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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA Psidium guajava ATRAVÉS DO TESTE DPPH

Tatiana Maria Barreto de FREITAS (1); Clidia Eduarda Moreira PINTO (2); Isnara Correia ALVES (3); Amanda Furtado LUNA (4); Emmanuel Wassermann Moraes e LUZ (5)

(1) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí , Av. Pedro Freitas , telefone, e-mail: [email protected] (2) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí, e-mail: [email protected] (3) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí, e-mail: [email protected] (4) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí, e-mail: [email protected] (5) Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí, e-mail: [email protected]

RESUMO (12 PTS NEGRITO, ESPAÇAMENTO 22 PTS ANTES E 6 PTS DEPOIS)

A goiaba (Psidium guajava L., 1753) é fruta do tipo baga, pertencente à família Myrtaceae que consiste em um pericarpo e uma polpa com numerosas pequenas sementes. Possui quantidade regular de ácidos, açúcares, e pectinas. Seus principais constituintes são taninos, flavonóides, óleos essenciais, álcoois sesquiterpenóides e ácidos triterpenóides. Tem grande valor nutritivo, principalmente pelo seu alto teor de vitaminas A, do complexo B, C, além dos sais minerais, cálcio, fósforo, ferro e potássio, sendo um importante antioxidante. Oxidantes são compostos produzidos pelo metabolismo normal do corpo e, se não controlados, podem provocar danos extensivos. E para conter a ação de substâncias oxidantes os antioxidantes são capazes de estabilizar ou desativar os radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células, presentes em concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou inibem a oxidação do substrato. Os radicais formados a partir de antioxidantes não são reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados por reação com outro radical, formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante. O presente trabalho descreve a avaliação da atividade antioxidante da polpa in natura da goiaba (P. guajava) pela metodologia do radical livre DPPH. Verificamos que a goiaba possui um alto potencial antioxidante diante do radical DPPH, ao observar sua reação nos tempos de 6, 10 e 20 min. Na concentração 100 µg/mL o extrato etanólico chegou a reduzir

93,48% do radical em 20 min, e nas mesmas condições o extrato aquoso reduziu 89%, indicando que a fração etanólica é mais eficiente que a aquosa.

Palavras-chave: Psidium guajava L., antioxidante, radical DPPH.

1.

INTRODUÇÃO

As frutas, reconhecidas fontes de vitaminas, minerais e fibras, são alimentos nutricionalmente importantes da dieta. O efeito protetor exercido por estes alimentos tem sido atribuído à presença de antioxidantes (MELO et al, 2008).

Como a goiaba é um importante antioxidante, torna-se importante verificar o efeito desta ação para os organismos vivos (CARVALHO et al, 2008; IHA et al, 2008; CAMPELO et al, 2008). Um dos testes disponíveis para se verificar a propriedade antioxidante de substâncias e extratos consiste em avaliar a capacidade deste em seqüestrar radicais livres. O ensaio espectrofotométrico utilizando o radical livre DPPH é um dos testes que permite fazer uma avaliação indireta da capacidade seqüestradora de radicais livres e assim associá-la com a capacidade antioxidante da substância em análise (BLOIS, 1958). Devido à propriedade das substâncias antioxidantes em capturar radicais livres, estas têm sido utilizadas no tratamento de patologias, assim como são capazes de prevenir o efeito do estresse oxidativo (ROESLER, et al, 2007). 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento, como câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais (AMES et al, 1995; CHRISTEN, 1997; LANG E LOZANO, 1998; ROESLER et al, 2007). A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena (por ex., superóxido dismutase), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Destas últimas destacam-se tocoferóis (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), polifenóis, selênio e carotenóides. Quando há limitação na disponibilidade de antioxidantes podem ocorrer lesões oxidativas de caráter cumulativo (HASLAM, 1996; VALKO et al, 2004; SOUSA et al, 2007). A oxidação é um processo metabólico que leva a produção de energia necessária para as atividades essenciais das células. Entretanto, o metabolismo do oxigênio nas células vivas também leva à produção de radicais (MCCORD, 1994; ADEGOKE, et al, 1998; ROESLER et al, 2007). Os antioxidantes são um grupo de substâncias que, quando presentes em concentrações ideais em relação aos substratos oxidáveis, inibem ou atrasam significativamente os processos oxidativos podendo ser divididos em enzimáticos, solúveis, nutricionais e seqüestradores de metais de transição (VAYA E AVIRAM, 2001). São também importantes porque com o combate aos processos oxidativos tem-se menores danos ao DNA e às macromoléculas (VAYA E AVIRAM, 2001; VICENTINO E MENEZES, 2007). O desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes resulta na indução de danos celulares pelos radicais livres e tem sido chamado de estresse oxidativo, podendo causar danos aos lipídios, proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e outras substâncias oxidáveis (SIES, 1993; LEITE, 2003). Este desequilíbrio, por sua vez, está associado a muitos fenômenos fisiológicos, patológicos e a processos adversos como inflamação, envelhecimento, carcinogênese entre outros (DEAN et al., 1997). Nesse sentido, os antioxidantes destacam-se por prevenir a formação e a ação das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio que se associam ao dano oxidativo (ANDRADE-WARTHA, 2007). Os antioxidantes quer sejam natural ou sintético, possuem elevada estabilidade oxidativa em função de sua estrutura molecular, e por isso desempenham papel fundamental na prevenção à oxidação de substâncias. Sendo assim, os antioxidantes podem ser definidos como qualquer substância que, presente em baixas

concentrações, quando comparado a um substrato oxidável, retarda ou inibe a oxidação desse substrato (AUST et al., 2001; HANDELMAN, 2001). Em frente de ações fisiológicas e deletérias dos processos oxidativos, destacando-se a peroxidação lipídica ou lipoperoxidação, a existência de compostos que inibam a oxidação em concentrações específicas poderá auxiliar controlando os processos oxidativos em alimentos e organismos (BROINIZI et al, 2008). A goiaba (Psidium guajava L., 1753) é fruta do tipo baga, pertencente à família Myrtaceae que consiste em um pericarpo e uma polpa com numerosas pequenas sementes (ESCRIG et al., 2001). Existem dois tipos mais comuns, a vermelha e a branca. Possui quantidade regular de ácidos, açúcares, e pectinas. Seus principais constituintes são taninos, flavonóides, óleos essenciais, álcoois sesquiterpenóides e ácidos triterpenóides (IHA et al, 2008). Tem grande valor nutritivo, principalmente pelo seu alto teor de vitaminas A, do complexo B, C, além dos sais minerais, cálcio, fósforo, ferro e potássio (CONWAY, 2002). O consumo de frutas in natura vem aumentando na dieta dos consumidores que buscam maior valor nutritivo, efeitos terapêuticos e diferentes fitoquímicos, que possuem atividade antioxidante e podem estar relacionados com o retardo do envelhecimento e a prevenção de doenças, como câncer e problemas cardíacos (SEVERO et al, 2007). O efeito protetor exercido por este alimento tem sido atribuído à presença de compostos antioxidantes, dentre os quais se destacam os compostos fenólicos, produtos secundários do metabolismo vegetal (MATINEZVALVERDE et al, 2000; MELO et al, 2008). Estes compostos integram um amplo e complexo grupo de fitoquímicos que apresentam em sua estrutura um anel aromático com uma ou mais hidroxilas (RICEEVANS, 1996; WANG et al, 1996). Em virtude de sua natureza química, atuam como agentes redutores, interrompendo a cadeia da reação de oxidação através da doação de elétrons ou de hidrogênio aos radicais livres, convertendo-os em produtos termodinamicamente estáveis, ou complexando com metais, componentes iniciadores da oxidação lipídica (SAUTÉ-GARCIA et al, 1997; HOPIA E HEINOMEN, 1999; VILLANO et al, 2007). Evidências epidemiológicas crescentes do papel de alimentos antioxidantes na prevenção de certas doenças têm conduzido ao desenvolvimento de grande número de métodos para determinar a capacidade antioxidante (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURACALIXTO, 2006). Estes métodos podem ser baseados na captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder de redução do metal (FRAP; CUPRAC), captura do radical hidroxila (método de desoxirribose), captura do radical orgânico (ABTS, DPPH), quantificação de produtos formados durante a peroxidação de lipídios (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do -caroteno) (FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003), etc. O DPPH é um radical livre que pode ser obtido diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico, sendo este um dos testes mais usados, consiste em avaliar a atividade seqüestradora do radical livre 2,2difenil-1-picril-hidrazila - DPPH·, de coloração púrpura que absorve a 517 nm. Por ação de um antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar (R·), o DPPH· é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com conseqüente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante ou seqüestradora de radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH· remanescente no meio reacional (BRANDWILLIAMS, 1995; SOUSA et al, 2007).

3. 3.1

METODOLOGIA Preparação do extrato

As goiabas foram coletadas e levadas ao Laboratório de Microbiologia do Campus Teresina Sul do IFPI, onde foram higienizadas e retiradas a parte comestível da fruta e desintegradas em multiprocessador, foram peneiradas e os resíduos descartados. A polpa foi utilizada para preparação dos extratos alcoólico e aquoso. Para cada extrato foi pesado 50 g de polpa, e para o extrato aquoso foi adicionado 100mL de água destilada, e 100 mL de álcool foi adicionado para o extrato alcoólico. Agitou-se por 1h e centrifugado por 10 min, sendo coletado o sobrenadante e determinado a gravimetria. Após a gravimetria foram preparadas as

concentrações a serem testadas, determinadas em: 25 µg/mL, 50 µg/mL e 100 µg/mL para o extrato aquoso e; 25 µg/mL, 50 µg/mL e 100 µg/mL para o extrato etanólico.

3.2. Teste DPPH

O método está baseado na capacidade do DPPH em reagir com doadores de hidrogênio. Na presença de substâncias antioxidantes o mesmo recebe H+ sendo então reduzido. O radical DPPH é estável, de coloração púrpura, porém quando reduzido passa a ter coloração amarela.

N N NO2 NO2 AH NO2

N NH NO2 A

NO2

NO2

Figura 2: Reação genérica entre o radical livre DPPH e um antioxidante Para a avaliação da atividade antioxidante dos extratos, adicionou-se a 1,5 mL de solução etanólica de DPPH· (6x10­5M) uma alíquota de 0,5 mL das soluções contendo diferentes concentrações de cada extrato da goiaba. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 517 nm, após 6, 10 e 20 minutos do início da reação. Todas as determinações foram realizadas em triplicata e acompanhadas de um controle (utilizando etanol, sem substrato). Foi também calculado o valor EC50 (concentração da amostra necessária para inibir 50% do radical).

4.

RESULTADOS

As análises da goiaba foram feitas com os extratos, aquoso e etanólico, onde foram obtidos os resultados da pesquisa. O valor de EC50 foi calculado segundo a fórmula dada no gráfico para definir a concentração necessária para inibir em 50% o radical DPPH. O EC50 foram 26,10 mg/mL para o extrato etanólico e de 53,10 mg/mL para o extrato aquoso, como representado abaixo (Gráficos 1 e 2).

Gráfico 1: EC50 do etanólico

Gráfico 2: EC50 do aquoso

O comportamento dos extratos etanólico e aquoso foram semelhantes. É possível notar que o potencial antioxidante destes extratos foi alto, uma vez que, com uma dose de 100 mg/mL já foi reduzido em aproximadamente 90% o radical DPPH, sem haver uma diferença significativa entre o período de 6 e 20 minutos, como verificado logo abaixo (Gráficos 3 e 4 ).

Grafico 3: Redução do DPPH ­ Ex. etanólico

Grafico 4: Redução do DPPH ­ Ex. aquoso

5.

ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DE DADOS

O balanço entre o stress oxidativo e as funções antioxidantes dos organismos vivos parece ter um papel na carcinogênese (WEISBURGER, 1999; WETTASINGHE, 2002; ROESLER et al., 2007). Em estudos com plantas medicinais e alimentícias é importante avaliar seus constituintes e também suas atividades biológicas. O consumo de frutos com a presença de substâncias antioxidantes pode fortalecer o sistema imunológico e reduzir o risco de uma série de doenças (ZUQUE, 2004). A goiaba é uma fruta rica em ácido ascórbico, minerais, fibras, carotenóides, taninos e ácidos fenólicos. Sendo essas moléculas bioativas essenciais para a atividade antioxidante da mesma. Isto pode estar relacionado com a grande quantidade de ácido ascórbico, minerais, fibras, carotenóides, taninos e ácidos fenólicos, presentes na goiaba e que são responsáveis em grande parte por terem uma ação antioxidante efetiva, como observado em altas concentrações. Nas concentrações de 200 µg/mL e 400

µg/mL em ambos os extratos o consumo do radical DPPH foi total em poucos minutos e neste caso não foi possível a leitura no espectrofotômetro, ilustrando sua alta capacidade antioxidante.

A interpretação dos resultados do método DPPH são frequentemente expressos como EC50 (concentração eficiente) na qual é definido como a concentração de substrato que provoca a perda de 50% da atividade DPPH (cor) no período de tempo especificado. Esse parâmetro foi aparentemente introduzido por BrandWilliams e seus colegas (BRAND - WILLIAMS et al., 1995; BONDET et al., 1997) e indica que quanto maior a atividade antioxidante, mais baixo é o valor de EC50. Os extratos da goiaba que foram utilizados, mostraram que com uma concentração de 26,10 µg/mL, é possível inibir 50% do radical DPPH, enquanto que para inibir com o extrato aquoso é necessário uma concentração maior e equivalente à 53,10 µg/mL, mostrando com isso que o extrato alcoólico é mais eficiente quanto ao potencial antioxidante que o extrato aquoso. Mostrando então, ser eficaz em reduzir metade do radical DPPH, durante esta avaliação.

6.

CONCLUSÃO

Podemos observar que a goiaba possui um potencial antioxidante bastante apreciável, por todas as substâncias benéficas presentes em sua polpa, já que seu EC50 foi baixo (26,10 µg/mL, para o Ex. etanólico, e 53,10 µg/mL para o Ex. aquoso) evidenciando sua atividade eficiente em baixas concentrações.

Sendo importantes, outras avaliações através de outros testes, para um possível isolamento das substâncias antioxidantes. E como forma de incentivar o consumo dessas substâncias na dieta diária

pode produzir uma ação protetora efetiva contra esses processos oxidativos que ocorrem no organismo.

7.

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