniosków np. na temat struktury przestrzennej bialka czy oddzialywania z innymi czsteczkami. Bialka zawdziczaj swoje wlaciwoci fluorescencyjne obecnoci w lacuchu polipeptydowym aromatycznych aminokwasów ­ tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny. Ich fluorescencja przypada na zakres bliskiego ultrafioletu. Maksimum absorpcji dla fenyloaminy to 260 nm, a emisji- 282 nm. Dla tyrozyny nastpuje przesuniecie w stron ni szych energii, maksimum absorpcji przypada na dlugo fali 275 nm, a emisji 304 nm. Widma absorpcji tryptofanu przesunite s w jeszcze bardziej dlugofalow cz UV. Maksimum absorpcji dla tryptofanu to 295 nm, a emisji 353 nm. Wydajnoci kwantowe tryptofanu i tyrozyny s zbli one (odpowiednio 0,13 i 0,14) i kilkakrotnie wy sze ni fenyloalaniny (0,02). Emisja tryptofanu jest bardzo wra liwa na wplyw otoczenia (rozpuszczalnik, wygaszacze). Poniewa bialka zawieraj wiele reszt aminokwasów, podlegajcych ró nym czynnikom rodowiska, ich fluorescencja jest heterogenna, co przejawia si przede wszystkim zale noci parametrów emisji od dlugoci fali promieniowania wzbudzajcego. Decydujc rol dla fluorescencji bialek bd odgrywaly reszty tryptofanu, gdy fluorescencja pochodzca od tyrozyny jest w znacznym stopniu wygaszona, natomiast emisj pochodzc od fenyloalaniny obserwuje si w niewielu przypadkach. Do wygaszania fluorescencji w bialkach dochodzi w skutek wewnatrzczsteczkowego kompleksu nakladajcych si na siebie piercieni aromatycznych. Wygaszenie fluorescencji ma tu zarówno charakter statyczny jak i dynamiczny.

3

Istniej tak e nietypowe bialka, których fluorescencja jest widoczna nawet golym okiem. Przykladem jest bialko zielonej fluorescencji GFP (Green Fluorescent Protein). Jego fluorescencja w zielonej czci widma promieniowanie elektromagnetycznego pochodzi od specyficznego ugrupowania atomów nale cych do trzech kolejnych aminokwasów - seryny, tyrozyny i glicyny. Ugrupowanie to w czasie okolo dwóch godzin po syntezie bialka tworzy specyficzny chromofor - p-hydroksybenzylidenoimidazolinon. Natywna struktura bialka nazywana czasem charakteryzuje si du ym stopniem upakowania. Ugrupowanie chromoforu jest szczelnie chronione wewntrz bialka, tym samym w bezporednim otoczeniu chromoforu znajduje si wiele reszt aminokwasowych, które w pierwszorzdowej strukturze bialka s od siebie znacznie oddalone. Owa proksymalna obecno aminokwasów ma diametralny wplyw na procesy absorpcji i emisji kwantów wiatla. Widmo absorpcji posiada dwa charakterystyczne pasma. Maksimum pierwszego pasma o molowym wspólczynniku absorpcji ok. 30 000 przypada na dlugo fali 397 nm. Drugie pasmo posiada maksimum przy dlugoci fali 475nm o molowym wspólczynniku absorpcji równym ok. 7 000. Widmo emisji ma jedno maksimum dla dlugoci fali ok. 508 nm. Wydajno kwantowa fluorescencji GFP to 0,79.

Widmo wzbudzenia (linia cigla) i emisji (linia przerywana) GFP wyizolowanego z A. victoria

FLUORESCENCJA GRUP PROSTETYCZNYCH.

Fluorescencja bialek mo e pochodzi nie tylko ze wspomnianych lacuchów bocznych aminokwasów ale równie grup prostetycznych polczonych z lacuchem peptydowym. Typowe grupy prostetyczne, jakimi s porfiryny, wykazuj siln emisj wiatla w dlugofalowym zakresie wiatla widzialnego. Energia oraz wydajno kwantowa tej emisji jest silnie uzale niona od rodzaju jonu centralnego, w mniejszym stopniu od obecnoci dodatkowego liganda aksjalnego. Wikszo jonów metali otwartopowlokowych wygasza fluorescencj tetrapirolu.

Widmo absorpcji i fluorescencji porfiryny. Znaczny odstp energetyczny midzy glównymi pasmami absorpcji i emisji wynika z faktu, e pasmo Soreta jest efektem przejcia ze stanu podstawowego (S1) na drugi poziom wzbudzony (S2).

BADANIE WIZANIA JONU METALU WYKORZYSTANIEM POMIARÓW EMISJI.

PRZEZ

PORFIRYNY

Z

W naturalnych ukladach biologicznych inercja jonu metalu prowadzca do utworzenia metaloporfiryny nastpuje na etapie, w którym piercie tetrapirolowy jest ju w pelni uksztaltowany. Wizanie jonu centralnego jest znacznie utrudnione, glównie ze wzgldu na szczególn sztywnoci piercienia makrocyklicznego oddzialywujcego z biopolimerami. Tworzenie kompleksu wymaga wic uczestnictwa wyspecjalizowanych enzymów ­ chelataz. Przypuszcza si, e ich aktywno zwizana jest ze zdolnoci przejciowej deformacji makrocykla. Dla szeregu jonów metali obserwuje si samorzutne tworzenie kompleksów z ligandami tetrapirolowymi w roztworach. ledzenie tych reakcji jest latwe dziki mo liwoci wykorzystania prostych technik spektroskopii UV-vis. Obok wyranych zmian absorpcji wyra ajcych si m.in. w przesuniciu pasma Soreta i pasm Q obserwuje si wyrane zmiany wlaciwoci emisyjnych porfiryny. Wizanie metalu powoduje przesunicie pasma a w wielu przypadkach calkowite wygaszenie fluorescencji.

4

SENSORY OPTYCZNE.

Jednym ze sposobów wykorzystania fotoluminescencji w ukladach biologicznych jest stosowanie sensorów fluorescencyjnych. Sensory takie s coraz czciej wykorzystywane do analizy podstawowych skladników komórkowych. Szczególne miejsce znajduj one m.in. w obrazowaniu zmian st e jonów metali zaanga owanych w procesy indukcji sygnalów.

fluorofor receptor receptor fluorofor Mechanizm PET na przykladzie wzbudzenia emisji przy zwizaniu jonu metalu.

fluorofor

receptor

fluorofor receptor

Sensory to zwizki charakteryzujce si szczególn budow, w któr wyró ni mo na uklad receptorowy i sygnalowy. Dziki obecnoci receptora sensory obdarzone s zdolnoci tworzenia wiza koordynacyjnych z wybranym jonem lub czsteczk. Funkcj ukladu sygnalowego pelni fluorofor. W wyniku wizania analitu przez receptor dochodzi do zaklócenia stanów energetycznych sensora, co pociga za sob powstanie nowych szczególnych wlaciwoci czsteczki. Umo liwienie lub zablokowanie mo liwoci przeniesienia elektronu midzy receptorem a fluoroforem mo e powodowa wzrost lub spadek intensywnoci fluorescencji bd te przesunicie polo enia pasm emisyjnych. Zasada dzialania sensorów fluorescencyjnych opisywana jest mechanizmem PET (ang. Photoinduced Electron Transfer). O znaczeniu fluorymetrycznych metod analizy decyduje przede wszystkim prostota oraz wysoka czulo. W porównaniu ze absorpcj wiatla fluorescencja jest zjawiskiem znacznie bardziej specyficznym dla danego ukladu. Wynika to z wikszej powszechnoci procesów absorpcji fotonów nad procesami ich emisji. Ponadto, w przeciwiestwie do typowych pomiarów spektrofotometrycznych, pozwalajcych na oznaczanie umiarkowanie wysokich st e chromoforów, pomiary fluorescencji nie s szczególnie ograniczane intensywnoci luminescencji. U yteczno danego sensora w badaniach dotyczcych okrelonego rodowiska uzale niona jest od dopasowania powinowactwa receptora do lokalnych st e analitu. Zmiany widmowe obserwowane s w charakterystycznym dla danego sensora zakresie st e analitu, ograniczonym wielkoci stalej trwaloci (bd jej odwrotnoci ­ stal dysocjacji, Kd). Przyjlo si u ywa wielkoci stalej dysocjacji jako miary wielkoci powinowactwa sensora do wybranego analitu.

[ M ][ S ] [ MS ] [M ] = K d [MS ] [S ] Kd =

gdzie:

M + S MS

M ­ jon metalu S ­ sensor Je eli w wyniku koordynacji badanego jonu (M) zmienia si jedynie wydajno kwantowa fluorescencji sensora (S, wzrost lub spadek intensywnoci proporcjonalny do zmiany calkowitej intensywnoci fluorescencji tj. pola powierzchni pod krzyw), wówczas zmiana intensywnoci tej fluorescencji odczytana np. w maksimum bdzie proporcjonalna do zmiany st enia kompleksu (MS). Rozwa my przypadek, w którym tworzony kompleks charakteryzuje si wy sz wydajnoci kwantow fluorescencji ni wolny sensor. Intensywno fluorescencji (I) ronie wówczas od wielkoci odpowiadajcej wolnemu sensorowi (Imin) a do wysycajcego st enia M (Imax). I - I min = [ MS ] Ró nica miedzy zmierzon wartoci I a spodziewan intensywnoci fluorescencji przy wysycajcym st eniu M (Imax) bdzie wówczas proporcjonalna do st enia wolnego sensora:

I max - I = [ S ]

Zatem:

[M ] = K d

5

I - I min I max - I

W wyniku oddzialywania sensora z jonem metalu mo emy obserwowa równie zmiany widmowe innego rodzaju. Czsto zdarza si bowiem e energia wzbudzenia lub emisji powstajcego kompleksu jest inna ni wolnego sensora. Mo emy wówczas wykorzysta zmiany intensywnoci sygnalu wynikajce zarówno z zaniku pasma wolnego indykatora (I1) jak i tworzenia nowego pasma charakterystycznego dla kompleksu z oznaczanym jonem (I2). Mierzc intensywno fluorescencji przy charakterystycznych dlugociach fali (1 ­ dla zanikajcego pasma wolnego S, 2 ­ dla narastajcego pasma kompleksu MS) oznaczmy: IS1 ­ intensywno fluorescencji sensora w 1 IMS1 ­ intensywno fluorescencji kompleksu w 1 IS2 ­ intensywno fluorescencji sensora w 2 IMS2 ­ intensywno fluorescencji kompleksu w 2 Zachodz wówczas zale noci: I1 = I S1[ S ] + I MS1[ MS ] oraz I 2 = I S 2 [ S ] + I MS 2 [ MS ] a tak e:

I max1 = I S1[ S ]

R=

Poniewa :

oraz

I max 2 = I MS 2 [MS ]max

Stosunek intensywnoci fluorescencji przy wybranych dlugociach fali (R) jest równy:

I1 I S 1[ S ] + I MS 1[ MS ] = I 2 I S 2 [ S ] + I MS 2 [ MS ]

[ MS ] = [ M ][ S ] Kd

zatem:

[M ] Kd R= [M ] I S 2 + I MS 2 Kd I S 1 + I MS 1

RI SI 2 - I S 1 [M ] = Kd I MS1 - RI MS 2

I S1 IS2 IS2 [M ] = I I MS 1 Kd - R MS 2 I MS 2 R-

Wystpujce w powy szym równaniu wyra enia IS1/IS2 oraz IMS1/IMS2 s granicznymi wartociami R odnoszcymi si odpowiednio do wolnego sensora (Rmin) i maksymalnego st enia kompleksu MS (Rmax). Oznaczajc IS2/IMS2 = R' otrzymujemy ostatecznie:

[M ] = K d

R - Rmin ' R Rmax - R

6

Na wykresie logarytmu ze st enia wolnych jonów metalu od log((I ­ Imin)/(Imax - I)) lub log((R ­ Rmin)/(Rmax - R)) w pewnym zakresie zale no ta ma przebieg liniowy. Zakres ten odpowiada zakresowi czuloci sensora na oznaczany jon metalu. Wyraz wolny w równaniu prostej daje odpowiednio logarytm Kd oraz sum logarytmów Kd i R'.

OZNACZANIE ST ENIA JONÓW WAPNIA W KOMÓRKACH.

Wap jest pierwiastkiem chemicznym o niebagatelnej roli biologicznej. Pod wzgldem ilociowej zawartoci w komórkach zalicza si go do makroelementów. Tworzy liczne kompleksy z biopolimerami i mniejszymi endogennymi ligandami, nierozpuszczalne sole (glównie fosforany), wystpuje równie w postaci wolnych jonów Ca2+. Ta ostatnia frakcja, cho stosunkowo nieliczna, posiada szczególne znaczenie dla prawidlowego przebiegu istotnych procesów biochemicznych. Jony Ca2+, ze wzgldu na swoje wlaciwoci koordynacyjne pelni funkcj przekaników II rzdu w lacuchach przekazu sygnalów. Pomimo niskich st e wolnych jonów wapnia w cytoplazmie, to wlanie ten przedzial komórki jest bezporednim ich dostarczycielem i odbiorc. Fakt ten sprawil, e w ostatnich latach daje si zaobserwowa wzrost zainteresowania i nasilenie bada dotyczcych cytoplazmatycznej gospodarki wapniowej w komórkach eukariotycznych. Jednym z podstawowych przejawów funkcjonowania systemu odpowiedzialnego za t gospodark jest gwaltowna zmiana cytoplazmatycznego st enia wolnych jonów Ca2+. Zakresy tych st e ksztaltuj si nastpujco: · Calkowite cytoplazmatyczne st enie wapnia: 0,1 - 10 mM · St enie wolnych jonów Ca2+ w komórkach spoczynkowych: 50 - 200 nM · St enie wolnych jonów Ca2+ w stanie pobudzenia komórki: 0,1 - 1 µM · St enie wolnych jonów Ca2+ w stanie pobudzenia neuronów i komórek miniowych: lokalnie do 100 µM · Zewntrzkomórkowe st enie wolnych jonów Ca2+: ~1 mM Tak du e zmiany [Ca2+] zwizane z pobudzeniem komórki wi si z rol stymulatora licznych procesów biochemicznych. Rola ta wymaga mo liwoci szybkiego uwalniania Ca2+ na zewntrz komórki oraz jego ponownego gromadzenia w jej wntrzu. Oscylacje cytoplazmatycznego poziomu wapnia zachodz gwaltownie w cigu kilku do kilkunastu sekund po zadzialaniu bodca. Po tym okresie obserwuje si zazwyczaj równie szybki spadek cytoplazmatycznego [Ca2+] do poziomu rejestrowanego w stanie spoczynku. W stanach stresowych tempo spadku tego st enia jest znacznie ni sze. Oprócz struktur blonowych odpowiedzialnych za transport jonów wapnia, w procesie prowadzcym do powstawania oscylacji cytoplazmatycznego [Ca2+] udzial bior m.in. bialko wi ce GTP, fosfolipaza C oraz wewntrzkomórkowe wtórne przekaniki sygnalów, w tym IP3 i DG. Do najwa niejszych procesów zwizanych z aktywnoci Ca2+ zaliczy nale y proces widzenia, kaskad fosfoinozytolow i regulacj skurczu mini. Kation wapniowy pelni tu rol wewntrzkomórkowego ,,informatora" w szlakach przekazywania sygnalów. W procesach tych bialka regulatorowe i enzymatyczne oddzialuj z receptorami, natomiast kolejne ogniwa sprzgane s przez dzialanie maloczsteczkowych lub jonowych przekaników. Jon Ca2+, uwalniany bezporednio do wntrza komórki po zadzialaniu bodca, zalicza si do grupy przekaników wtórnych lub II rzdu. O u ytecznoci Ca2+ jako przekanika decyduj: · Zdolno tworzenia kompleksów z bialkami. Wysokie liczby koordynacji umo liwiaj przy tym równoczesne wizanie z wieloma ligandami, co prowadzi do sieciowania ró nych segmentów bialka i indukowania du ych zmian konformacyjnych. Wysokie powinowactwo do grup tlenodonorowych. Cecha ta odró nia jony wapnia od potencjalnie konkurencyjnych kationów Mg2+. Rozbudowany system przenoszenia Ca2+ przez blony. Sprawnie dzialajce pompy wapniowe i wymieniacze sodowo­wapniowe zapewniaj szybki i selektywny transport tego kationu na zewntrz i do wntrza komórki.

· ·

Wród bialek wi cych wap najbardziej rozpowszechniona w komórkach eukariotycznych jest kalmodulina. Aktywacja kalmoduliny jest wynikiem wizania trzech lub czterech jonów Ca2+, zachodzcego przy du ym wzrocie st enia Ca2+ w cytoplazmie. Powstaly w ten sposób kompleks aktywuje liczne enzymy, pompy jonowe i inne bialka docelowe. Do tych ostatnich nale y m.in. kinaza CaM II, odpowiedzialna za fosforylacj innych bialek oraz syntaza NO decydujca o uwalnianiu tlenku azotu w reakcji rozkladu argininy. Obok wapnia w ukladach biologicznych wystpuj równie inne metale drugiej grupy ukladu okresowego. Jony tych metali oddzialuj w komórkach z malo- lub wielkoczsteczkowymi ligandami. Trwalo kompleksów z okrelonym typem liganda zale y m.in. od ladunku i promienia jonu centralnego. Przy

7

zachowaniu tego samego ladunku (dla drugiej grupy ukladu okresowego ­ M2+) wikszy promie nie uwodnionego jonu zapewnia wy sz liczb koordynacyjn. Dla stosunkowo du ych jonów Ca2+ liczba ta mieci si w zakresie 6 - 12, przy czym najczciej spotyka si omiokoordynacyjne kompleksy wapniowe. Podobnie wysokie liczby koordynacyjne charakteryzuj kompleksy strontu i baru. Znacznie mniejszy promie jonu Mg2+ sprawia, e kompleksy magnezowe nie wykazuj liczby koordynacyjnej wy szej od 6. Z tej te przyczyny Ca2+ znacznie silniej oddzialuje z du ymi wielokleszczowymi ligandami ni Mg2+. O wlaciwociach ligandów decyduj w du ej mierze wlaciwoci atomów donorowych. W ukladach biologicznych najczciej spotyka si kompleksy wapnia z donorowym atomem tlenu. Dla porównywalnych st e Ca2+ i Mg2+ du e chelatowe tlenodonory zazwyczaj specyficznie wi si z wapniem. Konkurencja o to wizanie pojawia si dopiero przy znacznym nadmiarze Mg2+. Ze wzgldu na znikom zawarto jonów Sr2+ i Ba2+ w komórkach mo na pomin ich udzial w konkurencji o wizanie wspomnianych ligandów. Tlenodonorowe grupy funkcyjne ligandów mog by zarówno zjonizowane (anionowe grupy karboksylowe, fosforanowe, fenolowe) jak i elektrycznie obojtne (grupy eterowe, karbonylowe, hydroksylowe). Ze wzgldu na ujemny ladunek tych pierwszych, wi one silniej Ca2+ ni ligandy elektrycznie obojtne. U yteczno danego sensora Ca2+ w badaniach dotyczcych okrelonej tkanki i jej stanu fizjologicznego uzale niona jest od szeregu czynników. Do najwa niejszych zaliczy nale y selektywno jonow oraz wra liwo na pH i obecno endogennych skladników komórki. Jednym z pierwszych fluorescencyjnych sensorów wapnia byla pochodna fluoresceiny - kalceina. Maksimum absorpcji tego zwizku przypada na 495 nm natomiast maksimum fluorescencji na 515 nm. Kalceina ma wlaciwoci samowygaszajce powy ej st enia 100 mM. Ponadto intensywno fluorescencji kalceiny oraz jej selektywno w stosunku do jonów Ca2+ i Mg2+ zale bardzo wyranie od pH roztworu. Z tego powodu kalibracja powinna by prowadzona w warunkach cile odpowiadajcych badanemu rodowisku. Zmiany widmowe wywolane koordynacj jonu metalu obserwowane s w charakterystycznym dla danego sensora zakresie st e Ca2+. Zakres ten okrela stosowalno sensora w ukladach biologicznych (ró nych typach komórek, oraz przy odmiennych stanach fizjologicznych - relaksacji, pobudzenia, stanach patologicznych). Wikszo indykatorów pierwszej generacji umo liwialo prowadzenie bada w zakresie fizjologicznego cytoplazmatycznego st enia Ca2+ komórek w stanie spoczynkowym. Istniej jednak obszary, których pobudzenie pociga za sob gwaltowny wzrost [Ca2+] do poziomu wykraczajcego poza górn granic oznaczalnoci klasycznych sensorów wapniowych. Badanie tych szczególnych stanów komórki stalo si mo liwe po wprowadzeniu w roku 1998 nowej generacji fluorescencyjnych sensorów wapniowych, takich jak Fura-2.

Kalceina

Fura-2

W porównaniu z wczeniej u ywanymi, nowe sensory wykazuj ni sze powinowactwo do Ca2+ zachowujc wysok selektywno jonow. Wspólnym elementem strukturalnym tych zwizków jest ugrupowanie receptorowe oparte na bazie kwasu etylenoglikol-O-O`-bis(2-aminoetyl)-N,N,N`,N` tetraoctowego ­ chelatora jonów wapniowych, stosowanego powszechnie m.in. w procedurach kalibracyjnych sensorów fluorescencyjnych.

EGTA

8

PRZEBIEG WICZENIA

1. 2. 3. 4. 5. Pomiar widm emisji i wzbudzenia tryptofanu oraz albuminy wolowej. Wygaszanie fluorescencji bialka jonami jodkowymi. Pomiar widm emisji i wzbudzenia zwizków tetrapirolowych. Porównanie emisji chlorofilu i chlorofiliny. Badanie reakcji feofityny a z jonami Zn2+ i/lub Cu2+. Wyznaczenie obserwowanej stalej szybkoci z pomiaru fluorescencji w warunkach eksperymentalnych. Pomiar widm wzbudzenia Fura-2 w obecnoci ró nych st e jonów Ca2+. Wyznaczenie zakresu czuloci sensora na jony wapniowe oraz stalej dysocjacji kompleksu sensora z jonem metalu.

LITERATURA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. S. Paszyc Podstawy fotochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1992, P. Suppan Chemia i wiatlo, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997 J.R. Lakowicz Principles of fluorescence spectroscopy, Springer 2006 J. Twardowski Biospektroskopia, tom 3, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1990 A. Kawski Fotoluminescencja roztworów, Warszawa, PWN 1992. J. Kcki Podstawy spektroskopii molekularnej, Warszawa, PWN 1998 G. Stochel, M. Brindell, W. Macyk, Z. Stasicka, K. Szacilowski Bioinorganic photochemistry, Wiley, 2009.

9

Information

Microsoft Word - Instrukcja chemia biologiczna.doc

9 pages

Report File (DMCA)

Our content is added by our users. We aim to remove reported files within 1 working day. Please use this link to notify us:

Report this file as copyright or inappropriate

832027