x

Read Microsoft Word - specskripta_Obradjena2.doc text version

Bakterijske bolesti

Shema

Skripta, Zagreb 2004.

2

Bakterijske bolesti

The best way to predict the future is to

INVENT IT

Sadrzaj priredila prof. dr. sc. Branka Seol, Tehnicki uredio: [email protected]

Original ovog djela u PDF formatu je dostupan na:

www.vef.hr/org/mbio/

Sve slike su vlasnistvo autora. Klikom na slike otvara se kontakt stanica autora slike odnosno slika u originalnom okruzenju. Ovi materijali su pripremljeni s najboljim namjerama. Ukoliko bilo koji autor smatra da ne nesto netocno ili da su zakinuta njegova autorska prava, molimo ga da se javi na [email protected] Uciniti emo sve da, sukladno sa sugestijama, nadopunimo rad u najbrzem moguem roku.

3

Bakterijske bolesti

Sadrzaj

PORODICA BACILLACEAE...................................................................................................... 6 BAKTERIJE IZ RODA BACILLUS ......................................................................................... 6 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA................................................................................ 6 Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Bacillus anthracis ............... 8 1. Overview......................................................................................................................... 8 2. Human infection ............................................................................................................. 8 2.a. Cutaneous anthrax ...................................................................................................... 9 2.b. Gastrointestinal anthrax ............................................................................................ 10 2.c. Inhalation anthrax ...................................................................................................... 10 3. Antibiotic therapy.......................................................................................................... 11 4. Anthrax vaccine............................................................................................................ 11 II. Laboratory Procedures for the identification of Bacillus anthracis................................... 11 1. General......................................................................................................................... 11 1.a. Handling of samples.................................................................................................. 11 1.b. Decontamination ....................................................................................................... 12 2. Collection of clinical specimens ................................................................................... 12 2.a. Materials .................................................................................................................... 12 2.b. Cutaneous anthrax .................................................................................................... 12 2.c. Gastrointestinal anthrax............................................................................................. 13 2.d. Inhalation anthrax...................................................................................................... 13 3. Materials needed for processing of clinical specimens................................................ 13 4. Isolation from clinical specimens.................................................................................. 13 4.a. Sputum specimens.................................................................................................... 13 4.b. Blood specimens ....................................................................................................... 13 4.c. Swab specimens ....................................................................................................... 13 4.d. Stool specimens ........................................................................................................ 13 4.e. CSF specimens ......................................................................................................... 14 5. Incubation and examination of cultures........................................................................ 14 6. Differential tests for the presumptive identification of B. anthracis .............................. 14 6.a. Colony characteristics of B. anthracis ....................................................................... 14 6.b. Gram stain morphology of B. anthracis..................................................................... 14 6.c. India ink staining of clinical samples (blood and CSF) for capsule ........................... 14 6.d. Motility test: Wet mount or motility medium............................................................... 15 6.d.3. Controls .................................................................................................................. 15 6.d.4. Procedures ............................................................................................................. 16 7. Presumptive identification key for B. anthracis ............................................................ 16 8. Actions if a presumptive B. anthracis colony is identified and suspected as a bioterrorist threat agent .................................................................................................... 16 BAKTERIJE IZ RODA CLOSTRIDIUM ................................................................................... 18 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA.............................................................................. 19 Arcanobacterium (actinomyces) pyogenes;..................................................................... 20 Rhodococcus equi............................................................................................................ 20 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ................................................................................. 21 BAKTERIJSKA VRSTA ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE ..................................... 23 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA.............................................................................. 23 Identifikacija...................................................................................................................... 23 Sirenje F. tularensis.......................................................................................................... 24 Patogeneza ...................................................................................................................... 24 Laboratorijska dijagnostika............................................................................................... 25 Izdvajanje ......................................................................................................................... 25 Imunoloski testovi za dokaz antigena: ............................................................................. 25 BAKTERIJE IZ RODA BRUCELLA ......................................................................................... 26 Patogeneza-predavanje ................................................................................................... 27 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ................................................................................. 28 Izdvajanje ......................................................................................................................... 28 Identifikacija...................................................................................................................... 28 Biotipizacija....................................................................................................................... 28

4

Bakterijske bolesti

Brucella Abortus Disease (Brucellosis) in Beef Cattle1....................................................... 29 Background ...................................................................................................................... 29 Brucellosis Infection ......................................................................................................... 29 In Cattle ............................................................................................................................ 29 In Humans ........................................................................................................................ 30 Control and Eradication.................................................................................................... 30 Surveillance Testing ......................................................................................................... 30 Quarantine........................................................................................................................ 31 Release from Quarantine ................................................................................................. 31 Herd Depopulation ........................................................................................................... 31 Herd Management............................................................................................................ 31 Vaccination of Female Cattle against Brucellosis ............................................................ 33 RB-51 ............................................................................................................................... 33 Who Should Vaccinate? ................................................................................................... 34 Routine Herd Testing ....................................................................................................... 34 Brucellosis in the U.S. ...................................................................................................... 34 Footnotes.......................................................................................................................... 35 Brucella............................................................................................................................. 35 Distinctive properties of genus Brucella: .......................................................................... 36 PATHOGENESIS: ............................................................................................................ 36 HOST DEFENSES: .......................................................................................................... 36 EPIDEMIOLOGY: ............................................................................................................. 36 Brucellacapt® ................................................................................................................... 37 CONTROL: ....................................................................................................................... 38 Brucella melitensis in Texas, October 1999 Impact Worksheet ...................................... 38 How extensive is the situation? ........................................................................................ 38 Background Information on B. melitensis......................................................................... 38 What is the livestock production in the affected area?..................................................... 39 What are U.S. exports of cattle, swine, sheep and goat products and how might the finding of B. melitensis affect exports?............................................................................. 40 What does the meat packing industry look like in Texas? ............................................... 40 Conclusions ...................................................................................................................... 40 BAKTERIJSKE VRSTE IZ RODA PASTEURELLA................................................................. 42 PATOGENEZA ................................................................................................................. 42 SEROTIPIZACIJA PASTERELA ...................................................................................... 43 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA.............................................................................. 43 UZORCI............................................................................................................................ 43 IZDVAJANJE .................................................................................................................... 43 IDENTIFIKACIJA .............................................................................................................. 43 http://www.lbah.com/Rabbits/pasteurella.htm Bakterije roda Haemophilus........................ 44 Bakterije roda Haemophilus................................................................................................. 45 Promjene u nomenklaturi-nazivlju .................................................................................... 45 Prirodna obitavalista......................................................................................................... 45 PATOGENEZA ................................................................................................................. 46 Laboratorijska dijagnostika............................................................................................... 46 Uzorci ............................................................................................................................... 46 Izdvajanje (obje vrste) ...................................................................................................... 46 Identifikacija...................................................................................................................... 47 Mikroskopski razmasci ..................................................................................................... 47 BIOKEMIJSKE OSOBINE ................................................................................................ 47 SEOLOSKI POSTUPCI - ELISA, IHA, PRECIPITACIJA U GELU................................... 47 Red Chlamydiales................................................................................................................ 48 RED CHLAMYDIALES ..................................................................................................... 48 Patogenost ....................................................................................................................... 50 Laboratorijska dijagnostika............................................................................................... 51 Uzorci ............................................................................................................................... 51 DOKAZIVANJE vrste CHLAMYDOPHILA PSITTACI ...................................................... 51 b) ELISA-nije osobito prikladna-unakrizne reakcije ......................................................... 51 Izdvajanje i uzgoj.............................................................................................................. 51 Serologija.......................................................................................................................... 51

5

Bakterijske bolesti

Identifikacija...................................................................................................................... 52 Porodica i vrste unutar reda Chlamydiales ...................................................................... 52 Porodica i vrste unutar reda Chlamydiales ...................................................................... 53 Patogeneza ...................................................................................................................... 54 BAKTERIJSKA VRSTA LISTERIA .......................................................................................... 55 Laboratorijska dijagnostika .................................................................................................. 55 BAKTERIJE RODA LISTERIA................................................................................................. 57 ROD LISTERIA .................................................................................................................... 57 POSTUPCI TIPIZACIJE SOJEVA ....................................................................................... 58 Serovarovi roda Listeria prema Seeliger i Jones (1986).................................................. 58 ODREDNICE VIRULENCIJE BAKTERIJE LISTERIA monocytogenes........................... 59 LISTERIOZA U ZIVOTINJA ............................................................................................. 60 ODNOS LISTERIJE PREMA ANTIMIKROBNIM PRIPRAVCIMA, LIJECENJE I IMUNOPROFILAKSA....................................................................................................... 62 Pseudomonas aeruginosa....................................................................................................... 63 Patogeneza ...................................................................................................................... 63 laboratorijska dijagnostika ................................................................................................ 64 Pigmenti vrste P. aeruginosa ........................................................................................... 65 Uzgoj i biokemijske osobine............................................................................................. 70 Antigenske osobine i imunost .......................................................................................... 70 Patogenost i patogeneza.................................................................................................. 70 Prosirenost ....................................................................................................................... 71 2.1. Rod Ehrlichia ............................................................................................................. 75 2.1.1. Ehrlichia canis ........................................................................................................ 76 2.1.2. Ehrlichia equi.......................................................................................................... 77 2.1.3. Ehrlichia ewingii...................................................................................................... 78 2.1.4. «Ehrlichia ondiri».................................................................................................... 78 2.1.5. Ehrlichia phagocytophila ........................................................................................ 78 2.1.6. Ehrlichia platys ....................................................................................................... 79 2.1.7. Ehrlichia risticii........................................................................................................ 79 2.1.8. «Ehrlichia bovis» i «Ehrlichia ovina»...................................................................... 80 2.1.9. Ehrlichia sennetsu .................................................................................................. 80 2.2. Rod Aegyptianella ..................................................................................................... 80 2.3. Rod Anaplasma......................................................................................................... 80 2.4. Rod Cowdria.............................................................................................................. 82 2.4.1. Cowdria ruminantium ............................................................................................. 82 2.5. Rod Neorickettsia ...................................................................................................... 83 BAKTERIJSKA VRSTA STAPHYLOCOCCUS ....................................................................... 84 Laboratorijska dijagnostika............................................................................................... 84 Staphylococcus ....................................................................................................................... 85 Bakterijska vrsta Streptococcus........................................................................................... 86 Openito o razlikovanju streptokoka ................................................................................ 86 Laboratorijska dijagnostika............................................................................................... 86 Ineks ........................................................................................................................................ 87

6

Bakterijske bolesti

PORODICA BACILLACEAE

BAKTERIJE IZ RODA BACILLUS

· · · · velike, Gram-pozitivne ili Gram-varijabilne, sporogene stapiaste bakterije aerobne ili fakultativno anaerobne, katalaza-pozitivne, oksidaza-negativne, pokretne osim Bacillus anthracis i Bacillus mycoides veinom saprofitske bakterije prisutne u zraku, vodi i tlu spore B. anthracis mogu u tlu prezivjeti (i zadrzati infektivnost) i do 50 godina Domain(i) svi sisavci - ptice izuzetno otporne covjek pcele laboratorijski misevi Bolest antraks-bedrenica-prostrel-crni prist zoonoza !! trovanje hranom americka trulez legla Tyzzer-ova bolest

Vrsta B. anthracis B. cereus B. larvae B. piliformis (sada Clostridium piliforme)

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Izravni mikroskopski preparat krvnih razmazaka (uzima se krv iz usne ili repne vene) obojenih po Fothu (polikromno metilensko modrilo) - izrazena kapsula ruzicaste boje - u ostalih bakterija vrste Bacillus kapsula nije izrazena Izdvajanje: obicna hranjiva podloga, krvni agar, selektivna hranjiva podloga Identifikacija: B. anthracis je gotovo redovito ne-hemolitican-rijetki sojevi slaba hemoliza Izgled kolonija: nakon 48 sati inkubacije kolonije promjera 5 mm, plosnate, suhe, sivkaste, pod malim poveanjem "kovrcave" kolonije poput glave Meduze - GLEDATI POD MIKROSKOPOM Mikroskopski preparat: B. anthracis obicno se pojavljuje u dugim nizovima, a u starijim kulturama uocavaju se ovalne, neobojene endospore PRAKTICNI RAD: BOJENJE PO GRAMU

7

Bakterijske bolesti

Bojenje po Gramu

Bojenje po Fothu

Biokemijski testovi Bioloski pokus: iskljucivo u slucaju kada postoji sumnja da je rijec o bakteriji B. anthracis vrlo invazivan i patogen, blaga suspenzija kulture B. anthracis nanesena na skarificiranu kozu misa uzrokuje uginue Seroloska dijagnostika: TERMOPREIPITACIJA PO ASCOLI-JU (vidi-ponovi iz Praktikuma)

8

Bakterijske bolesti

Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Bacillus anthracis

CDC - Centers for Disease Control and Prevention This protocol is designed to provide laboratories with techniques to identify microorganisms, in order to support clinicians in their diagnosis of potential diseases.

1. Overview

Anthrax is a zoonotic disease that is transmissible to humans through handling or consumption of contaminated animal products. The etiologic agent of anthrax, Bacillus anthracis, is a spore forming gram-positive bacillus. Although anthrax can be found globally in temperate zones, it is more often a risk in countries with less standardized and less effective public health programs. Areas currently listed as high risk are South and Central America, Southern and Eastern Europe, Asia, Africa, the Caribbean, and the Middle East. In these regions, herbivorous wildlife mammals, such as deer, wildebeest, elephants, and domesticated livestock, such as goats, sheep, cattle, horses, and swine, are at highest risk for disease. These animals usually become infected while grazing on contaminated land, eating contaminated feed or drinking from contaminated water holes. B. anthracis spores can remain viable in soil for many years. Anthrax infrequently occurs in livestock in North America; however, anthrax outbreaks have been reported among deer from Louisiana and Texas up through the Midwest and among wood buffalo in the Northwest Territory in Canada. Animal infections in the United States are reported most often in Texas, Louisiana, Mississippi, Oklahoma, and South Dakota. Birds, amphibians, reptiles, and fish are not directly susceptible to anthrax infection. However, some carnivorous mammals, such as dogs, lions, and omnivorous mammals such as swine, may be susceptible to anthrax infection through consumption of meat from infected animals.

2. Human infection

Humans can become infected with B. anthracis by handling products or consuming undercooked meat from infected animals. Infection may also result from inhalation of B. anthracis spores from contaminated animal products such as wool or the intentional release of spores during a bioterrorist attack. Human-to-human transmission has not been reported. Three forms of anthrax occur in humans: cutaneous, gastro-intestinal, and inhalational.

9

Bakterijske bolesti

2.a. Cutaneous anthrax

Cutaneous infections occur when the bacterium or spore enters a cut or abrasion on the skin, such as when handling contaminated wool, hides, leather or hair products (especially goat hair) from infected animals. Skin infection begins as a raised itchy bump or papule that resembles an insect bite. Within 1-2 days, the bump develops into a fluid-filled vesicle, which ruptures to form a painless ulcer (called an eschar), usually 1-3 cm in diameter, with a characteristic black necrotic (dying) area in the center. Pronounced edema is often associated with the lesions because of the release of edema toxin by B. anthracis. Lymph glands in the adjacent area may also swell. Approximately 20% of untreated cases of cutaneous anthrax result in death either because of the infection becomes systemic or because of respiratory distress caused by edema in the cervical and upper thoracic regions. Deaths are rare following appropriate antibiotic therapy, with lesions becoming sterile within 24 h and resolving within several weeks.

e

10

Bakterijske bolesti

2.b. Gastrointestinal anthrax

The gastrointestinal form of anthrax may follow the consumption of contaminated meat from infected animals and is characterized by an acute inflammation of the intestinal tract. Initial signs of nausea, loss of appetite, vomiting, and fever are followed by abdominal pain, vomiting of blood, and severe diarrhea. The mortality rate is difficult to determine for gastrointestinal anthrax but is estimated to be 25%-60%.

2.c. Inhalation anthrax

This form of anthrax results from inhaling B. anthracis spores, and is most likely following an intentional aerosol release of B. anthracis. After an incubation period of 1-6 days (depending on the number of inhaled spores), disease onset is gradual and nonspecific. Fever, malaise, and fatigue may be present initially, sometimes in association with a nonproductive cough and mild chest discomfort. These initial symptoms are often followed by a short period of improvement (ranging from several hours to days), followed by the abrupt development of severe respiratory distress with dyspnea (labored breathing), diaphoresis (perspiration), stridor (highpitched whistling respiration), and cyanosis (bluish skin color). Shock and death usually occur within 24-36 h after the onset of respiratory distress, and in later stages, mortality approaches 100% despite aggressive treatment.

Physical findings are usually nonspecific. The chest X-ray is often pathognomonic (diseasespecific) revealing a widened mediastinum with pleural effusions, but typically without infiltrates. B. anthracis can be detected by Gram stain of the blood and by blood culture with routine media, but often not until late in the course of the illness. Only vegetative encapsulated bacilli are present during infection. Spores are not found within the blood, partially because CO2 levels in the body inhibit sporulation. Studies of inhalation anthrax in non-human primates (i.e., rhesus monkeys) showed that bacilli and toxins appear in the blood within 2- 3 days of exposure. The appearance of toxins coincides with the appearance of bacilli in the blood, and tests are available to rapidly detect the toxins.

11

Bakterijske bolesti

3. Antibiotic therapy

Most B. anthracis strains are sensitive to a broad range of antibiotics. Penicillin, ciprofloxacin, or doxycycline are usually recommended for the treatment of anthrax. To be effective, treatment should be initiated early. If left untreated, the disease is highly fatal.

4. Anthrax vaccine

An anthrax vaccine for humans is licensed for use in the United States. The vaccine is a cellfree filtrate that contains protective antigen and alum. The vaccine is reported to be 93% effective in protecting against cutaneous anthrax. Animal studies have suggested that the vaccine may also be protective against aerosol challenge. The anthrax vaccine is distributed by BioPort Corporation, Lansing, Mich. B. anthracis is considered a potential biological warfare threat agent. The U.S. Department of Defense recommends anthrax vaccination of all U.S. active duty military personnel. According to the Advisory Committee for Immunization Practices (ACIP) civilians who should receive anthrax vaccine include persons who come in contact in the workplace with imported animal hides, furs, bonemeal, wool, animal hair (especially goat hair), and bristles and persons engaged in diagnostic or investigational activities which may put them in contact with anthrax spores. The vaccine should be administered only to healthy men and women aged 18-65 years since all studies to date have been conducted exclusively in that population. Pregnant women should not be vaccinated, because it is not known whether the anthrax vaccine can cause fetal harm. The anthrax vaccination protocol consists of 3 subcutaneous injections given 2 weeks apart followed by 3 additional subcutaneous injections given at 6, 12, and 18 months. Annual booster injections of the vaccine are required to maintain immunity. Mild local reactions consisting of slight tenderness and redness at the injection site of the skin occur in approximately 30% of recipients. A moderate local reaction can occur if the vaccine is given to anyone with a past history of anthrax. Severe local reactions occur infrequently and consist of extensive swelling of the forearm in addition to the local reaction. Systemic reactions characterized by flu-like symptoms occur in fewer than 0.2% of vaccinees.

II. Laboratory Procedures for the identification of Bacillus anthracis

1. General

The procedures described below function to rule out presumptively identified B. anthracis in clinical specimens or isolates. These procedures should be performed in microbiology laboratories that utilize Biological Safety Level 2 (BSL 2) practices. Laboratory coats and gloves shall be worn when processing specimens and performing tests. Safety glasses or eye shields are recommended. Any activities that bring hands in contact with mucosal surfaces (for example, eating, drinking, smoking, or applying make-up) are prohibited. Hands should be washed before leaving the laboratory. Anthrax vaccination is not required. Disclaimer. Names of vendors or manufacturers are provided as examples of suitable product sources and inclusion does not imply endorsement by the Centers for Disease Control and Prevention, the United States Public Health Service, Department of Health and Human Services, the United States Army, or the Federal Bureau of Investigation.

1.a. Handling of samples

For safety considerations, analysis of samples for biological threat agents is performed within a certified Class II biological safety cabinet (BSC). Procedures requiring removal of items from a BSC, such as slides for microscopy, should follow published microbiological practices and precautions. When using a BSC, assure that the cabinet does not contain unnecessary items that will interfere with proper airflow and function. As for any procedure involving

12

Bakterijske bolesti

infectious materials, standard personal protective gear should be used, such as latex gloves and laboratory coats, or disposable over garments. Additional respiratory protection should also be considered with materials or analytical procedures determined to be potentially hazardous outside the BSC. Once a biological agent has been identified, modifications in handling of samples can then be considered

1.b. Decontamination

Commercially available household bleach solutions contain 5.25% hypochlorite and, when diluted 1:10, are effective in routine decontamination of surfaces and instruments after working with B. anthracis.

Contaminated items such as pipettes, needles, loops, and microscope slides should be immersed in decontamination solution until autoclaving. Worksurfaces, such as a biological safety cabinet (BSC), should be wiped down before and after use with decontamination solution. The method of decontamination of a spill depends upon the nature of the spill. Spills involving fresh cultures or samples known to have low concentrations of spores should be flooded with decontamination solution and soaked for 5 min before cleanup. Spills that involve samples with high concentrations of spores, involve organic matter, or occur in areas of lower than room temperature (refrigerators, freezers) should be exposed to decontamination solution for at least 1 h before cleanup. Personnel involved in the cleanup of any spill should wear gloves, safety glasses, and a laboratory coat or gown during the cleanup process. Respiratory protection should be considered for spills in which a substantial aerosolization is suspected.

Lazna dojava o antraksu u SAD-u

2. Collection of clinical specimens

2.a. Materials

· · · · · Sporocidal disinfectant Sputum cup Sterile cotton swabs Blood culture collection kit Stool collection cup

2.b. Cutaneous anthrax

· · 2.b.1. Vesicular stage: The organism is best demonstrated in this stage. Soak two dry sterile swabs in vesicular fluid from a previously unopened vesicle. 2.b.2. Eschar stage: Rotate two swabs beneath the edge of the eschar without removing theeschar.

13

Bakterijske bolesti

2.c. Gastrointestinal anthrax

· · 2.c.1. If the patient is able to produce a stool specimen, stool cultures should be performed. Obtain a stool culture. 2.c.2. In later stages of disease, blood cultures will yield the organism, especially if specimens are obtained prior to antibiotic treatment.

2.d. Inhalation anthrax

· · 2.d.1. If respiratory symptoms are present and sputum is being produced, obtain a specimen for culture and smear. 2.d.2. In later stages of disease (2-8 days post exposure) blood cultures may yield theorganism, especially if specimens are drawn before antibiotic treatment.

3. Materials needed for processing of clinical specimens

· · · · · · · · · 5% Sheep blood agar plates [SBA] (BD Bioscience or Remel, Inc. or equivalent) MacConkey agar plates (BD Bioscience or Remel, Inc. or equivalent) Phenyl ethyl alcohol agar (PEA) plates (for stool specimens)(BD Bioscience or Remel, Inc. or equivalent) Trypticase soy broth (BD Bioscience or Remel, Inc. or equivalent) Clean glass microscope slides Sterile cotton swabs (commercially available specimen transport swabs for aerobic culture are preferred) Disposable bacteriologic inoculation loops Clinical centrifuge with appropriate biocontainment tube holders Sporicidal disinfectant (0.5% sodium hypochlorite or 0.5% calcium hypochlorite)

4. Isolation from clinical specimens

4.a. Sputum specimens

Inoculate 3 routine media for sputum specimens (i.e. SBA, MacConkey agar, broth enrichment).

4.b. Blood specimens

· · 4.b.1. Routine blood culture methods are sufficient. 4.b.2. There may be enough organisms in the blood to see them on direct smears by Gram stain. B. anthracis appears as short chains of 2-4 cells which are encapsulated as evidenced by clear zones around the bacilli. The presence of large encapsulated gram-positive rods in the blood is strongly presumptive for B. anthracis identification. 4.b.3. If blood culture bottle is positive, perform a Gram stain directly and observe for encapsulated rods. These blood cultures should also be subcultured to SBA and MacConkey agar plates.

·

4.c. Swab specimens

· · 4.c.1. Use one swab to inoculate 3 standard media for surface wounds (e.g., SBA, MacConkey agar, or broth enrichment). 4.c.2. Prepare a smear for Gram staining with the second swab.

4.d. Stool specimens

· · 4.d.1. Routine stool culture methods are sufficient (e.g., SBA, MacConkey agar, or PEA plates). 4.d.2. Do not use CVA or hectone agar plates.

14

Bakterijske bolesti

4.e. CSF specimens

· · · 4.e.1. If a clinical centrifuge with appropriate biocontainment tube holders is available, centrifuge the CSF specimen at 1500 X g for 15 minutes. 4.e.2. Collect the sediment and prepare a smear for Gram staining. 4.e.3. Inoculate the remainder of the sediment onto SBA and broth enrichment media (tryptic soy broth or thioglycollate).

5. Incubation and examination of cultures

· · 5.a. Cultures should be incubated at 35-37o C under ambient conditions. 5.b. Cultures should be examined within 18-24 h of incubation. Growth of B. anthracis may be observed as early as 8 h after inoculation.

6. Differential tests for the presumptive identification of B. anthracis

6.a. Colony characteristics of B. anthracis

6.a.1. After incubation of SBA plates for 15-24 h at 35-37o C, well isolated colonies of B. anthracis are 2-5 mm in diameter. The flat or slightly convex colonies are irregularly round, with edges that are slightly undulate (irregular, wavy border), and have a ground-glass appearance. There are often comma-shaped projections from the colony edge, producing the "Medusa head" colony. 6.a.2. Colonies on SBA usually have a tenacious consistency. When teased with a loop, the growth will stand up like beaten egg white. In contrast to colonies of B. cereus and B. thuringiensis, colonies of B. anthracis are not -hemolytic. However, weak hemolysis may be observed under areas of confluent growth in aging cultures and should not be confused with -hemolysis. 6.a.3. When examining primary growth media, it is important to compare the extent of growth on SBA plates with that on MacConkey agar plates. B. anthracis grows well on SBA, but does not grow on MacConkey agar. B. anthracis grows rapidly; heavily inoculated areas may show growth within 6-8 h and individual colonies may be detected within 12-15 h. This trait can be used to isolate B. anthracis from mixed cultures containing slower-growingorganisms. Figure 1. B. anthracis and B. cereus colony morphology. Overnight cultures of B. Cereus (left side of plate) and B. anthracis (right side) on SBA.

6.b. Gram stain morphology of B. anthracis

6.b.1. Procedure: Perform Gram stain by usual procedures. 6.b.2. Interpretation of results: B. anthracis is a large gram-positive rod (1-1.5 X 3-5 m) that forms oval, central-tosubterminal spores (1 X 1.5 m) on SBA that do not cause significant swelling of the cell. Spores are not present in clinical samples unless exposed to atmospheric levels of CO2; CO2 levels within the body inhibit sporulation. Vegetative cells seen on Gram stain of blood and impression smears are in short chains of 2-4 cells that are encapsulated. However, cells from growth on SBA under ambient conditions, are not encapsulated and occur as long chains of bacilli. When grown on nutrient agar in the presence of 5% CO2 or on other basal media supplemented with 0.8% sodium bicarbonate, virulent strains will yield heavily encapsulated bacilli. The capsule can be visualized microscopically using India Ink. Figure 2. Gram stain of B. anthracis from SBA - Magnification 1,000X.

6.c. India ink staining of clinical samples (blood and CSF) for capsule

6.c.1. Purpose: India ink is useful for improving visualization of encapsulated B. anthracis in clinical samples such as blood, blood culture bottles, or cerebrospinal fluid (CSF). 6.c.2. Materials: · Microscope slides

15

Bakterijske bolesti

· Cover glasses · India ink (Bactidrop, Remel, Inc., Catalog # 21-518 or equivalent). · Microscope with 100X oil immersion objective 6.c.3. Controls a) Control strains · Positive control: Klebsiella pneumoniae on SBA or equivalent · Negative control: E. coli ATCC 25922 or equivalent b) Method controls: Perform the test with suspensions of fresh cultures of the control strains. Control strains should be assayed on each day of testing. c) Resolving an out-of-control result: check the purity and identity of the control strains and repeat the test. 6.c.4. Procedure a) For the controls, transfer a small amount of growth (1 mm diameter) from each control SBA plate into 0.5 ml whole EDTA-treated blood or serum. Mix. b) For the unknowns, take 100 c) Transfer 5-10 then add 5-10 l of sample (blood, CSF) l of unknown or control to a slide, place a cover glass on the drop, and l of India ink to the edge of the cover glass.

d) After the ink diffuses across, view the cells using 100X oil immersion objective with oil on top of the cover glass. Figure 3. India ink staining of B. anthracis 4/18/01 13 6.c.5. Interpretation of results The capsule will appear as a well-defined clear zone around the cells for the positive control. No zone should be present in the negative control.

6.d. Motility test: Wet mount or motility medium

6.d.1. Purpose This test determines the motility of suspect isolates. B. anthracis is a nonmotile species. This characteristic is unusual among Bacillus species and is therefore useful in the preliminary identification of B. anthracis isolates. Two methods are given: the wet mount 6.d.2. Materials a) For wet mount procedure · Precleaned microscope slides · Cover glasses · Sterile distilled water · Disposable bacteriologic inoculating loop · Light microscope with 40X objective and 10X eyepiece · Sterile glass tube b) For tubed motility test · · Tubed motility media (Remel, Inc., Catalog # 06-1408 or equivalent), 5 ml per tube Sterile disposable 1 l inoculating loop or needle

6.d.3. Controls

a) Control strains · · Positive control: Pseudomonas aeuroginosa ATCC 35032 or equivalent Negative control: Acinetobacter spp. ATCC 49139 or equivalent

16

Bakterijske bolesti

b) Method controls: Perform the test with fresh cultures of the control strains using the same method as with unknowns. Control strains should be assayed on each day of testing. c) Resolving an out-of-control result: Check the purity and identity of the control strains and repeat the test.

6.d.4. Procedures

Wet mount and motility a) Wet mount procedure Deliver 2 drops (approximately 0.1 ml) of sterile distilled water into the sterile glass tube. · Using the inoculating loop, sample a suspicious colony from a 12-20 h culture and suspend the growth in the water. (Alternatively, a loopful of medium from a fresh broth culture can be used). · Transfer 1 drop of the suspension to the microscope slide and overlay with the cover glass. · Examine the slide under the microscope using the 40X objective (total magnification = 400X). · Discard slides in 0.5% hypochlorite solution. b) Motility test medium procedure Using the sterile inoculating needle, remove some growth from an isolated, suspicious · colony of an 18-24 h culture. · Inoculate the motility tube by carefully stabbing the needle 3-4 cm into the medium · and then drawing the needle directly back out so that a single line of inoculum can be observed. · Incubate the tube aerobically at 35-37o C for 18-24 h. c) Interpretation of results · · For wet mount: Motile organisms can be observed moving randomly throughout the suspension. Nonmotile organisms either fail to move or move with Brownian motion. For motility test medium: Nonmotile organisms, such as B. anthracis, will form a single line of growth that does not deviate from the original inoculum stab. Motile organisms will form a diffuse growth zone around the inoculum stab. · ·

7. Presumptive identification key for B. anthracis

· · · · · · · · 7.a. From clinical samples, such as blood, CSF, or lesion material: encapsulated grampositive rods. 7.b. Gram-positive, broad rod, spore-positive: Bacillus species. 7.c. Spores are nonswelling and oval shaped; ground glass appearance of colonies: Bacillus morphology group 1 (includes B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, and B. cereus var. mycoides) 7.d. Nonmotile: B. anthracis and B. cereus var. mycoides 7.e. Nonhemolytic: presumptive B. anthracis

8. Actions if a presumptive B. anthracis colony is identified and suspected as a bioterrorist threat agent

· · · 8.a. Preserve original specimens pursuant to a potential criminal investigation. 8.b. Contact local FBI, state public health laboratory, and state public health department. 8.c. Local FBI agents will forward isolates to a State health department laboratory as is necessary. Consultation with a state health department laboratory is strongly encouraged as soon as B. anthracis is suspected as a bioterrorist threat agent.

17

Bakterijske bolesti

El carbunco (en ingles antrax), es una infección relativamente infrecuente producida por el bacillus antracis, tiene varias formas de presentación. La forma cutánea es la más frecuente (en España se declaran 200-300 casos anuales de la infección) y por lo general es curable. Se caracteriza por el desarrollo de una ulcera cubierta de una escara necrótica, indolora, acompañada de intenso edema. Si bien se recomienda tratamiento antibiótico las lesiones son autolimitadas. Solo un pequeño porcentaje de casos evoluciona hacia la forma sistémica. La forma sistémica de antrax generalmente se adquiere por inhalación de las esporas del bacilo y tiene un curso fatal con una mortalidad cercana al 100%

18

Bakterijske bolesti

BAKTERIJE IZ RODA CLOSTRIDIUM

· · · velike, Gram-pozitivne ANAEROBNE, sporogene stapiaste bakterije neke vaznije bakterijske vrste iz roda Clostridium: neurotoksicno djelovanje: o o C. tetani - spore smjestene terminalno (izgled kuhace) C. botulinum - spore smjestene centralno, terminalno ili subterminalno

Krvni agar - Clostridium perfringens

·

histotoksicno djelovanje: o C. chauvoei ovalne spore smjestene centralno ili subterminalno, puno sire od stanice-podsjeaju na limun C. septicum ovalne spore smjestene ekscentricno ili subterminalno C. novyi ovalne ili cilindricne spore smjestene subterminalno C. haemolyticum C. perfringens tip A, B, C, D, E kratki, zdepasti Gram-pozitivni stapii, spore smjestene centralno ili ekscentricno rijetko ih tvori PRAKTICNI RAD: BOJENJE PO GRAMU razmazaka bujonske kulture C. perfringens klostridije su siroko rasprostranjene i nalaze se u tlu, svjezoj vodi i sedimentu morske vode iako su neke vrste i tipovi prisutni samo na odreenim (geografski) ogranicenim podrucjima

Krvni agar - Clostridium sporogenes

o

o o ·

enterotoksemije: o

o

19

Bakterijske bolesti

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Izravni mikroskopski preparat razmazaka obojenih po Gramu sluzi za uocavanje-odreivanje morfologije IF (izravna imunofluorescencija) u rutinskoj dijagnostici C. chauvoei, C. septicum, C. novyi Izdvajanje - krvni agar, selektivna hranjiva podloga u anaerobnim uvjetima Identifikacija · · · · izgled kolonija Mikroskopski preparat Biokemijski testovi Izdvajanje i dokazivanje toksina

20

Bakterijske bolesti

·

BAKTERIJSKA VRSTA CORYNEBACTERIUM;

Arcanobacterium (actinomyces) pyogenes;

Severe suppurative meningitis in a four week-old lamb that was recently tail docked. This is an ascending infection of Arcanobacterium pyogenes.

Rhodococcus equi

mali, pleomorfni, Gram-pozitivni stapii pojavljuju se kao stapii, koki, u obliku palice i niti · ne tvore spore, katalaza-pozitivne, oksidaza-negativne, fakultativni anaerobi, sojevi patogeni za zivotinje nisu pokretni · u razmascima sacinjenim iz tkiva, uocavaju se kao skupina stanica poredanih paralelno, tzv. "palisade" ili su stanice poredane jedna prema drugoj pod ostrim kutem tzv. "kineska slova" · mnoge korinebakterije sadrze metakromatska zrnca-Babes-Ernestova granula koja su u stvari skladista fosfata-energija!! (osobito vidljiva kod C. diphteriae) · Arcanobacterium (Corynebacterium) pyogenes i Rhodococcus equi po svojim kemijskim osobinama ne pripadaju korinebakterijama ali tvore oblike nalik one u vrsta pripadnica korinebakterija te ih stoga zajedno i obraujemo U veterinarskoj medicini 4 su vrste znacajne. · · · · Arcanobacterium (Corynebacterium) pyogenes - uzrocnih gnojenja (apscesi) u prezivaca i svinja C. pseudotuberculosis - uzrokuje tvorbu kazeoznih (poput sira) apscesa u prezivaca i konja Rhodococcus equi - uzrocnik gnojne upale plua u zdrebadi C. renale - naseljava sluznice mokrano-spolnog sustava ·

21

Bakterijske bolesti

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Izravni mikroskopski preparat - Grampozitivni stapii s razlicitim stupnjem pleomorfizma; stanice vrste Rhodococcus equi najcese su kokobacilarnnog oblika Izdvajanje - krvni agar (ovcja ili govea krv) Identifikacija · · · izgled kolonija mikroskopski preparat Corynebacterium spp.: pleomorfni Gram-pozitivni stapii ili kokobacili CAMP test (sa vrstom S. aureus) za presumptivnu dijagnostiku C. pseudotuberculosis, C. renale i R. equi Biokemijski testovi

·

22

Bakterijske bolesti

Najvazniji domaini, bolesti i prirodna stanista patogenih korinebakterija i vrste Rhodococcus equi Vrsta Corynebacterium bovis C. kutscheri C. pseudotuberculosis C. renale Domain(i) govedo mis, stakor, zamorce ovce, koze konj (govedo) govedo svinje ovnovi govedo govedo zdrebad (u dobi od 24 mj.) starija zdrebad svinja, govedo Bolest

C. cystitidis C. pilosum C. equi - sadasnji naziv: Rhodococcus equi

kazeozni limfadenitis ulcerozni limfangitis pijelonefritis, cistitis (uzrocnik prisutan u prepuciju i spermi bikovabez vidlljivih klinickih znakova bolesti) apscesi u bubrezima balanopostitis pijelonefritis pijelonefritis gnojna bronhopneumonija apscesi cervikalni limfadenitis akutni ili kronicni gnojni mastitis, gnojna upala plua, septicni artritis, endometritis, umbilikalne inf., infekcije rana, "ljetni mastitis" (goveda)

C. pyogenes- sadasnji naziv: Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes

govedo, ovca, svinja

Septicni artritis

23

Bakterijske bolesti

BAKTERIJSKA VRSTA ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE

(prije E. insidiosa) · · · bakterija E. rhusiopathiae jedina je vrsta rodu S (smooth)-oblik kolonija E. rhusiopathiae uzrokuju akutni oblik bolesti - Grampozitivni stapii 0.2-0.4 x 0.8-2.5 µm R (rough)-oblik kolonija E. rhusiopathiae uzrokuju kronicni oblik bolesti - Grampozitivni filamenti i do 20 µm katalaza i oksidaza-negativna, ne tvori spore, nepokretna, fakultativni anaerob

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Izravni mikroskopski preparat - morfologija bakterije E. rhusiopathiae ovisi o obliku bolesti : · · akutni oblik bolesti: Gram-pozitivni stapii kronicni oblik bolesti: Gram-pozitivni filamenti koji teze odbojavanju (dekolorizacija)

Izdvajanje - krvni agar (ovcja ili govea krv) ili selektivna podloga Identifikacija

· izgled kolonija - nakon 24 sata inkub. ne-hemoliticne tockaste kolonije; varijacije u morfologiji kolonija nastupaju nakon 48 sati inkub. kada se ispod poraslih kolonija ocituje zona zelenkaste hemolize; S (smooth)-oblik kolonija su 0.5 - 1.5 mm u promjeru, okrugle, konveksne; R (rough)-oblik kolonija su plosnatije vise mljecne i nepravilnih rubova mikroskopski preparat - PRAKTICNI RAD: BOJENJE VLASTITIH PRIPREMLJENIH RAZMAZAKA PO GRAMU Biokemijski testovi Serotipizacija

· · ·

24

Bakterijske bolesti

Francisella tularensis (F. tularensis) · · · · · sastoji se od dva biotipa: jako virulentnog biotipa A koji se oznacava kao tularensis i blazeg tipa B poznat kao palaeartica oba biotipa su: mali (kratki), pleomorfni, nepokretni, gram-negativni stapii ili kokobacili; pojedinacne stanice manje su od 1 µm F. tularensis je izrazito aerobna bakterija, najbolje raste na agaru s dodatkom krvi i cistina Prirodna stanista-obitavalista-nosioci F. tularensis pojavljuje se na sjevernoj polutki (sjeverna Amerika) kao biotip A (F. tularensis), i biotip B (F. palaeartica) u Euroaziji rezervoari bakterije su divlje zivotinje: prvenstveno kuni i zec ali i dabar, bizamski stakor, sljuka, vjeverica, oposum, tvor, jelen i lisica F. tularensis prenose najcese veliki artropodi sisui krv: muhe, komarci i krpelji

·

·

Bojenje po Gramu ·

Kutana infekcija

Sirenje F. tularensis

Domain(i) Ovce i ostale farmske zivotinje Macke Sirenje Ugrizom artropoda ukljucujui i Dermacentor andersoni (sumski krpelj) ·Zarazeni kunii i glodavci ·Ugrizom zarazenih macaka ·Ulazak kroz kozu nakon diranja zarazenih divljih ziv., osobito zeceva i kunia -najcesi nacin Covjek ·konzumiranje zarazenog mesa i vode ·ugrizom artropoda ·ugrizom zarazenog psa ili macke

Patogeneza

· · bakterijemija, lokalizacija uz tvorbu granulomatoznih tvorbi u parenhimskim organima i limfnim cvorovima karakteristicne vidljive promjene u kunia i zeceva su sitna granulomatozna zarista u slezeni, jetri i limfnim cvorovima

25

Bakterijske bolesti

Laboratorijska dijagnostika

· · · · F. tularensis JAKO ZARAZNA ZA COVJEKA; dijagnostika se obavlja u posebno opremljenim laboratorijima i primjerenom zastitom osoblja pretrazuju se uzorci jetre, slezene i l.c., a od zivih zivotinja uzima se krv za seroloske pretrage Izravna mikroskopija u razmascima iz materijala obojenih gramovim bojenjem bakterije se slabo vide; u nekim se ref lab. koristi izravna imunofluorescencija (IF)

Izdvajanje

· · · · · · materijal se nacjepljuje na krvni agar sa ili bez cistina, inkubira pri 370 C do 7 dana Identifikacija Morfoloske osobine: F. tularensis raste sporo i kolonije dosezu najveu moguu velicinu tek nakon 2-4 dana inkubacije Mikroskopski izgled: gramovim bojenjem poraslih kolonija uocavaju se mali gramnegativni stapii i kokobacili Biokemijske osobine: F. tularensis je oksidaza-negativna i slabo katalaza-pozitivna, ostale biokemijske osobine tesko je odrediti i nisu nuzne u identifikaciji -razlika izmeu biotipova odreuje se u referalnim lab.

Imunoloski testovi za dokaz antigena:

(1) IIF razmazaka porasle bakterijske kulture (2) aglutinacija na predmetnici specificnim antiserumom Seroloski postupci: · titar antitijela (u ser. postupku aglutinacije) 1:40 - 1:60 upuuje na infekciju pasa i macaka; ovaj titar se postize oko 2 tjedna nakon infekcije u slucaju da je uzorak tkiva jako kontaminiran drugim bakterijama (franciselu ne mozemo uspjesno uzgojiti na cvrstoj hranjivoj podlozi) bioloski se pokus provodi inokulacijom tkivnog homogenata zamorcetu

Bioloski pokus: ·

26

Bakterijske bolesti

BAKTERIJE IZ RODA BRUCELLA

· · · kratki, gram-negativni stapii (0.5-0.7 x 0.6-1.5 µm), cesto u obliku kokobacila, nepokretni, ne tvore spore Prirodna obitavalista bakterije pripadnice roda Brucella obligatne su parazitske bakterije i svaka vrsta ima "svoju" zivotinjsku vrstu koja je ujedno i rezervoar infekcije brucele imaju afinitet za placentu, fetalnu tekuinu i testise bikova, ovnova, nerastova i pasa Brucella abortus (B. abortus) izlucuje se mlijekom goveda, moze prezivjeti u mlijeku, vodi i vlaznoj zemlji do 4 mjeseca Orhitis

· ·

27

Bakterijske bolesti

Patogeneza-predavanje

Bolesti i uobicajeni domaini bakt. vrste Brucella Vrsta B. abortus Domain(i) GOVEDO ovca, koza i svinja konj covjek KOZA ovca govedo covjek SVINJA covjek OVCA PAS covjek stakor (Neotoma lepida) Bolesti pobacaj i orhitis sporadicni pobacaji burzitis undulirajua groznica pobacaj povremeno pobacaj i izlucivanje mlijekom Malteska groznica pobacaj, orhitis, artritis, spondilitis, neplodnost stada undulirajua groznica epididimitis u ovnova, sporadicni pobacaj u ovaca pobacaj, epididimitis samo sumskih stakora u ogranicenom podrucju Salt Lake Desert-Utah (SAD)

B. melitensis

B. suis B. ovis B. canis B. neotomae

Velika slova-prirodan domain

28

Bakterijske bolesti

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Materijal koji se salje (uzima) za mikrobiolosku, serolosku i patohistolosku pretragu: · · · · · kod pobacaja ako je mogue, potrebno je uzeti cijeli fetus ili sadzaj zeluca fetusa, bilo koji promijenjeni dio fetusa, kotiledone, iscjedak iz maternice, mokrau (zbog leptospiroze koju treba diferencijalno-dijagnosticki iskljuciti ili potvrditi), kolostrum; parni serumi; kotiledoni i bilo koji promijenjeni dijelovi fetusa u 10%-tnom formalinu; sjeme i tkivo epididimisa ili testisa ako je muzjak Izravni pregled mikroskopskih preparata razmasci uzoraka obojeni modificiranim Ziehl-Neelsen-ovim bojenjem (MZN) - crveno obojeni, mali kokobacili u nakupinama (unutarstanicni rast)

Izdvajanje

· · zbog mogue kontaminacije drugim bakterijama (pr. sadrzaj abomasusa) potrebna selektivna podloga: agar + 5-10% krvi ili + konjski ili govei seronegativni serum + antimikrobni pripravci (polimiksin B, bacitracin, nalidiksicna kiselina i aktidion) mlijeko ili kolostrum centrifugirati - sediment i mlijecnu masnou nasaditi na podlogu inkubirati pri 37° C s dodatkom 5-10% CO2 i do 15 dana

Identifikacija

Morfologija kolonija -nakon 3-5 dana inkubacije na selektivnom agaru s dodatkom seruma porastu tockaste, glatke sjajne, plavicaste, prozirne kolonije; starenjem kolonije postaju neprozirne, promjera 2-3 mm · sojevi B. abortus, B. suis, B. melitensis i B. neotomae u prvoj izolaciji imaju glatke kolonije, a subkultiviranjem (precjepljivanje kolonija na svjezu hranjivu podlogu) kolonije postaju neravne; B. ovis i B. canis imaju uvijek neravne kolonije - one su bez sjaja, mutne, zukaste boje · brucele nisu hemoliticne Mikroskopski izgled (preparat MZN) · MZN-bojenjem razmazaka suspektnih kolonija ocituju su kratki, crveno obojeni (MZNpozitivni) kokobacili u rutinskoj dijagnostici rabi se nekoliko testova zajedno s poznavanjem morfologije kolonija i tinktorijelnim osobinama za postavljanje presumptivne dijagnoze Brucella sp. brucele su nepokretne, katalaza-pozitivne, oksidaza-pozitivne (osim B. ovis i B. neotomae), vrlo brzo hidroliziraju ureju (osim B. ovis i B. neotomae), reduciraju nitrate u nitrite i ne tvore indol brza aglutinacija na predmetnici za dokazivanje B. abortus (to je seroloski postupak!!!) ·

Biokemijski testovi · · ·

Biotipizacija

· provodi se u referalnim laboratorijima

29

Bakterijske bolesti

Imunoloski testovi za dokazivanje antitijela za bakterijsku vrstu Brucella abortus Seroloski postupak MPP (mlijecno prstenasta proba) klasicna (spora) aglutinacija ELISA (imunoenzimni pokus) RVK Dopunski testovi Coomb-sov antiglobulinski test · · · · Dokazivanje najvaznijih klasa imunoglobulina IgM, IgG1, IgA IgM, IgG2, (IgG1) sposobnost dokazivanja svih klasa imunoglobulina IgG1, IgM jedan od najspecificnijih tseroloskih postupaka vrlo osjetljiv, otkriva "nekompletna" antitijela Opaska Uzima se mlijeko krava, (ne i ostalih ziv. vrsta!!!) ako je rezultat pozitivan, uzima se krv od svakog goveda pojedinacno u sirokoj uporabi, mogui lazno negativni rezultati (prozona)

IgM, IgG1, IgG2

Imunoloski testovi za dokazivanje B. melitensis, B. ovis, B. suis, i B. canis B. melitensis - RVK, ELISA, imunodifuzija u gelu; MPP nepouzdan B. ovis -RVK i ELISA B. suis - ELISA B. canis - komercijalni testovi za brzu aglutinaciju (Pitman-Moore, Inc.), RVK, imunodifuzija u gelu

Brucella Abortus Disease (Brucellosis) in Beef Cattle1

E.J. Richey and C. Dix Harrell2

Background

Brucellosis is an infectious and contagious bacterial disease of animals and humans caused by Brucella abortus . The disease primarily affects cattle and the American buffalo. Brucellosis sometimes infects horses, dogs, swine, and humans; however, brucellosis is considered to be a "dead-end disease" in these species, meaning it will not be transmitted to other animals. In the United States, the disease has been a major economic problem for the beef and dairy industries, their consumers and related agricultural industries. Brucellosis once affected more than 10 percent of the cattle population and perhaps as many as 30 percent of the cattle herds in the U.S. Annual production losses to United States dairy producers alone were estimated at $499 million annually in 1951 (1993 dollars) before an eradication program began. After investing over $3.5 billion in state, federal, and industry funds since 1951 in joint state-federal cooperative eradication programs the U.S. has reduced the brucellosis-infected herd count from 124,000 in 1957 to 40 as of November 30, 1996. If there were not a brucellosis eradication program, it is estimated that current losses due to reduced supplies of meat and milk would be in excess of $800 million annually.

Brucellosis Infection

In Cattle

In cattle, brucellosis is primarily a disease of the female, the cow. Bulls can be infected but they do not readily spread the disease. The brucellosis organism localizes in the testicles of the bull and produces an orchitis (inflammation of the testicles), whereas in the female the organism localizes in the udder, uterus, and lymph nodes adjacent to the uterus. The infected cows exhibit symptoms which may include abortion during the last third of pregnancy, retained afterbirth, and weak calves at birth. Infected cows usually abort only once. Subsequent calves may be born weak or healthy and normal. Some infected cows will not

30

Bakterijske bolesti

exhibit any clinical symptoms of the disease and give birth to normal calves. The brucellosis organism is shed by the millions in the afterbirth and fluids associated with calving and aborting. The disease is spread when cattle ingest contaminated forages or lick calves or aborted fetuses from infected cattle. Outside the animal, the afterbirth, and aborted calves the brucella bacteria are easily killed by sunlight, high temperatures and drying; however, the brucella organisms are difficult to control while they are in the animal; there is no economical cure for a brucellosis infected animal.

In Humans

In humans, Brucella abortus causes undulant fever, a disease characterized by intermittent fever, headaches, fatigue, joint and bone pain, psychotic disturbances, and other symptoms. It is contracted through exposure to Brucella abortus -contaminated milk and infected organs from infected animals. Livestock and slaughter industry workers, and consumers of unpasteurized milk and other dairy products made from unpasteurized milk are at the greatest risk of contacting undulant fever. Transmission occurs through contact with the tissues of infected animals at slaughter or ingestion of unpasteurized milk derived from infected cattle. (Note: Currently only one dairy herd in the US is known to be infected with brucellosis).

Control and Eradication

The brucellosis control and eradication program has been and continues to be multi-faceted; the program uses surveillance testing at the farm, at the stock markets, and at slaughter facilities; quarantine and herd depopulation with indemnity payments; herd management; and vaccination. Any bovine that is known to be infected with the field strain of Brucella abortus is required to be placed under quarantine until slaughtered.

Surveillance Testing

Surveillance testing consists of conducting a serological test or a series of serological tests to detect the presence of Brucella abortus antibodies in the animal. Animals that test negative to the initial official screening test are classified as "negative" and are considered NOT to be infected with brucellosis. Animals which are positive on the initial screening test are classified as "positive," and further testing is required to assist in a more definitive diagnosis of brucellosis. Serological screening tests for Brucella abortus antibodies include the Buffered Acidified Plate Antigen (BAPA) test, which is used solely in the laboratory, and the "Card Agglutination" test which is an official test conducted at the livestock markets or in the laboratory to classify animals as either positive or negative. Samples which test positive on the BAPA test are subsequently subjected to the "Card Agglutination" test in the laboratory. Screen testpositive samples could come from either an animal infected with field Brucella abortus organisms or from an animal that has persistent antibodies to a brucellosis vaccination. To determine if a screen-test positive animal is either infected with the disease or if it still has antibodies that were caused by vaccination, its blood samples are subjected to official supplemental serological testing. The Rivanol, the Complement Fixation (CF) and the Particle Concentration Fluorescent Immuno Assay (PCFIA) tests are official supplemental serological tests used in the laboratory. The results of the official supplemental testing are subsequently interpreted by a trained brucellosis epidemiologist who makes the final determination on the screen-positive animal; it is either designated as "suspect" and will require further testing, or it is classified as a "reactor" and must be sent to slaughter under permit. Suspects, if they have not been slaughtered, are required to be re-tested in 30 to 60 days. Quarantining the suspect animal or the herd from which the suspect originated will be determined by the trained epidemiologist. Reactors, those animals at highest risk of being infected with field strain brucellosis, are required to be appropriately tagged and branded within 15 days of the owner receiving official notification of the reactor status. The herd from which the reactor originated is placed under immediate quarantine. All reactors are "B" branded on the left tail-head; the reactor animal(s) must be slaughtered at an approved slaughter facility within 15 days of tagging or branding.

31

Bakterijske bolesti

Quarantine

When a herd has been officially quarantined because of brucellosis, any movement of nonneutered cattle into and out of the herd is restricted (neutered animals are steers and spayed heifers). Movement of non-neutered cattle out of quarantined herds is allowed to approved destinations only and only with a written permit (USDA Form VS-127) obtained from state or federal animal health personnel or a veterinarian accredited by USDA. Brands are required on all non-neutered quarantined animals prior to movement; Reactors are "B" branded on the left tail-head and all exposed or known suspect cattle are "S" branded on the left tail-head. Approved destinations include quarantined pastures, quarantined feedlots and approved slaughter facilities.

Release from Quarantine

Herds that are classified as "Quarantined Reactor Herds" and are subsequently found NOT to be infected with field stain Brucella abortus are released from quarantine without any further restrictions. Quarantined infected herds can be released following a minimum of two negative whole-herd tests. One additional negative whole-herd test is required following quarantine release for the herd to remain released from quarantine. A whole-herd test must include all animals in the herd over 6 months of age except steers, spayed heifers, brucellosis- vaccinated heifers less than 24 months of age, and bull calves less than 18 months of age. The first negative whole-herd test must be conducted no less than 30 days following removal of the last reactor cattle from the herd and the second negative whole-herd test must be conducted no less then 180 days following the removal of the last reactor animal from the herd. For the herd to remain released from quarantine, a post-quarantine whole-herd test must be conducted no less than 6 months following release of the herd from quarantine. Failure to conduct the post-quarantine whole-herd test can result in the herd being placed back under quarantine until the required testing is completed.

Herd Depopulation

Quarantined herds that are determined to be infected with field strain Brucella abortus will remain under quarantine. A quarantined herd may be considered for depopulation if the owner agrees and the herd is approved for depopulation by state and federal authorities. If an infected herd is selected to be depopulated, all non-neutered cattle will be slaughtered and the owner will receive an indemnity for each animal included in the depopulation. Neutered cattle (steers and spayed heifers) may be allowed to remain on the premises for additional growth before marketing; however, spayed heifers willbe required to be appropriately branded with an official "spay" brand.

Herd Management

Cattle herds in states or areas that are not free of brucellosis are at risk of contracting the disease. Factors that increase a herd's risk of being infected with brucellosis in endemic areas are listed as follows: Replacement cattle. Purchasing replacement cattle is a common method of herd-to-herd transmission of brucellosis. The more replacement animals a herd owner purchases, the higher the risk of contracting brucellosis. Source of additions. The source of purchased herd additions also affects an owner's risk of purchasing brucellosis-infected cattle. Buying replacement cattle from special auction sales, herd dispersal sales and/or consignment sales does not appear to significantly increase a herd's risk of contracting brucellosis. Purchasing cattle from private treaty sales and livestock dealers/order buyers increases the risk of buying brucellosis infected cattle. Cattle moving through these marketing channels often bypass change of ownership testing prior to the sale. In addition, some owners may be

32

Bakterijske bolesti

selling their cattle by these methods in order to avoid their cattle being tested and the potential that their herd may be placed under quarantine. Herds consisting of replacements bought from regular auction sales have a higher risk of contracting brucellosis. Some cattle moving through these sales can test negative but be in the incubation stage of the disease. During the incubation stage of the disease, the animal is infected but as yet has not developed clinical signs of brucellosis nor has it had sufficient time to produce antibodies against the organism; hence the test is negative. More likely, however, brucellosis-infected cattle that are marketed through these sales are untested (but infected) brucellosis-vaccinated heifers that are considered "too young to test." In this way, infected heifers may move to other farms without a test, spreadingbrucellosis in the process. Distance between herds. The distance between your herd and a brucellosis-infected herd affects the risk of contacting brucellosis. Herds located less than half a mile away from brucellosis-infected herds are more than four times as likely to become infected than other herds. Herds one half mile to one mile away are still at risk of brucellosis spreading through the cattle community. However, the spread of the disease into a herd is much less likely to occur when the herd is located over one mile from the brucellosis-infected herd. Stray cattle. Herds reporting stray cattle are more than twice as likely to have brucellosis than herds not reporting stray cattle intrusion into the herd.

Contact with animals. In areas where brucellosis exists, herds that have contact with foxes, stray dogs, and coyotes are at higher risk of contacting brucellosis. Domestic and wild canids can spread brucellosis by dragging dead/aborted calves and afterbirth (placenta) between neighboring herds. Coyotes have been shown to shed the brucellosis organism in their feces for several weeks following ingestion of infected material. Multiple herds. Ownership of multiple herds potentially increases the risk of a herd being infected with brucellosis. The more herds a rancher owns, the higher their probability of being exposed to brucellosis becomes. Culling practices. Culling practices are important factors when considering a herd's risk of having brucellosis. Owners of small cattle herds continue to cull less than 10 percent of their herd each year. In general, it requires 3-5 years (or longer) to detect an infected cow through livestock marketing or slaughter testing if the owners cull less than 10 percent of their cow herd each year. If the industry solely relies upon market and slaughter testing to detect brucellosis- infected herds, many small brucellosis-infected herds will remain undetected just because of the culling practices used on the herd.

33

Bakterijske bolesti

Vaccination of Female Cattle against Brucellosis

Strain-19 Vaccine Until recently, "Strain-19 vaccine" was the only brucellosis vaccine used in the brucellosis control programs for cattle in the United States. Strain-19 vaccine was and still is an effective tool in brucellosis control. However, as with any tool, using Strain-19 vaccine has its advantages and disadvantages. Strain-19 is a live vaccine that stimulates the immune system of the vaccinated animal to resist a brucellosis disease challenge, produce antibodies against the disease organisms, and kill off the vaccine organisms. Normally, a vaccinated animal will retain the resistance to disease for an extended period of time (years) but the detectable antibodies will disappear in a few months. Unfortunately, the serological tests used to detect brucellosis-infected cattle cannot differentiate between antibodies produced against the Strain-19 Vaccine and antibodies produced against the brucellosis disease organism; hence, if a vaccinated animal is tested too soon following vaccination or if the vaccinated animal retains the antibodies stimulated against the vaccine for an extended period, the vaccinated animal would test positive. In addition, some animals vaccinated with Strain-19 vaccine (such as those whose uteruses and/or mammary glands have begun to develop) will become permanently infected with the vaccine organism, constantly producing antibodies against it and thus continuing to test positive. If an animal is vaccinated with Strain-19 Vaccine after the animal's the animal is prone to become permanently infected with the live vaccine organism; hence the animal will continue to stimulated to produce antibodies against the vaccine. Calves born to Strain-19-vaccinated cows will acquire anti-brucellosis antibodies from the cow through the colostrum (first-milk) immediately after birth. These acquired antibodies will normally be circulating in the calves' blood system for 4-6 months, and can neutralize or kill the live vaccine organisms if the calf is vaccinated during the time it still possess the antibodies. Hence, it is required that no heifer calf be vaccinated before 4 months of age. Because some calves mature early and become permanently infected with the live vaccine organism and because oldercalves can produce excessive antibodies when vaccinated, heifer calves should be vaccinated before they are 10 months of age. The routine vaccination of cattle/herds against brucellosis is restricted to heifers between the ages of 4-10 months of age.

RB-51

In 1996, the USDA officially recognized and began using a new brucellosis vaccine for vaccinating cattle against the disease. Like Strain-19, the new vaccine, "RB-51," is a live vaccine derived from the cattle brucellosis bacteria, Brucella abortus . Unlike Strain-19; however, RB-51vaccine does not stimulate antibodies that are detected by the standard brucellosis serological tests. Thus the problem of having some brucellosis-vaccinated cattle testing positive has been alleviated. As with Strain-19, the new RB-51 vaccine is to be administered only by state and federal brucellosis program personnel and USDA accredited veterinarians. The vaccination age of heifers is between 4-10 months of age and proper permanent identification is required of all vaccinated cattle. Permanent identification consists of applying an official USDA brucellosis eartag and official ear tattoo to each vaccinated animal.

34

Bakterijske bolesti

Who Should Vaccinate?

Cattle owners have inquired about the feasibility of continuing to brucellosis vaccinate heifers. The answer is not a simple one; it has to be the decision of the herd owner. But the herd owners must realize that brucellosis has not been eradicated from the U.S. and if their herd is located in an area of brucellosis infection, then vaccinate . If their herd is at risk of contacting brucellosis (described above) then vaccinate . If they are selling replacement heifers and their clients will only purchase vaccinated heifers, then vaccinate .

Routine Herd Testing

If a herd has had at least two consecutive negative whole herd blood test between 10 and 14 months apart, the herd is eligible for "certification." Certification is not automatic; it requires, in addition to the negative tests, that the herd owner APPLY for the "Brucellosis Certified Free" status at their respective State Veterinarian's Office. Once certified,a herd must have an annual negative whole-herd test between 10 and 14 months after the certification anniversary date to be eligible for re-certification. Herd owners also frequently ask if they should continue to test their herds annually to retain a "Brucellosis Certified Free Herd" status. Basically, it is an economic decision depending upon the type of operation and the location of the herd(s). If the cattle operation is selling breeding stock or replacement heifers throughout the year, a certified herd keeps them ready to sell at any time without any additional brucellosis test requirements. In addition, the certified status provides the buyers with some degree of confidence that they are not "buying" brucellosis. If the herd is located in an area where brucellosis- infected herds exist, an annual test will allow the owner to detect infection faster than waiting for a market/slaughter test to find it. Whole-herd testing every 10 to 14 months provides an excellent monitoring tool to insure that brucellosis has not been introduced into a brucellosis-free herd. In reality, the owner should consider having a "Brucellosis Certified Free" status a bonus from using an important disease- monitoring tool.

Brucellosis in the U.S.

As of December 1, 1996, there are 37 brucellosis- free states and 14 Class A states in the U.S. The brucellosis Class Free classification is based on a state carrying out all requirements of the state-federal cooperative eradication program and finding no cases of brucellosis in cattle or bison during a 12-month period. To be eligible for Class A status, a state must have a herd infection rate of less than 2.5 herds per 1000 for a 12-month period (0.25%). Several of the current Class A states have not detected a brucellosis- infected herd

35

Bakterijske bolesti

during the last year and are on the 12-month count-down to Class Free. However, experience indicates that if a state has no infected herds for six years, it has eradicated the disease and no more brucellosis remains in the cattle population waiting to cause a problem; many states fall within this category. All-in-all, the brucellosis eradication program has made major advances in controlling this disease; however, if you maintain cattle in areas that are still at risk, please consult your private veterinary practitioner to discuss whole-herd testing of your cattle and whether brucellosis vaccination of heifers should be continued as a part of your herd health program.

Footnotes

1. This document is VM-100, one of a series of the Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. First printed March, 1997. Please visit the FAIRS Website at http://hammock.ifas.ufl.edu 2. E.J. Richey, DVM, Professor and Beef Cattle Veterinarian, Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, and C. Dix Harrell, DVM, MS, Area Epidemiology Officer, USDA-Animal and Plant Inspection Service, Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Gainesville, 32611. The Institute of Food and Agricultural Sciences is an equal opportunity/affirmative action employer authorized to provide research, educational information and other services only to individuals and institutions that function without regard to race color, sex, age, handicap, or national origin. For information on obtaining other extension publications, contact your county Cooperative Extension Service office. Florida Cooperative Extension Service / Institute of Food and Agricultural Sciences / University of Florida / Christine Taylor Waddill, Dean

Copyright Information This document is copyrighted by the University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences (UF/IFAS) for the people of the State of Florida. UF/IFAS retains all rights under all conventions, but permits free reproduction by all agents and offices of the Cooperative Extension Service and the people of the State of Florida. Permission is granted to others to use these materials in part or in full for educational purposes, provided that full credit is given to the UF/IFAS, citing the publication, its source, and date of publication.

Brucella

ORGANISM: Genus: Brucella Species: abortus (cow), melitensis (goat), suis (pig), canus (dog) GENERAL CONCEPTS: The Brucellae are generally associated with animal infections but most are also pathogenic for humans. All human infections come from animals; there is no human to human transmission. Such diseases are called "zoonoses".

36

Bakterijske bolesti

B. melitensis is associated with a specific human disease called Malta fever. Brucellae are intracellular parasites.

Distinctive properties of genus Brucella:

The genus Brucella is composed of Gram negative coccobacilli. Most are aerobic but grow best in a 5-10% CO2-enriched environment. Their metabolism is oxidative. Brucellae possess a typical Gram-negative LPS endotoxin, as well as two major serological determinants; A and M.

PATHOGENESIS:

Of the four species that cause disease in humans, B. melitensis and B. suis are more transmissible to humans, particularly via the oral route. These bacteria are intracellular parasites of the reticuloendothelial (RE) system (e.g. spleen, liver, bone marrow, lymph nodes and kidneys). Following exposure, the organisms may produce a localized abscess, which is followed by bacteremia. Phagocytosis by macrophages and intracellular multiplication leads to localization in the RE tissues. Disease may remain subacute or become chronic with initial symptoms of malaise, chills, weakness and intermittent fever. Granulomas in various RE tissues may occur as a result of a hypersensitivity reaction. In animals, multiplication occurs in the uterus because of the presence of erythritol, which the bacteria prefer to glucose. This localization can lead to abortion or excretion in milk (human source for infection).

HOST DEFENSES:

Because of the intracellular life-style of the Brucellae, humoral defenses play a minor role. Cell mediated defenses (T-lymphocytes, activated macrophages) are required.

EPIDEMIOLOGY:

Brucella infections have a worldwide distribution but have been mostly eradicated in the United States. B. abortus affects primarily cows; B. melitensis affects goats and sheep; B. suis affects pigs; B. canus affects dogs. Humans generally acquire disease through occupational exposure, Thus, veterinarians, meat workers and animal handlers are those most likely to be afflicted.

37

Bakterijske bolesti

DIAGNOSIS:

Clinical: Symptoms of brucellosis are variable and diagnosis is, therefore, very difficult. Flu-like symptoms with limb and back pain, an intermittant fever with malaise may last up to 3 months for acute disease (a year or more for subacute or chronic disease). Laboratory: Isolation of Brucella from the blood is possible. Cultures must be incubated 3-4 weeks with added CO2.

Swollen joint of a caribou with brucellosisPhoto credit: N. Larter, GNWT, RWED, Inuvik Region

Brucellacapt® is a single-step immunocapture agglutination assay for the detection of total anti-Brucella antibodies which is performed in an easy and direct way.

Each kit contains enough reagents to assay quantitatively total antibodies against Brucella in 24 samples: · 24 U-bottom 8-wells strips coated with anti-human immunoglobulins. 12 ml of stained Brucella melitensis bacterial suspension formaldehyde treated. 14 ml of diluting solution. 250 µl of positive control serum containing proclinâ. 250 µl of negative control serum containing proclinâ.

·

· · ·

Find more at: http://www.reactolab.ch/Vircell/BRUCELLOSIS.htm

38

Bakterijske bolesti

CONTROL:

Sanitary: Pasteurization of dairy products and use of protective clothing prevent human infection. More importantly, systematic identification and elimination of infected animals and vaccination of animals reduces the reservoir. Immunological: Vaccination for persons at high risk is possible, but they must first be tested to ensure that no hypersensitivity already exists. Chemotherapeutic: Tetracycline or a tetracycline/streptomycin combination is generally curative.

Brucella melitensis in Texas, October 1999 Impact Worksheet

Summary: Brucella melitensis was identified in a Texas cow during routine market cattle testing. As of October 13th, additional testing has not revealed any other cases. If the situation remains localized, there should not be any impact on APHIS' accomplishment of its eradication goals or on trade. Human health should not be impacted either as long as the situation remains localized.

How extensive is the situation?

B. melitensis was identified in a cow tested during routine market cattle testing in Texas. Milk and tissues from the cow were used in making the diagnosis. The infected cow came from a herd located in Starr county approximately 15 miles northeast of Rio Grande City. Testing has begun on the herd as well as on the surrounding operations. As of October 13th, 55 of the 80 head located in the same group as the infected cow have tested negative as have an additional 30 head located in a second group of 80 head also owned by the rancher but kept physically separated. The affected group is being depopulated. Approximately 10 surrounding operations located within 1 mile of the affected operation have been identified for testing. All cattle, sheep, and goats on these 10 operations will be tested. (Source: Dr. John Lomme, Assistant AVIC, Texas) The herd on the affected operation was assembled in 1994 and is a combination of registered animals and animals purchased at local markets from other local producers. A Mexican origin for one or more of the cows in the herd can not be ruled out. (Source: Dr. John Lomme, Assistant AVIC, Texas)

Background Information on B. melitensis

Although bovine brucellosis in the U.S. is most commonly caused by Brucella abortus, cattle can become infected with B. melitensis. B. melitensis is more typically found in sheep and goats. In sheep and goats, B. melitensis is currently found in Europe, Africa, Asia, and Bolivia and Mexico in the Americas. B. melitensis was last found in sheep and goats in the U.S. in the early 1970s. Recently, B. melitensis infection in cattle has become a significant problem in the Middle Eastern countries of Israel, Kuwait, and Saudi Arabia. Transmission of Brucella spp. between animals usually occurs by oral exposure to aborted fetuses, placentas, vaginal discharge, and drainage from abscesses. Wildlife have not been reported to play an important role in the transmission of B. melitensis to domestic livestock. B. melitensis has been isolated from hares in northern Europe, however (Witter, 1987). In humans, B. melitensis causes the most important clinical disease of the Brucella organisms. Historically in the U.S., brucellosis was mainly described as an occupational disease of individuals, mostly male, who were exposed through work with livestock or animal products. More recently it has caused more infections in people through ingestion of infected unpasteurized dairy products, particularly soft cheeses made from sheep and goat milk.

39

Bakterijske bolesti

During the years from 1973 through 1992, 426 cases of human brucellosis were reported in California. Of these, 185 cases were attributed to B. melitensis, often due to consumption of milk and cheeses in Mexico (Chomel, 1994). Human cases of B. melitensis are found annually in Texas. These cases are typically associated with dairy products consumed by Hispanic families traveling back and forth to Mexico (Source: Texas Department of Health).

What is the livestock production in the affected area?

Starr county and its 4 surrounding counties account for only a small percentage of Texas' livestock inventory (Table 1). The 5 counties combined have 1.3% of the total cattle in Texas and less then 1% of sheep and goats. Table 1. Numbers of livestock animals and numbers of farms in affected county (Starr) and 4 counties which border the affected county, 1997 County Brooks Hidalgo Jim Hogg Starr Zapata Total of 5 counties Total for Texas (x 1,000) % of total from 5 counties Cattle & calves animals farms 28,336 242 34,322 517 32,730 174 63,092 503 27,699 306 186,17 1,742 9 14,533 144 1.3 1.2 Sheep & lambs animals farms 47 5 254 20 D 2 129 11 28 3 458 1,532 <0.1 41 7 0.6 Goats animals 0 45 148 0 0 193 690 <0.1 farms 0 6 4 0 0 10 2.7 0.4

D - data not published to avoid disclosing individual operations Source: NASS, Census of Agriculture, 1997 Cattle and calves are Texas' top agricultural commodity, accounting for 43% of the state's total farm receipts in 1997. In 1998, Texas had 16.3% of total US inventory of beef cows, 21% of cattle on feed, and 19.6% of sheep and lambs (Tables 2 and 3). Texas is the only state that reports numbers of goats. (Source: USDA,ERS; USDA,NASS) Table 2. Livestock inventory and value of production in Texas and U.S., 1998 Number, in thousands Texas All cattle and calves, Jan 1, 98 beef cows milk cows cattle on feed* Sheep & lambs, Jan 1, 98 Goats, 1997 14,500 5,510 370 2,860 1,530 690 U.S. 99,744 33,885 9,199 13,608 7,825 % of US in Texas 14.5 16.3 4.0 21.0 19.6 15,648 797,826 Total Value, in thousand dollars Texas 7,830,000 U.S. 60,193,070 % of US from Texas 13.0

For cells left blank information was not available * Total number during 1998 Source: USDA:NASS:Agricultural Statistics, 1999; Census of Agriculture, 1997 Table 3. Operations with livestock, Texas and U.S., 1998 Texas operations, number U.S. operations, number % of US in Texas

40

Bakterijske bolesti

Cattle and calves beef cows milk cows Sheep & lambs

147,000 131,000 3,200 7,000

1,115,650 855,860 116,430 68,810

13.2 15.3 2.7 10.2

Source: USDA:NASS:Agricultural Statistics, 1999

What are U.S. exports of cattle, swine, sheep and goat products and how might the finding of B. melitensis affect exports?

The total value of U.S. cattle, sheep & goat exports was $190.3 million in 1998. From January to July 1999, the value of U.S. exports of cattle, sheep and goats totaled $75.3 million. Nearly 60% of the total value in 1998 was exported to Mexico; exports to Canada accounted for 34%. From January to July 1999, $37 million of cattle, sheep and goats was exported to Mexico and $32 million was exported to Canada. Mexico imported approximately 800 thousand cattle, sheep and goats from the U.S. in 1998 and nearly 360 thousand animals from January to July 1999. Canada was a distant second to Mexico, importing approximately 130 thousand animals in 1998 and 105 thousand from January to July 1999. A more detailed picture of U.S. exports is provided in the table in Appendix A. Texas is one of the main exporting states for live animals. The Economic Research Service estimates that Texas' share of the value of total U.S. live animal and meat (excluding poultry) exports in FY 1998 was 13 percent with a value of around $655 million. Exported U.S. cattle are currently tested for brucellosis prior to exportation. For goats, Mexico requires certification that the animals come from a herd that is free of B. melitensis, and Canada requires a test for B. abortus. Sheep are required by Mexico to be tested for B. ovis, while Canada has no testing or certification requirements regarding brucellosis in sheep. A finding of B. melitensis should not alter the ability of the U.S. to export livestock to its major trading partners (Mexico and Canada), although specific testing or certification requirements may be affected if additional cases are discovered. The U.S. and Mexico have had a history of disputes over phytosanitary requirements.

What does the meat packing industry look like in Texas?

In the last decade, human brucellosis cases in Texas have only rarely been associated with slaughter facilities (Source: Texas Department of Health). In 1999, two cases of B. suis were diagnosed in workers at a small game meat processing facility which slaughtered feral swine. Within Texas, approximately 20% of the state's 186 meat packing and processing facilities are located within 220 miles of Starr county. Each processing plant employs an average of 110 individuals. (Source: U.S. Department of Commerce, County Business Patterns, 1997)

Conclusions

If it remains isolated, the finding of B. melitensis in Texas should not have a major impact on U.S. brucellosis eradication goals. Live animal exports should also remain unaffected, since brucellosis testing is already required by the major importing countries of Mexico and Canada. The type of testing or specific certification required may be affected if additional cases of B. melitensis are found. If you have questions or would like to comment on this worksheet, please reply to this message or contact Chris Kopral at (970) 490-7819 or Carol Tuszynski at (970) 490-7893. Prepared by: Center for Emerging Issues, Centers for Epidemiology and Animal Health Appendix A: Top U.S. Export Markets for Various Livestock Live Cattle 1998 Country Quantity received from % of total U.S. live cattle Jan-July 1999 Country Quantity received from % of total U.S. live cattle

41

Bakterijske bolesti

World Mexico Canada Lebanon Egypt Saudi Arabia

U.S. (no) 284,408 159,188 117,227 1,794 1,340 1,152

exports 56.0% 41.2% 0.6% 0.5% 0.4% World Canada Mexico Lebanon Saudi Arabia Colombia

U.S (no) 123,687 70,161 48,583 2,228 884 280

exports 90.6% 2.8% 2.3% 1.6% 0.5%

Live Sheep 1998 Country World Mexico Canada Dominican Republic Quantity received from U.S. (no) 596,013 580,665 14,273 525 97.4% 2.4% <0.1% % of total U.S. live sheep exports Jan-July 1999 Country World Mexico Canada Dominican Republic Quantity received from U.S (no) 290,931 282,963 7,357 398 97.3% 2.5% 0.1% % of total U.S. live sheep exports

Live Goats 1998 Country World Mexico Canada Dominican Republic Brazil Quantity received from U.S. (no) 65,298 61,611 1,234 1,013 423 94.4% 1.9% 1.6% 0.6% % of total U.S. live goat exports Jan-July 1999 Country World Mexico Canada Taiwan Philippines Quantity received from U.S (no) 31,178 27,481 1,878 1,701 110 88.1% 6.0% 5.4% 0.4% % of total U.S. live goat exports

Source: World Trade Atlas Additional References · · · Bean NH, et al. Foodborne disease outbreaks, 5-year summary, 1983-1987. Morbidity and Mortality Report, 1990;39(SS01):15-23. Witter JF. Brucellosis. In, Brucellosis in Wild Animals, ed MM Bememtsuva, Amerind Publishing Co Ltd, New Delhi;1987:280-287. Chomel BB, et al. Changing trends in the epidemiology of human brucellosis in california from 1973 to 1992; a shift toward foodborne transmission. J Infect Dis 1994; 170(5):1216-23.

42

Bakterijske bolesti

BAKTERIJSKE VRSTE IZ RODA PASTEURELLA

· · · · · bakterije iz vrste Pasteurella su male (0.2 µm x 2.0 µm) Gram-negativne stapiaste ili kokobacilarne, nepokretne, ne tvore spore, fakultativno anaerobne, oksidaza i katalaza pozitivne mogu rasti i na obicnim hranjivim podlogama, ali najbolji rast postize se na podlogama s dodatkom krvi ili seruma Prirodna obitavalista bakterije vrste Pasteurella prisutne (prosirene) su po cijelom svijetu s razlicitim i velikim brojem domaina veina pasterela su komenzali na sluznicama gornjih disnih prohoda i probavnog sustava zivotinja

PATOGENEZA

· · · · · mehanizam bolesti nije u cijelosti poznat; endotoksini imaju djelomice znacenje u septikemijskom obliku bolesti - primjerice: kolera peradi (P. multocida tip A) i hemoragicna septikemija goveda (P. multocida tip B) infekcija moze biti endogena ili egzogena, no najcesa ulazna vrata m.o. su sluznice disnog sustava; virulencija se pojacava pasazama na prijemljivim zivotinjama kao sto je to slucaj u pastereloze goveda smatra se da su sve bakterije pripadnice vrste Pasteurella ekstracelularni paraziti, a raznovrsni predisponirajui cimbenici pr. stress i virusne infekcije pogoduju nastanku infekcije poznate pod imenom "transportna groznica" (shipping fever) termolabilni dermonekrotoksin vrste P. multocida tip D ima znacajnu ulogu u patogenezi atroficnog rinitisa svinja, naime, infekcija nosnih konhi bakt. vrstom Bordetella bronchiseptica olaksava naseljavanje i umnazanje P. multocida tip D P. haemolytica (sada Manheimia haemolytica) tvori topivi citotoksin (leukotoksin) koji ima znacenje u slamanju primarnog mehanizma obrane plua djelovanjem na alveolarne makrofage i ostale leukocite prezivaca

Plua kunia

43

Bakterijske bolesti

SEROTIPIZACIJA PASTERELA

· · · · · na osnovi K antigena (kapsularni polisaharidi) sojevi vrste P. multocida dijele se u skupine ili tipove oznacene slovima A, B, D, E i F unutar skupine sojevi se na osnovi razlika u somatskim (O) antigenima lipopolisaharidne grae dijele u serovarove i oznacavaju brojevima u postupku serotipizacije najprije se odredi pripadnost K skupini, a potom se utvruje pripadnost serovaru M. haemolytica ima analogne kapsularne tipove koji se identificiraju brojevima razlikujemo dva biotipa P. haemolytica i to na osnovi brojnih znacajki ukljucujui patogenost, antigene i biokemijske osobine

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

UZORCI

· · · · · promijenjeni dio plua i to rubove koji granice s nepromijenjenim dijelom tkiva septikemijski oblici bolesti: jetra, slezena, bubrezi, limfni cvorovi od zivih zivotinja mogue je pretraziti gnoj, eksudate, obriske nosne sluznice, bronhalni ispirak i mlijeko Izravni pregled mikroskopskih preparata gramovim bojenjem tesko se uocavaju u okolnom tkivu, bolje je bojiti po Löffleru kratki bipolarno obojeni stapii (ili Giemsi)

IZDVAJANJE

· · uobicajena hranjiva podloga s dodatkom ovcje (ili govee) krvi (krvni agar) materijale treba nasaditi i na krvni agar i na MacConkey

IDENTIFIKACIJA

· · · · kod svih vrsta kolonije porastu ve nakon 24 sata inkubacije, srednje velicine, okrugle i sivkaste kolonije vrste P. multocida su ne-hemoliticne, karakteristicnog su neugodnoslatkastog mirisa, ne rastu na MacConkey-ovom agaru, tvore indol P. multocida tip A ima velike, sluzave kolonije zbog izrazene kapsule (hijaluronska kiselina) na krvnom agaru M. haemolytica je -hemoliticna, a na MacConkey-ovom agaru rast se ocituje sitnim, tockastim crvenim kolonijama (tolerira zucne soli u podlozi), nema neugodni miris i ne tvori indol

MIKROSKOPSKI IZGLED

· Gram-negativni stapii ili kokobacili

44

Bakterijske bolesti

OSJETLJIVOST NA ANTIMIKROBNE PRIPRAVKE

· veina sojeva bakt. vrste P. multocida osjetljiva je na penicilin (neuobicajano za Gram-neg. bakterije)

Glavni domaini i bolesti sto ih uzrokuju bakterije vrste Pasteurella sp.

Vrsta P. multocida tip A

Glavni domain(i) govedo ovca svinja kuni perad

tip B tip D M. haemolytica biotip A

govedo i ostali prezivaci svinja govedo ovca

Bolest i stanje komenzalizma dio kompleksa "transportna groznica" dio kompleksa "enzootska pneumonija" goveda povremeno-jaki mastitis pleuropneumonija mastitis pneumonija (cesto sekundarna) jedan od uzrocnika "smrcanja", pleuropneumonija, apscesi, otitis media, konjunktivitis, inf. genitalnih organa kolera peradi (primarna inf.) enzootska hemoragicna septikemija (primarna inf.) nazofarniks ziv. nosilaca atroficni rinitis (s ili bez Bordetella bronchiseptica) dio kompleksa "transportna groznica" pneumonija (primarna ili sek. inf.) enzootska pneumonija (primarna ili sek. inf.), septikemija janjadi do 3 mj., gangrenozni mastitis

http://www.lbah.com/Rabbits/pasteurella.htm

45

Bakterijske bolesti

Bakterije roda Haemophilus

· bakterije pripadnice vrste Haemophilus su mali, Gram-negativni stapii, krai od 1 µm siroki 1-3 µm, ali mogu biti i u obliku kokobacila ili dugackih izdanaka (filamenata) bakterije pripadnice vrste Haemophilus u nacelu zahtjevaju jedan ili oba faktora rasta, X (hemin) koji je termostabilan, i V {nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) koji je termolabilan hemofilusi su pokretne, fakultativno anaerobne bakterije, tvore kiselinu iz glukoze, reduciraju nitrate u nitrite, a tvorba oksidaze i katalaze varijabilna je osobina zahtjevne su s obzirom na podloge pa ih je najbolje uzgajati na cokoladnom agaru (sadrzi X i V faktor) u struji 5-10% CO2 pri 370 C

·

·

·

Promjene u nomenklaturi-nazivlju

Prijasnje ime Haemophilus equigenitalis Haemophilus pleuropneumoniae Haemophilus avium · Sadasnje ime Taylorella equigenitalis Actinobacillus pleuropneumoniae Pasteurella avium

Actinobacillus pleuropneumoniae je Gram-negativna, nepokretna i nesporogena stapiasta bakterija srednje velicine (0.3-0.5 x 0.6-1.4 µm), moze poprimiti i kokoidni oblik

Prirodna obitavalista

· · · · bakterije pripadnice vrste Haemophilus komenzali su ili parazitiraju pretezito na sluznicama gornjih disnih prohoda i genitalnog trakta ljudi i zivotinja H. parasuis uobicajeno se nalazi na nosnoj sluznici zdravih svinja H. somnus uobicajeno se nalazi na sluznici disnog sustava zdravih goveda, a H. paragallinarum cese je prisutan u disnom sustavu bolesnih ptica ili ptica koje su preboljele bolest Actinobacillus pleuropneumoniae prosiren je posvuda

46

Bakterijske bolesti

PATOGENEZA

· · · · · H. paragallinarum posjeduje kapsulu i tvori citotoksin koji utjeces na virulenciju H. somnus je otporan na fagocitozu, vezuje se na epitel i djeluje toksicno na endotel na koji se takoer vezuje; poput stafilokoknog proteina A i H. somnus moze na sebe vezati imunoglobuline (i tako ih onemoguiti u djelovanju) promjene na pluima, tjelesnim supljinama i zglobovima su serofibrinozne i/ili gnojne H. somnus uzrokuje tromboticni vaskulitis koji ima za posljedicu meningitis i hemoragicno-nekroticne promjene najprijemljivije zivotinje na infekciju su najmlae ziv. koje do tada nisu bile u doticaju s hemofilusima, a stresni cimbenici pogoduju (pospjesuju) pojavi bolesti A. pleuropneumoniae uzrocnik je respiratorne infekcije u svinja akutnog, subakutnog i kronicnog tijeka; smatra se da imunokompleksi mogu ostetiti endotel krvnih zila pa je posljedica vaskulitis i tromboza uz pojavu edema, nekroze, infarktacija i krvarenja; termolabilni citotoksin sto ga tvori ova bakterija osteuje svinjske makrofage i krvne monocite Akutna pleuropneuminija uzrokovana A. pleuropneuminiae

·

Pneumonic actinobacillosis.

Laboratorijska dijagnostika

Uzorci

· · · · -materijal treba nacijepiti odmah nakon uzimanja i sprijeciti njegovo isusivanje (unutar 24 sata) nije dostatno uzorke pohranjene u transportnom mediju transportirati u hladioniku, nego ih treba smrznuti ispod 600 C Izravni mikroskopski pregled uglavnom vrlo tesko uociti male Gram-negativne stapie; IF osjetljiviji i specificniji postupak

Izdvajanje (obje vrste)

· cokoladni agar (razoreni eritrociti izvoriste su X faktora) + Staphylococcus aureus preko nacijepljenog materijala biti e izvoriste V faktora

47

Bakterijske bolesti

·

inkubacija traje 3-4 dana u struji 5-10% CO2 pri 35-370 C, mada se rast uocava ve nakon 24 sata

Identifikacija Morfologija kolonija

· · -hemofilusi: nakon 24-48 sati inkubacije porastu malene, kolonije u obliku kapljice rose A. pleuropneumoniae: male (1mm) kolonije okruzene zonom -hemolize (ponekad podsjea na -hemoliticne streptokoke) postoje dvije razlicite vrste kolonija: jedne poput voska a druge meke i sjajne-mazive; ne rastu na MacConkey-evom agaru

·

Mikroskopski razmasci

· · hemofilusi: mali Gram-negativni stapii koji mogu biti i kokobacilarnog oblika, znatno rijee se pojavljuju u obliku kratkih filamenata svi aktinobacili su Gram-negativni stapii ili kokobacili

BIOKEMIJSKE OSOBINE

SEOLOSKI POSTUPCI - ELISA, IHA, PRECIPITACIJA U GELU

Bolesti sto ih uzrokuju bakterije vrste Haemophilus Vrsta H. influenzae H. parainfluenzae Domain(i) covjek covjek Bolest ili znacenje veliki broj bolesti-od respiratornih do meningitisa normalni stanovnik disnog sustava, povezan s inf. uretera-uretritis · zarazni tromboembolicni meningoencefalitis: septikemija s infarktima cerebeluma · respiratorne bolesti: pneumonija i pleuritis, ceste mjesovite infekcije · inf. genitalnog sustava: endometritis, pobacaj; moze se nai u spermi i gen. sustavu bikova komenzal genitalnog sustava ovaca, ponekad epididimitis i orhitis ovnova; moze uzrokovati i: pneumoniju, mastitis, poliartritis, meningitis i septikemiju · prim. uzrocnik Glasser-ove bolesti: poliserozitis i meningitis prasadi · artritis i pneumonija starijih svinja · sek. se naseljava kod influence svinja ili enzootske pneumonije (Mycoplasma hyoneumoniae) zarazna korica pilia:nosni iscjedak, kihanje, edem lica, smanjenje nesivosti jako osjetljive na infekciju akut.:jaka fibrinozna pleuropneumija, kron:pleuritis pluna sekvestracija i apscesi, mb i mt visok u ne-imunih z.

H. somnus

govedo

ovca

H. parasuis

svinja

H. paragallinarum Actinobacillus pleuropneumoniae

perad japan. prepelica svinja

48

Bakterijske bolesti

Red Chlamydiales

· · klamidije su obligatne intracelularne bakterije a pripadaju bakterijskom redu Chlamydiales mnoge klamidije koegzistiraju unutrar vertebrata ili ameba ne uzrokujui nikakve znakove bolesti pa se stoga, s pravom smatra da su ti domaini prirodni rezervoari klamidija najnovija genetska istrazivanja dovela su do znacajih promjena u dosadasnjoj klasifikaciji klamidija red Chlamydiales, prema najnovijoj klasifikaciji sastoji se od cetiri porodice: Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae i Waddliaceae (tablica 1);

· ·

Tablica 1

RED CHLAMYDIALES

PORODICA CHLAMYDIACEAE Rod Chlamydia Vrsta Chlamydia trachomatis Chlamydia muridarum Chlamydia suis Rod Chlamydophila Vrsta Chlamydophila (prije Chlamydia) pecorum Chlamydophila (prije Chlamydia) pneumoniae Chlamydophila psittaci Chlamydophila abortus Chlamydophila caviae Chlamydophila felis PORODICA Parachlamydiaceae ROD Parachlamydia Neochlamydia PORODICA SIMKANIACEAE Vrsta Vrsta Simkania negevensis Z Waddlia chondrophila PORODICA WADDLIACEAE poznata kao Chlamydia psittaci

ima tri biovara: TWAR patogen za ljude, Koala i Equine

49

Bakterijske bolesti

·

· · · · · · ·

·

·

· · · · · · · · · ·

infekcija stoke, zivotinja-kunih ljubimaca i ostalih zivotinjskih vrsta klamidijama moze se ocitovati upalom plua (pneumonija), pobacajem (abortus), rinitisom (upala nosne sluznice), konjunktivitisom (upala ocnih spojnica), artritisom (upala zglobova) ili enteritisom (upala crijevne sluznice) a navedeni znakovi bolesti mogu u potpunosti izostati ljudi imaju vlastite vrste klamidija: Chlamydia trachomatis i Chlamydia pneumoniae koje u covjeka uzrokuju konjunktivitis Chlamydia trachomatis uzrocnik je spolno prenosive bolesti u covjeka a Chlamydia pneumoniae smatra se jednim od uzrocnika arterioskleroze u ljudi do usavrsavanja dijagnostickih postupaka koji se temelje na DNK-analizi dijagnosticiranje klamidija temeljilo se na uzgoju u zutanjcanoj vrei embrioniranih jaja ili stanicnoj kulturi podrijetlom od misa, majmuna ili covjeka klamidije posjeduju stanicnu stjenku slicnu onoj u ostalih Gram-negativnih bakterija ali im nedostaje muramicna kiselina obligatni su unutarstanicni paraziti a za razvoj zahtijevaju visokoenergetske tvari pr.: ATP (tzv. "energetski paraziti") klamidije imaju jedinstveni razvojni ciklus s promjenjivim, morfoloski razlicitim, reproduktivnim oblicima elementarno tjelesce (ET) je infekciozno i vrlo malo (200600 nm u promjeru), a predstavlja izvanstanicni oblik klamidija elementarno tjelesce (ET) gotovo svih pripadnica vrsta Chlamydiales ukljucujui i sve pripadnice vrste Chlamydiaceae imaju oblik vakuoalrnih "inkluzija" u kojima se pretvaraju u retikulska tjelesca (RT) ET ulazi u stanicu domaina endocitozom i poprima oblik veih ne-infektivnih ali metabolicki aktivnih retikulskih tjelesaca velicine do 1.5 µm (RT) unutar bujajue vakuole RT umnazaju se binarnom fisijom tvorei budua retikulska tjelesca ET i RT su Gram-negativni i posjeduju unutarnju i vanjsku membranu te promjenjiv periplazmatski prostor priblizno 20 sati nakon infekcije neka retikulska tjelesca unutar inkluzija pocinju se kondenzirati i sazrijevati u elementarna tjelesca openito se smatra da 40 sati nakon infekcije (kao posljedica lize stanice) pocinje otpustanje infektivnih ET (dijagnostika !!) prirodna stanista kod bolesti uzrokovanih klamidijama, perzistirajue (trajne) infekcije su pravilo a ne iznimka gastrointestinalni trakt (probavni sustav) je i u ptica i u sisavaca prirodno staniste vrste C. psittaci C. psittaci moze se u organizmu umnoziti sto rezultira dugotrajnim izlucivanjem fecesom elementarna tjelesca relativno su otporna i u okolisu ostaju, u prikladnim uvjetima, infektivnima nekoliko dana klamidije se sire aerosolom ili doticajem te nije potreban nikakav drugi vektor za njihovo sirenje

50

Bakterijske bolesti

Four mature elementary bodies surrounded by the envelope of the reticulate body that produced them. The bar represents 15 microns. Electron micrograph by M. E. Ward from: Ward, M. E. The chlamydial developmental cycle. In: Microbiology of Chlamydia, (Barron, A. L. ed). CRC Press, (1988).

Patogenost

· · s obzirom na domaina kod klamidija nije izrazena stroga specificnost - inficiraju oko 150 vrsta ptica, veliki broj sisavaca, a raste i broj sojeva izdvojenih iz bezkraljesnjaka usprkos sposobnosti vrste C. psittaci da uzrokuje mnostvo raznolikih sindroma bolesti, pri pojavi bolesti, odnosno nizu klinicki povezanih slucajeva, prevladava jedan klinicki sindrom, a stanje i zestina izrazenih znakova bolesti ovise o: (1) soju i njegovoj virulenciji: (2) ovo je osobito vazno u ovaca kod kojih je infekcija vrstom C. psittaci udruzena s inaparentnom infekcijom crijeva, pobacajem, konjunktivitisom, poliartritisom, upalom plua i orhitisom/epididimitisom (3) 2) dobi, spolu, fizioloskom statusu i zivotinjskoj vrsti (4) 3) putevima infekcije (ulazna vrata) i stupnju izlozenosti klamidijama (5) 4) uzgojnim i okolisnim uvjetima pobacaj kao posljedica infekcije vrstom C. psittaci opisan je u goveda, ovce i koze enzootski pobacaj ovaca (EPO) uzrokuje velike stete u intenzivnom uzgoju diljem svijeta, a infekcija se ponajprije siri u vrijeme janjenja ovce pobacuju u posljednja dva do tri tjedna gravidnosti a karakteristicne promjene nalaze se na placenti: difuzni nekrotizirajui placentitis u janjadi infekcija vrstom C. psittaci uzrokuje poliartritis MACKE! prvi soj C. psittaci izdvojen je iz macke koja je bolovala od pneumonije pa je stoga infekcija vrstom C. psittaci nazvana macji pneumonitis; nakon toga izdvojeno je mnostvo sojeva iz macaka s blagim znakovima upale disnog sustava i konjunktivitisom koji cesto samostalno nestaje ali se povremeno vraa s razmacima od 10 do 14 dana pobacaj u goveda moze biti uzrokovan vrstom C. psittaci a treba ga razluciti od pobacaja uzrokovanog bakterijama vrste Borrelia sp. osim pobacaja, infekcija vrstom C. psittaci u goveda moze uzrokovati i encefalomijelitis psitakoza (ornitoza) je akutna ili kronicna zarazna bolest domaih i divljih ptica a znakovi mogu biti izrazeni u disnom ili probavnom sustavu ili je infekcija opa bolest se pojavljuje posvuda a s ptica se prenosi na druge zivotinjske vrste i covjeka iscjedak iz disnog sustava i izmet su infektivni; u kliconosa, nakon preboljenja bolesti i nestanka vidljivih znakova, mogu se pod utjecajem "stresa" povratiti znakovi bolesti

· · · · ·

· · · · ·

51

Bakterijske bolesti

· ·

pojam "psitakoza" odnosi se na infekciju psitacida (ptice iz porodice psittacine), a "ornitoza" u svih ostalih vrsta ptica klinicki znakovi su podjednaki u svih ptica iako se u psitacida bolest cese pojavljuje u kronicnom obliku za razliku od ostalih vrsta ptica

Laboratorijska dijagnostika

Uzorci

Uzorci se uzimaju ovisno o vrsti (klinickim znakovima) bolesti (1) pobacaj (EPO): mikroskopska pretraga razmazaka kotiledona ili koriona 1. ako je placenta nedostupna, potrebno je pretraziti (mikroskopski) vaginalne obriske uzete 1-2 dana nakon pobacaja ili s povrsine pobacenog ploda 2. za izdvajanje klamidija prikladni su kotiledoni, vaginalni obrisci, plua i jetra fetusa pohranjeni u tekuoj transportnoj podlozi za klamidije (2) poliartritis: sinovijska tekuina (3) konjunktivitis: obrisak konjunktiva (4) opa infekcija: uzorci plua, jetre i slezene Za seroloske pretrage treba uzeti parne serume od bolesnih i klinicki zdravih zivotinja.

DOKAZIVANJE vrste CHLAMYDOPHILA PSITTACI a) izravna mikroskopija: ET u razmascima ili rezovima tkiva mozemo dokazati kemijskim postupcima bojenja ili imunokemijskim postupcima pr. imunofluorescencija ili imunoperoksidaza

Kemijski postupci bojenja: · modificirani Ziehl-Neelsen (MZN): ET nalaze se u nakupinama crveno obojena nasuprot plave pozadine (1) ako se preparati gledaju mikroskopom s tamnim vidnim poljem, ET svjetlo su zelene boje kokoidnog oblika bojenje metilenskim modrilom: ako se preparati gledaju mikroskopom s tamnim vidnim poljem, ET vide se kao refraktilna zuto-zelenkasta tjelesca postupak po Macchiavelliju - ET oboje se crveno nasuprot plave pozadine (okoline) postupak po Castanedi - ET oboje se plavo nasuprot crvenkaste pozadine bojenje po Giemsi prikladno je za dokaz klamidija u obriscima (strugotine) konjunktiva - macji pneumonitis - inficirani epitel konjunktive sadrzi bazofilne intracitoplazmatske nakupine vrste C. psittaci u obojenim razmascima vrste Brucella sp. i Coxiella burnetti (intracelularni paraziti) mogu nalikovati klamidijama, a razlikujemo ih imunoloskim postupcima bojenja, seroloski ili izdvajanjem-uzgoj

· · · · ·

b) ELISA-nije osobito prikladna-unakrizne reakcije

Izdvajanje i uzgoj

· · inokulacijom embrioniranih kokosjih jaja (6-7 dana starih) u zutanjcanu vreu brojne kulture stanica: McCoy, BHK-21, L929 i Vero

Serologija

(1) RVK (reakcija vezanja komplementa) (2) ELISA (3) posredna imunofluorescencija za dokaz antitijela Ovim testovima primarno dokazujemo antitijela za antitijela specificna za rod (lipopolisaharide). Openito to znaci da ne mozemo razlikovati sojeve koji se razlikuju u

52

Bakterijske bolesti

virulenciji, a takoer nastupaju i unakrizne reakcije s ostalim Gram-negativnim bakterijama sto dodatno otezava tumacenje rezultata i serolosku dijagnostiku

Identifikacija

1. Biokemijski, morfoloski i seroloski markeri elektroforezom u poliakrilamidnom gelu, analizom restrikcijskim endonukleazama kao i tipizacijom pomou monoklonalnih antitijela otkrivaju se mnoge nove vrste klamidija najpouzdaniji postupak za razlikovanje vrsta Chlamydia i Chlamydophila je sekvencioniranje DNK (DNAsequencing)

Porodica i vrste unutar reda Chlamydiales

Vrsta Chlamydia domain covjek C. trachomatis izdvojena samo iz ljudi a sadrzi dva biovara: trachoma (14 serovarova) i limfogranuloma venerum ( 4 serovara) Klinicko stanje ocne smetnje a) trahom b) inkluzioni konjunktivitis novoroenih spolni sustav a) ne-gonokokni uretritis b) salpingitis c) cervicitis d) epididimitis respiratorne bolesti djece proktitis Lymphogranuloma venereum artritis konjunktivitis enteritis pneumonija asimptomatska infekcija najcese!! asimptomatska infekcija ili ponekada pneumonija u misa

C. suis ( prije C. trachomatis)

svinja

C. muridarum ( prije C. trachomatis)

mis, hrcak

A chlamydial inclusion 15 hours post infection containing many reticulate bodies (RB) of C. trachomatis LGV 404. Note the endosome membrane (em) and the blebs of membranous material (mb) in the inclusion, probably derived from the reticulate body outer envelope. Chlamydial lipopolysaccharide, exported from reticulate body inclusions, is the basis of some of the enzyme immunoassay tests for the diagnosis of chlamydial infection by the detection of chlamydial antigen. The bar represents 1 micron. Electron micrograph by M. E. Ward, as above.

53

Bakterijske bolesti

Porodica i vrste unutar reda Chlamydiales

Vrsta Chlamydophila C. psittaci domain covjek (zoonoza) sisavci klinicko stanje psitakoza (ornitoza) pobacaj konjunktivitis crijevne infekcije i proljev gastritis pneumonija pobacaj pr.: enzootski pobacaj ovaca, klamidijski pobacaj u goveda inf. spolnog sustava mastitis poliartritis/poliserositis encefalomijelitis pr.: sporadicni encefalomijelitis goveda hepatitis konjunktivitis, pr.: macji pneumonitis pneumonija i upala zracnih vreica perikarditis encefalitis konjunktivitis

C. psittaci

C. psittaci (8 serovarova) primarno inficira ptice a bolest je cesto opa (ali i inaparentna!) s jako izrazenim znakovima bolesti akutnog ili kronicnog tijeka i povremeno izlucivanje uzrocnika

ptice crijevne infekcije i proljev

prenosi se i transovarijalno (zarazena jaja)

54

Bakterijske bolesti

Patogeneza

Chlamydia trachomatis zdrijelo, oko, rektum, gentitalije + + covjek oko, spolni org., zglobovi, prostata, plua novoroencadi + svinja oko, crijeva, plua suis zdrijelo muridarum zdrijelo, gentitalije + + mis, hrcak genitalni org., crijeva, jetra, plua, bubrezi, slezena

mjesto ulaska diseminacija u krvotoku trajna prisutnost u domainu bez izrazenih znakova bolesti uobicajeni domain(i) zarazena tkiva

Patogeneza 2 Chlamydophila psittaci pneumoniae mjesto ulaska diseminacija u krvotoku trajna prisutnost u domainu bez izrazenih znakova bolesti uobicajeni domain(i) zdrijelo, oko, spolni org. + zdrijelo, oko +

pecorum usta +

felis zdrijelo, oko, spolni org. +

caviae zdrijelo, oko, spolni org.

abortus usta, spolni org. +

+

+

+

+

ptice

covjek, koala, konj

zarazena tkiva

mozak, oko, spolni org., crijeva, jetra, plua, slezena

arterije, mozak, zglobovi, plua

govedo, ovca, koza, svinja, koala mokrani mjehur, mozak, oko, crijeva, limfni c., zglobovi, prostata

kuna macka

zamorci

ovca, ostali sisavci

oko, spolni org., zglobovi plua

m.mjehur, oko, spolni org., plua

crijeva, posteljica, slezena, jetra novoroence -ta

55

Bakterijske bolesti

BAKTERIJSKA VRSTA LISTERIA

· · srednje veliki, Gram-pozitivni stapii 0.5-2 x 0.4-0.5 µm, ne tvori spore pojedinacne bakt. stanice listerije iz brzorastuih kolonija ili iz stanicnih ili tkivnih kultura mogu biti kokoidna oblika listerije su aerobne, fakultativno anaerobne bakterije iz roda Listeria podijeljene su u sedam vrsta s dvije razlicite skupine: Listeria murrayi i L. grayi su nehemoliticne, rijetko se izdvajaju i smatraju se nepatogenima L. monocytogenes i L. ivanovii su hemoliticne i patogene za zivotinje a L. monocytogenes patogena je i za covjeka L. monocytogenes i L. ivanovii vrlo su slicne s L. seeligeri (apatogena i hemoliticna), L. inocua i L. welshimeri (apatogena)

· · · ·

Listeria monocytogenes

·

Laboratorijska dijagnostika

Materijal koji se uzima (salje) za pretragu visceralni oblik bolesti: lezije u jetri, bubrezima ili slezeni zivcani oblik bolesti: spinalna tekuina, mozdano deblo, tkivo produzene mozdine uzeto s razlicitih mjesta · pobacaj: placenta (kotiledoni), sadrzaj abomasusa fetusa i/ili iscjedak iz uterusa Izravni mikroskopski preparat - ne daju zeljenu sliku; pregled histoloskih preparata tkiva mozga-presumptivna dijagnoza zivcanog oblika listerioze Izdvajanje - krvni agar (ovcja ili govea krv), selektivna hranjiva podloga s ili bez antibiotika i selektivna hranjiva podloga za izdvajanje listerija iz hrane za ljude Identifikacija - L. monocytogenes i L. seeligeri (apatogena) uska zona beta-hemolize ispod samih kolonija Izgled kolonija - male prozirne kolonije glatkih rubova, nakon 48 sati kolonije promjera 0.5-2 mm, sivkasto-bijele Mikroskopski preparat - kratki Gram-pozitivni stapii ili kokobacili PRAKTICNI RAD: BOJENJE PRIPREMLJENIH RAZMAZAKA PO GRAMU · · · · · · · · · Biokemijski testovi Bioloski pokus testovi za presumptivnu dijagnostiku L. monocytogenes male beta-hemoliticne kolonije nakon 24 sata inkub. kratki, Gram-pozitivni stapii s brojnim kokobacilarnim oblicima katalaza-pozitivni (beta-hemoliticni streptokoki i E. rhusiopathiae katalaza-negativni) hidroliza eskulina pokretne (visea kap) u 2-4 sata staroj bujonskoj kulturi rast u polucvrstoj podlozi: poput otvorenog kisobrana · ·

56

Bakterijske bolesti

· ·

CAMP test pozitivan sa S. aureus; tvorba kiseline iz ramnoze ne iz ksiloze

57

Bakterijske bolesti

BAKTERIJE RODA LISTERIA

Najcese se ocituje encefalitisom, pobacajem, septikemijom a znatno rjee mastitisom, spinalnim mijelitisom ili keratokonjunktivitisom. Listerioza se u zivotinja pojavljuje uglavnom u zemljama na sjevernijim i juznijim zemljopisnim sirinama, a znatno rjee u tropskim i suptropskim podrucjima. Bolest je aktualna u Europi i u nas, kako u ljudi tako i zivotinja.

ROD LISTERIA

Klasifikacija Nekada je bakterija L. monocytogenes bila jedina vrsta unutar roda Listeria, a danas taj rod obuhvaa i vrste L. ivanovii, L. inocua, L. welshimeri i L. seeligeri. S obzirom na rezultate fenotipskih i genotipskih istrazivanja dvojbeno je trebaju li vrste L. murrayi i L. grayi uope pripadati rodu Listeria. Vrsta Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) glavni je uzrocnik listerioze zivotinja, a ostale se vrste, osim L. ivanovii, za sada, smatraju apatogenima. Prosirenost i tenacitet Bakterijska vrsta Listeria monocytogenes vrlo je rasprostranjena u prirodi i moze se izdvojiti iz tla, biljaka, trule vegetacije i silaze (osobito povrsinskog sloja-aerobni uvjeti!), a njezine osobitosti omoguuju joj prezivljavanje i razmnozavanje u prirodi u najrazlicitijim uvjetima. Covjek i brojne zivotinjske vrste cesti su asimptomatski nosioci ove bakterije koju izlucuju izmetinama. Vrsta L. monocytogenes moze se izlucivati i mlijekom goveda. Iako je optimalna temperatura potrebna za rast listerije izmeu 300 C i 370 C, ta bakterija moze rasti i razmnozavati se pri temperaturi - 40 C do 450 C. Takoer se moze razmnozavati pri pH vrijednostima 4.5 do 9.6, a u izmetinama moze prezivjeti nekoliko godina. Morfologija Murray i suradnici 1926. te Pirie 1927. godine prvi su opisali L. monocytogenes kao male, gram-pozitivne stapiaste bakterije, 1-2 µm duge i 0.5 µm siroke, cesto poredane usporedno, u tzv. palisadama (kao letve na plotu ili kineska slova).

Uzgojne osobine Vrsta L. monocytogenes raste na uobicajenim hranjivim podlogama s dodatkom krvi u aerobnim uvjetima pri 37° C. Za izdvajanje listerija iz materijala onecisenog bakterijama, npr. izmetina, koristi se selektivna hranjiva podloga (sadrzi antibiotike i odreene spojeve koji koce rast potencijalnih zagacivackih bakterija). Slican se ucinak postize tzv. hladnim obogaivanjem materijala visetjednim drzanjem nacijepljenih tekuih hranjivih podloga pri 40 °C.

58

Bakterijske bolesti

Nakon 24 sata inkubacije porasle kolonije su male, glatke i neznatno spljostene, karakteristicnog plavicastog sjaja, ako se promatraju pod kosim prolaznim svjetlom. Uzgojena pri temperaturi 37 0C nije pokretna, dok se uzgojena pri 20 do 25 0C giba karakteristicno, vrtei se i prevrui se zbog mnostva peritrihih flagela. Razlicite vrste unutar roda razlikujemo odreivanjem biokemijskih osobina, a dostupan je i tzv. brzi test-API Listeria, koji ukljucuje odreivanje 10 najvaznijih biokemijskih osobina. U rutinskoj dijagnostici odreivanje hemolize vazno je za razlikovanje vrsta toga roda jer su osim L. monocytogenes, hemoliticne su samo L. ivanovii i L. seeligeri. Lijevo: L. monocytogenes; Desno: L. ivanovii Hemoliza vrste L. monocytogenes moze se pojacati u prisutnosti bakterije Staphylococcus aureus - CAMP fenomen sto koristimo pri dijagnostici ove bakterije. CAMP test s vrstom Staphylococcus aureus: ucinak stafilokokne beta-hemolize pojacan u prisutnosti L. monocytogenes

POSTUPCI TIPIZACIJE SOJEVA

Serotipizacija Serotipizacija sojeva listerije u samim pocecima izvoena je postupkom aglutinacije, a kasnije i reakcijom vezanja komplementa. Seeliger je 1939. i 1940. godine dokazao postojanje somatskih "O" i flagelarnih "H" antigena opisavsi cetiri seroloska tipa. Danas je ope prihvaena shema serotipizacije prema Seeliger/Donker-Voet-u koja obuhvaa 16 razlicitih serovarova roda Listeria. Podjela na serovarove ne podudara se s podjelom na vrste, pa pojedini sojevi razlicitih vrsta mogu pripadati istom serovaru. Serotipizacija ima nekoliko znacajnih nedostataka, pa se stoga u epidemioloskim istrazivanjima rabe dodatni postupci tipizacije npr. ELISA.

Serovarovi roda Listeria prema Seeliger i Jones (1986)

Oznaka Paterson

1

O antigeni

H antigeni

Seeliger-Donker-Voet

1/2a 1/2b I II (III)a I II (III) I II (III) II (III) IV II (III) IV (XII XIII) II (III) IV (XII XIII) (III) (V) VII IX (III) V VI VII IX X (III) V VI (III) V VII (III) V VI VIII (III) V VI (VIII IX) (III) (V) VI (VIII) X (III) XII XIII AB ABC BD AB ABC BD ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC

2 3

1/2c 3a 3b 3c

4

4a 4ab 4b 4c 4d 4e 5 7

59

Bakterijske bolesti

6a (4f) 6c (4g)

(III) V (VI VII) (IX) XV (III) (V VI VII) IX X XI

ABC ABC

Fagotipizacija · Kao postupak tipizacije ova je metoda reproducibilna i upuuje na izvor zaraze, a nedostaci su joj sto se samo mali postotak sojeva moze tipizirati unutar seroloske grupe 1/2 te nedostatak referentnih bakteriofaga za rjee zastupljene serovarove. Multilokusna enzimska elektroforeza (engl. multilocus enzyme electrophoresis) Ovaj slozeni postupak oblik je izoenzimske tipizacije pomou koje je mogue razlikovanje tzv. elektroforetskih tipova i odreivanje njihove genetske povezanosti. Istrazivanja genoma izravnom analizom urodila su primjenom nekoliko razlicitih postupaka u tipizaciji ove bakterijske vrste. analiza s pomou restrikcijskih enzima (engl. restriction enzyme analysis) Ovaj se postupak rabi za odreivanje osobina i razlikovanje sojeva L. monocytogenes pri masovnoj pojavi bolesti. Rezultati analize sojeva izdvojenih iz ljudi pri masovnijim pojavama listerioze pomou restrikcijskih enzima pokazali su da su izdvojeni sojevi imali ujednacen "restrikcijskoenzimski" uzorak (engl restriction enzyme pattern). elektroforeza u gelu u pulsirajuem polju (engl. pulsed-field gel electrophoresis) o Ovim kompliciranim postupkom razlucuju se manji i vei odsjecci DNK, koje je, tako pripravljene, vrlo jednostavno identificirati. To je ujedno i najpouzdaniji postupak tipizacije.

· · · · · ·

·

ODREDNICE VIRULENCIJE BAKTERIJE LISTERIA monocytogenes

Vrsta L. monocytogenes moze se razmnozavati unutar stanica mononuklearno fagocitnog sustava (monociti/makrofagi) i ubraja se u fakultativne intracelularne parazitske bakterije. Sposobna je prodrijeti u njih, osloboditi se iz fagosoma, razmnozavati u citoplazmi i inficirati okolne stanice. Od osobite je vaznosti za virulenciju vrste L. monocytogenes njezina sposobnost liziranja membrane fagosoma, unutar makrofaga, sto joj omoguuje hemolizin listeriolizin O (slican steptokoknom streptolizinu). Time listerija izbjegava mogunost da je makrofag lizira. Takoer je poznata i veina ostalih cimbenika virulencije koji su na odreeni nacin povezani s prezivljavanjem listerije u domainu ili u njemu pomazu. Veina gena odgovorna za spomenute osobine, smjestena je u blizini gena za hemolizu (listeriolizin O) tvorei tako skupinu gena odgovornih za virulenciju koju nalazimo i u ostalih hemoliticnih bakterija vrste Listeria.

60

Bakterijske bolesti

IMUNOST S obzirom na to da je listerija fakultativno intracelularna parazitska bakterija ona potice stanicnu imunosnu reakciju. Ona se ocituje nastajanjem populacije T-limfocita, koji mogu razoriti stanicu inficiranu listerijama i izlucenim citokinima osposobiti makrofage da djelotvornije ubijaju listerije. Humoralna antitijela stvaraju se povremeno, a uope se ne stvaraju kod listerijskog encefalitisa sto otezava serolosku dijagnostiku ove bolesti.

LISTERIOZA U ZIVOTINJA

Bakterijsku vrstu L. monocytogenes prvi su izdvojili Murray i suradnici 1926. godine iz laboratorijskih kunia i zamorcadi. Danas je listerioza ustanovljena u vise od 40 vrsta domaih i divljih zivotinja, a rasprostranjena je po svim kontinentima. U veterinarskoj medicini listerioza ima najvee znacenje u goveda, ovaca i koza, a spomenuti redoslijed pojavljivanja s obzirom na zivotinjsku vrstu, ovisi o pojedinoj zemlji, pa je primjerice u Velikoj Britaniji listerioza najucestalija u ovaca, dok za Hrvatsku jos uvijek nemamo pouzdanih epizotioloskih podataka. Listeriozu prate raznoliki i brojni klinicki znakovi a najznacajniji su encefalitis i infekcije uterusa (pobacaj). U pravilu, listerioza se u jednoj skupini zivotinja najcese ocituje ujednacenom klinickom slikom, a pojavljivanje razlicitih znakova bolesti unutar istog zarazenog stada smatra se rijetkom pojavom. Encefalitis Encefalitis u ovaca kao posljedicu infekcije listerijom prvi je opisao Gill 1931 godine. Bolest s izrazenim neuroloskim poremeajima u ovaca bila je poznata i pod nazivom "circling disease" (bolest kruzenja). Isti je autor 1933. godine iz promjena u mozgu ovce izdvojio bakteriju L. monocytogenes koja je potom izdvojena iz mozga ovaca, koza i goveda diljem svijeta. Klinicki znakovi koji prate infekciju listerijom posljedica su osteenja mozdanog debla, te iako postoje pojedinacna odstupanja, najcese su zastupljeni: - tromost, okretanje i svijanje glave na jednu stranu te hodanje u krug. Jednostrana paraliza facijalnog zivca uzrokuje spustanje ocnog kapka i uske, a zbog djelomicne paralize zdrijela zivotinja pretjerano slini. Ovce i koze legnu i uginu nakon dva do tri dana, a u goveda bolest obicno potraje nesto dulje. Ovisno o stadiju bolesti, rektalna temperatura moze imati normalnu vrijednost ili je povisena. Vrijeme inkubacije je razlicito, a podaci dobiveni u pokusnim infekcijama kao i prikupljeni epizootioloski podaci (prirodne infekcije, epizootije) upuuju da najvjerojatnije iznosi dva do sest tjedana. Razudbom su makroskopske promjene na mozgu rijetko uocljive. Patohistoloskom pretragom uocavaju se promjene smjestene jednostrano, a najjaca osteenja nalaze se u produzenoj mozdini i ponsu. Osteenja u cerebelumu, vratnom dijelu kicmene mozdine i diencefalonu znatno su rijee prisutna i slabije izrazena. Tipicne patohistoloske promjene ocituju se nakupljanjem upalnih stanica i nalazom perivaskularnih nakupina sastavljenim prvenstveno od limfocita sa histiocitima, plazmastanicama i povremeno neutrofilima. Ako su osteenja brojna mogu se spojiti i zahvatiti vei dio mozdanog tkiva. Zivcani oblik listerioze: mozak ovce: perivaskularne nakupine u meduli

61

Bakterijske bolesti

Cesto prisutan meningitis sekundaran je u odnosu na osteenja parenhima, a ependim i korioidni pleksus rijetko su zahvaeni promjenama. Kada je rijec o infekciji vrstom L. monocytogenes koja se klinicki ocituje encefalitisom, ta se bakterija uvijek i iskljucivo moze izdvojiti jedino iz mozga. Istrazivanja patogeneze encefalitisa kao oblika listerioze zapoceo je Gill 1931. godine i usprkos razlicitim pokusima provedenim u brojnim znanstvenim istrazivanjima jos uvijek nisu pronaeni dokazi da L. monocytogenes ocituje tropizam prema zivcanim stanicama, a takoer je nejasno moze li listerija dospjeti u mozak centripetalno, duz kranijalnih zivaca. Iako su brojni autori u pokusnim infekcijama aplicirali L. monocytogenes u zubnu pulpu, nervus facialis odnosno n. trigeminus ovaca, nisu prikupljeni dokazi da listerija dospjeva u mozak putujui duz spomenutih zivaca, a nije iskljucena niti mogunost hematogenog sirenja. Patogeneza listerioze, a osobito listerijskog encefalitisa, jos je uvijek velikim dijelom nepoznata, nerazjasnjena. Pobacaj Listerijski pobacaj uzrokovan vrstom L. monocytogenes, osim u ovaca, javlja se i u drugih zivotinja, primjerice goveda i koza, a vrlo rijetko u svinja. Zarazene krave najcese pobacuju u posljednjoj treini gravidnosti, ili rode mrtvu telad. Ovce i koze pobacuju nakon 12-tog tjedna gravidnosti uz ucestalo zaostajanje posteljice, a iz rodnice se tjekom nekoliko dana cijedi krvavi iscjedak. Listerijski pobacaj uzrokovan vrstom L. ivanovii zabiljezen je u nekoliko pojedinacnih nalaza u goveda, a klinicki ga je nemogue razlikovati od pobacaja uzrokovanog vrstom L. monocytogenes. Osteenja na posteljici ocituju se kao tockasta nekroticna podrucja zukaste boje na vrhovima resica kotiledona, uz lokalni ili difuzni interkotiledonarni placentitis, a placenta je pokrivena crveno-smeim eksudatom. L. monocytogenes: razmazak tkiva posteljice - obojeno Gramovim postupkom Pobaceni plod je vrlo cesto autolitican, a na slezeni i jetri ponekad su vidljiva submilijarna nekroticna zarista. Histoloskom pretragom spomenutih promjena u jetri i slezeni uocava se koagulacijska nekroza i infiltracija makrofagima i neutrofilima. Bakterioloskom pretragom vrlo se cesto iz posteljice, odnosno pobacenog ploda izdvoji bakterija L. monocytogenes. S obzirom na rezultate pokusnih infekcija vrlo je vjerojatno da se plod inficira listerijom hematogenim putem kroz posteljicu. Septikemija Septikemijski oblik listerioze relativno je rijedak, a prisutan je poglavito u novoroenih zivotinja kao posljedica infekcije tijekom intrauterinog razvoja. Najcese zastupljene promjene su zarisna nekroza jetre na kojoj se jasno vide tockasti, sivkasto-bijeli cvorii. Iste se promjene uocavaju na slezeni a vrlo rijetko na ostalim organima (slicno kao i u pokusnoj infekciji) Eksperimentalna listerioza u misa. Jetra: brojna, sitna nekroticna zarista; slezena: citava slezena obuhvaena promjenama, brojna nekroticna zarista Listeriju mozemo jednostavno dokazati pripremom mikroskopskih preparata iz spomenutih cvoria i uzgojem na hranjivoj podlozi. Dijagnostika septikemijskog oblika listerioze temelji se na izdvajanju bakterije iz tkiva bolesnih zivotinja. U odraslih ovaca septikemijski oblik listerioze moze pratiti jaki nekroticni enteritis, obilna krvarenja i nekroze nabora sirista i apscesi Peyerovih ploca. Ostala klinicka ocitovanja listerioze U ovaca i koza zabiljezen je jednostrani iritis i keratokonjunktivitis koji se obicno javlja zimi u zivotinja hranjenih silazom.

62

Bakterijske bolesti

Openito se moze rei da su rezultati lijecenja slabi, osim ako se zapocne u ranom stupnju bolesti kombinacijom antibiotika i kortikosteroida. Takoer je zabiljezeno i nekoliko slucajeva mastitisa kod kojih je lijecenje bilo neuspjesno, a listerija je mlijekom izlucivana vrlo dugo. Listerioza u monogastricnih zivotinja je znatno rijea, primjerice javlja se u konja i svinja, a ocituje se septikemijom i meningoencefalitisom. Listerioza je u dokazana u laboratorijskih zivotinja-kunia i stakora, a u nas izdvojena je i iz jetre uginulih cincila (vlastiti neobjavljeni podaci).

ODNOS LISTERIJE PREMA ANTIMIKROBNIM PRIPRAVCIMA, LIJECENJE I IMUNOPROFILAKSA

Nacelno je poznato da je listerija u in vitro uvjetima osjetljiva prema svim uobicajenim antibioticima, osim prema cefalosporinima. Meutim, u uvjetima in vivo ishod lijecenja je dvojben, poglavito stoga sto je rijec o intracelularnoj parazitskoj bakteriji. U pokusnim uvjetima najdjelotvorniji su bili ampicilin i amoksicilin, dok se lijecenje tetraciklinom i klorampenikolom ne preporucuje, a zabiljezena je i otpornost ove bakterije prema eritromicinu, streptomicinu, tetraciklinu i kloramfenikolu. Lijecenje encefacitisa uglavnom je neuspjesno, a preporuca se kombinacija ampicilina ili amoksicilina i gentamicina u visokim dozama dulje vrijeme. Veina pokusaja da se proizvede ucinkovito cjepivo nije urodila plodom, tako da se openito moze rei da imunoprofilaksa ne postoji.

63

Bakterijske bolesti

Pseudomonas aeruginosa

Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei

Bakterije vrste Pseudomonas i Burkholderia srednje su veliki (0.5-1.0 x 1.5-5µ) gram-negativni stapii, strogi aerobi, oksidaza i katalaza-pozitivni; veina vrsta je pokretna, osim vrste Burkholderia (Pseudomonas) mallei. Neke vrste tvore topljive pigmente. Prirodna stanista · brojne vrste ovoga roda gotovo su iskljucivo saprofitske bakterije ukljucivsi i dvije vrste patogene za zivotinje: P. aeruginosa i B. pseudomallei; rezervoari vrste B. mallei su kopitari vrste P. aeruginosa i B. pseudomallei prisutne su u vodi i tlu P. aeruginosa po cijelom svijetu, a B. pseudomallei pretezito u tropskim krajevima vrsta P. aeruginosa takoer se nalazi na kozi, mukoznim membranama i izmetu zivotinja

Pseudomonas aeruginosa.

· ·

Patogeneza

· vrsta P. aeruginosa tvori egzotoksine, pr. enterotoksin koji je odgovoran za proljev tijekom pocetne infekcije, endotoksin i brojne izvanstanicne proizvode pr. proteaze i hemolizine koji imaju znacenje u patogenezi vrsta P. aeruginosa posjeduje pile (fimbrije) koje olaksavaju prijanjanje na epitelne stanice, a neki sojevi posjeduju kapsulu koja djeluje antifagocitno (!) bakteriocini (piocini) i pigmenti imaju antimikrobno djelovanje vrsta P. aeruginosa je oportunisticka bakterija i rijetko kada je primarni uzrocnik neke bolesti predisponirajui (pogodovni) cimbenici su osteenja tkiva (rane i opekline), oslabljenost zbog malignih procesa ili imunodeficijencije, redukcija uobicajene (fizioloske, normalne) mikroflore zbog terapije antibioticima. Vrsta P. aeruginosa REZISTENTNA JE PREMA VEINI ANTIBIOTIKA koje rabimo u veterinarskoj praksi neke tipicne bolesti uzrokovane oportunistickom bakterijom P. aeruginosa: 1. prostatitis, cistitis, dermatitis, infekcija vanjskog slusnog kanala psa 2. mastitis i pobacaj u goveda 3. pneumonija u cincila i nutrija (pri farmskom uzgoju) 4. pobacaj u kobila 5. septikemija u zdrebadi 6. infekcije rana u svih zivotinja (opekotina u covjeka)

·

· · ·

·

64

Bakterijske bolesti

Virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa has both cell-associated (flagellum, pilus, nonpilus adhesins, alginate/biofilm, lipopolysaccharide [LPS]) and extracellular virulence factors (proteases, hemolysins, exotoxin A, exoenzyme S, pyocyanin).

· ·

· · ·

vrsta B. pseudomallei uzrocnik je bolesti melioidoze, a pojavljuje se prvenstveno u tropskim podrucjima jugoistocne Azije, a ima je u i Europi (neki dijelovi Francuske) i Australiji bolest je obicno opa, a znakovi ovise o rasprostranjenosti i raspodijeli osteenja: cvorii koji mogu postati gnojni, a mogu se nalaziti u bilo kojem tkivu ukljucujui i mozdano (mozak) (blage do smrtonosne infekcije plua u ljudi; u zivotinja brojni kronicni apscesi: macke, psi, koze, ovce, konji i dupini vrsta B. mallei uzrokuje bolest u kopitara poznatu pod imenom maleus ili sakagija (eng. Glanders) na infekciju ovom bakterijom prijemljivi su covjek i pripadnici porodice macaka; psi, koze, ovce i deve mogu se inficirati samo slucajno; goveda, svinje, stakori i ptice otporni su prema infekciji zaraza se prenosi s inficiranih zivotinja putem zagaene hrane i vode, a rijee aerosolom ili infekcijom rana (detaljnije-tablica)

laboratorijska dijagnostika

vrsta B. mallei i vrsta B. pseudomallei vrlo su opasne te se njihova dijagnostika obavlja u posebno opremljenim laboratorijima · uzimanje uzoraka za pretragu ovisi o izrazenim klinickim znakovima Izravna mikroskopija nije od dijagnosticke vrijednosti, osim izravne imunofluorescencije kada je rijec o vrstama B. mallei i B. pseudomallei · izdvajanje · rastu na uobicajenim podlogama, selektivna podloga za izdvajanje vrste B. mallei · inkubacija traje 24-48 sati pri 370 C Identifikacija Morfologija kolonija · P. aeruginosa: velike kolonije (3-4 mm), plosnate, sivkasto-plave s karakteristicnim mirisom (aminoacetofenon); na krvnom agaru veina sojeva tvori zonu potpune hemolize (1) piocijanin, plavkasti pigment jedinstven je za ovu vrstu (2) kolonije variraju od S-oblika (meke i sjajne) do R-oblika (suhe i zrnate) (3) neki sojevi imaju metalni odsjaj · ·

65

Bakterijske bolesti

· B. pseudomallei: rast kolonija varira od glatkih i sluzavih do grubih s mutnom, naboranom (smezuranom) povrsinom -vidi sliku na foliji (1) S-oblik: kolonije su okrugle, malo izbocene, sjajne sivkastozute boje, nakon nekoliko dana postanu neprozirne, zukastosmee i ispupcene -vidi sliku na foliji uz karakteristican smrad po zemlji ili pljesnivoi (2) na krvnom agaru (ovcja krv) ocituje se djelomicna a zatim potpuna liza

B. pseudomallei on Ashdown agar Professor NJ White, Wellcome-Trust-Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Programme, Bangkok, Thailand

B. pseudomallei on blood agar Professor NJ White, Wellcome-Trust-Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Programme, Bangkok, Thailand

· B. mallei: raste sporije od P. aeruginosa i B. pseudomallei, no nakon 24 do 48 sati inkubacije kolonije su promjera 1-2 mm, glatke, bijele do krem boje; starije kulture postaju zrnate i zukaste ili smee boje

Pigmenti vrste P. aeruginosa

· · · sojevi ove bakterijske vrste tvore u vodi topljive pigmente: piocijanin (plavozeleni), pioverdin (zuti), piorubin (crveni) i piomelanin (tamnosmei) -vidi sliku na foliji i epruvete na katedri! neki sojevi proizvode sva cetiri pigmenta ili variraju u kombinacijama i kolicini; pigmente piorubin (crveni) i piomelanin (tamnosmei) tvore najrjee, a najbolje se vide ako soj nasadimo na polucvrsti agar i pohranimo pri sobnoj tmp. (nakon 2 tjedna)

66

Bakterijske bolesti

piocijanin, plavkasti pigment jedinstven za ovu vrstu znacajan je u dijagnostici ove bakterijske vrste (podloga po Mueller Hintonu sluzi za dokazivanje tvorbe pigmenata kao i neke specijalne podloge) Mikroskopski izgled · · Svi pseudomonasi su srednje veliki gram-negativni stapii Biokemijske osobine izgled kolonija, tvorba pigmenata, miris i jaka reakcija oksidaze (ostale vrste Enterobacteriaceae su oksidaza-negativne) dovoljni su za vjerojatnu dijagnozu · Komercijalni sistemi za identifikaciju API 20E Imunoloski postupci · melioidoza (B. pseudomallei): RVK, indirektna hemaglutinacija, meutim dijagnozu melioidoze treba temeljiti vise na izdvajanju uzrocnika nego li na klinickim znakovima i seroloskim postupcima · · maleus-sakagija (B. mallei): imunost je stanicna i humoralna: RVK, aglutinacija, indirektna hemaglutinacija (humoralna), za dokaz stanicne imunosti: maleinski test preosjetljivosti: ukapavanje maleina (glikoprotein ekstrahiran iz bakterije) u konjunktivalnu vreu (ocni test) uzrokuje u slijedeih 6-12 sati gnojnu upalu oka vrsta domain bolest mastitis, inf. uterusa, koze, apscesi, enteritis, P. aeruginosa govedo artritis ovca, koza svinja konji pas, macka nutrija cincila reptili mnostvo ziv. vrsta mnostvo ziv. vrsta konj govedo ovca koza svinja pas mastitis, pneumonija, apscesi u pluima, "zelena vuna" (inf. koze) enteritis, respiratorne inf., otitis metritis, apscesi u pluima, inf. oka otitis externa, cistitis, endokarditis, ermatitis,, konjunktivitis, inf. rana septikemija, pneumonija opa infekcija praena konjunktivitisom, otitisom, pneumonijom, enteritisom i inf. spolnih organa nekroticni stomatitis ili nekroze na drugim mjestima osobito u zmija drzanih u kavezu inf. rana ili opeklina, proljev, inf. spolnih organa melioidoza bolest slicna maleusu (sakagija) akut. ili kron. oblik s lokalizacijom na pluima, zglobovima ili uterusu prevladava artritis i limfangitis gubitak kondicije, poremetnje disnog i zivcanog sustava, artritis, mastitis kao koza+proljev i pobacaj bolest praena pov. tjel. temp. i sokalizacija gnojnih cvoria maleus: akutni tijek s visokom temp., mukopurulentnim iscjetkom iz nosa, disne poremetnje, septikemija i uginue nakon 2 tj. kronicni tijek: pluni oblik: mali cvorii u pluima ciji se sadrzaj (P. pmallei) prazni u bronhiole kozni oblik: "Farcy" limfangitis i ulceracije uzduz limfnih zila udova i prsa, ulceracije ostavljaju oziljke zvjezdolika oblika akutna, septikemijska bolest ·

·

B. pseudomallei

konji i ostali ekvidi B. pmallei covjek, macka i ostale zivotinje

67

Bakterijske bolesti

68

Bakterijske bolesti

Rikecije

·

[napisao prof. dr. Tomo Nagli, modificirala doc. dr. Seol] cine posebnu skupinu mikroorganizama koji su u sirem smislu uvrsteni u bakterije, iako se od veine njih razlikuju po mnogim osobinama · Rikecije su stapicasta ili kokoidna oblika, najcese pleomorfni, promjera 0.3-0.5 µm, i dugacke 0.8-2 µm · Gramovim postupkom boje se gram-negativno, ali openito se slabo oboje anilinskim bojama · Jace se oboje Giemsinim postupkom, prema Machiavellu ili Giemenezu · U tkivu se mogu dokazati bojenjem akridin-oranzom i imunofluorescencijom · Neke rikecija posjeduju, poput ostalih bakterija, stanicnu stijenku koja sadrzava muraminsku kiselinu, dok ostale imaju samo stanicne ovojnice bez stanicne stijenke · Kao obligatni unutarstanicni paraziti koji se ne mogu uzgojiti na umjetnim hranjivim podlogama, jedno su vrijeme drzane virusima, ili prijelaznim oblicima izmeu virusa i bakterija · Osjetljivost prema antibioticima, posjedovanje oba tipa nukleinske kiseline (RNK i DNK) i vlastiti metabolizam razlog su zbog kojeg su rikecije uvrstene u zasebni bakterijski red · U epizootiolosko-epidemioloskom smislu vazan je podatak da su rikecije zapravo paraziti clankonozaca, koji imaju vaznu ulogu u prijenosu rikecija i sirenju rikecioza kao meudomaini · Za veinu rikecija patogenih za zivotinje vektori su krpelji, a za ljude to su usi i buhe · Prosirenost rikecioza povezana je sa zemljopisnom rasprostranjenosu clankonozaca · Rikecije se razmnozavaju iskljucivo binarnom diobom · Pojedine se vrste mogu uzgojiti u laboratorijskim uvjetima u kokosjim zamecima ili stanicnim kulturama, dok se druge ne mogu uzgojiti izvan zivog organizma · Rikecije pretezno prenose clankonosci koji sisu krv (krpelji, buhe, usi, grinje), a kao rezervoari im sluze glodavci (stakori, misevi, divlji glodavci) · Neke rikecije opstoje u insektima kao simbionti koji utjecu na razvoj i razmnozavanje domaina · U prirodi, izvan organizma, slabo se otporne na nepovoljne uvjete Klasifikacija Usporedo s razvojem mikrobiologije i stjecanjem novih spoznaja o rikecijama, mijenjao se i nacin njihove klasifikacije · Prema suvremenoj klasifikaciji rikecije su uvrstene u razred Alphaproteobacteria, red Rickettsiales koji se dijeli u dvije porodice: Rickettsiaceae i Ehrlichiaceae. II. Red Rickettsiales ­ rikecije 1. Porodica Rickettsiaceae 1.1. Rod Rickettsia 1.1.1. Rickettsia prowazekii 1.1.2. Rickettsia typhi 1.1.3. Rickettsia rickettsii 1.1.4. Rickettsia conori 1.1.5. Rickettsia (Orientia) tsutsugamushi 2. Porodica Ehrlichiaceae 2.1. Rod Ehrlichia 2.1.1. Ehrlichia canis 2.1.2. Ehrlichia equi 2.1.3. Ehrlichia ewingii 2.1.4. «Ehrlichia ondiri» 2.1.5. Ehrlichia phagocytophila 2.1.6. Ehrlichia platys 2.1.7. Ehrlichia risticii ·

69

Bakterijske bolesti

2.1.8. «Ehrlichia bovis» i «Ehrlichia ovina» 2.1.9. Ehrlichia sennetsu 2.2. Rod Aegyptianella 2.3. Rod Anaplasma 2.4. Rod Cowdria 2.4.1. Cowdria ruminantium 2.5. Rod Neorickettsia 2.5.1. N. helminthoeca 2.5.2. Neorickettsia elokominica Tablica 1. Klasifikacija pripadnika reda Rickettsiales koji su patogeni za zivotinje (Boone i sur., 2001) Porodica Rod Vrsta Ciljna stanica vaskularni endotel Rickettsia R. rickettsii Rickettsiaceae Ehrlichiaceae Ehrlichia «E. bovis» E. canis E. equi E. ewingii «E. ondiri» «E. ovina» E. phagocytophila «E. platys» E. risticii A. pullorum A. marginale A. ovis C. ruminantium «N. elokominica» N. helminthoeca «» = vrste nesigurne pripadnosti Vrste iz rodova Bartonella, Grahamella i Rochalimaea kao stanicni paraziti do sada su takoer ubrajane rikecije · Predlozeno je da se sjedinjene u zajednicku porodicu Bartonellaceae i rod Bartonella izuzmu iz reda Rickettsiales i uvrste u red Rhizobiales · Novost u klasifikacijskom smislu takoer predstavlja uvrstavanje pripadnika rodova Eperythrozoon i Haemobarthonella meu hemotropne mikoplazme, te roda Coxiella u poseban red Legionellales, porodicu Coxiellaceae. Razmnozavanje · U organizam nekog clankonozca (vektor) rikecije dospiju krvlju primarnog domaina, razmnoze se u epitelnim stanicama njegova crijeva, slinskoj zlijezdi, ovariju i drugim organima, uglavnom bez stetnih posljedica za clankonozca koji redovito ostaje dozivotno inficiran, a pokatkad prenosi uzrocnika i na potomstvo Na primarnog domaina rikecije se pretezno prenose ugrizom inficiranog clankonozca Nakon infekcije primarnog domaina, rikecije se razmnozavaju u citoplazmi ciljnih stanica, pokatkad u jezgri ili u fagosomima Prema dostupnim podacima, razmnozavaju se binarnom diobom Openito uzevsi, vrste patogene za zivotinje razmnozavaju se u stanicama retikuloendotelnog sustava u koje dospiju fagocitozom · monociti, makrofagi monociti, makrofagi granulociti granulociti granulociti, monociti monociti, makrofagi granulociti krvne plocice monociti, crijevne epitelne stanice, mastociti eritrociti eritrociti eritrociti vaskularni endotel, makrofagi monociti, makrofagi, limfaticne stanice monociti, makrofagi, limfaticne stanice

Aegyptianella Anaplasma Cowdria Neorickettsia

· · · ·

70

Bakterijske bolesti

·

Vrste iz roda Rickettsia nakon fagocitoze brzo se oslobode iz fagosoma i razmnoze u citoplazmi. Pojedini autori drze da se erlihije razmnozavaju slicno kao i klamidije, tvorei retikulsko (inicijalno) tjelesce

Uzgoj i biokemijske osobine

· · · Rikecije se najlaganije uzgoje u zutanjcanoj vrei kokosjeg zametka zivotinja koje nisu bile lijecene antibioticima Zaraznim materijalom inficiraju se 5-7 dana inkubirani zameci Optimalna temperatura za uzgoj rikecija je 33-35°C.

Antigenske osobine i imunost

· · · · · · · Istrazivanja utemeljena na prvotnoj podjeli na topljive i netopljive antigenske tvari upuuju da su rikecijski antigeni po sastavu proteinske, odnosno glikoproteinske i lipopolisaharidne grae U obrambenom smislu vazan je podatak da rikecije nakon fagocitoze mogu opstati u fagocitima, a pojedine i u limfocitima i drugim stanicama domaina Inficirani makrofagi slabije obrauju i predocuju antigene limfocitima, a mogu ih razoriti citotoksicni T-limfociti sto je temelj imunosupresijskog djelovanja rikecija Prezivljavanje u fagocitima vrstama iz roda Rickettsia omoguuje sposobnost da iz fagosoma aktivno prodru u citoplazmu, izbjegavajui tako djelovanje lizosomnih enzima u cemu im pomaze enzim fosfolipaza razgradnjom membrane fagosoma Erlihije koce spajanje fagosoma s lizosomima u fagolizosom U stjecanju otpornosti prema rikeciozama vaznu ulogu ima stanicna imunost Od dijagnostickog je znacenja antigenska srodnost pripadnika porodica Rickettsiaceae s bakterijom Proteus OX, pa se sa somatskim antigenima te nepatogene bakterije mogu dokazati protutijela za rikecije (Weil-Felixova reakcija).

Patogenost i patogeneza

· · · · U krvni optjecaj sisavaca veina rikecija prodire kroz vaskularni endotel Uzrocnici tifusa i pjegavih groznica u organizam covjeka budu unijeti kroz kozu ugrizom clankonosca Tijekom rikecijemije uzrocnik se krvlju i limfom prosiri u druga tkiva, u kojima prodire u endotelne stanice malih krvnih zila i osteuje ih s posljedicnom trombocitopenijom i stanicnom infiltracijom, sto se ocituje pojavom karakteristicnog osipa Patogeneza zivotinjskih rikecioza vrlo je razlicita

71

Bakterijske bolesti

·

·

Pojedine vrste razaranjem eritrocita i njihovom sekvestracijom uzrokuju anemiju i autoimunosne reakcije; druge opet razaraju leukocite na imunosnoj osnovi i smanjuju broj cirkulirajuih stanica te skupine Jedna od vaznih osobina rikecija je latentna nazocnost u naizgled zdravom organizmu u makrofagima i drugim stanicama koje predocuju limfocitima antigen Zivotinjski sojevi rikecija vrlo su specificni u odnosu na tkivne stanice (tablica 1) Tako veina pripadnika porodice Ehrlichieae imaju izraziti afinitet za cirkulirajue leukocite i trombocite a pojedini od njih inficiraju endotelne stanice kapilara (Cowdria ruminantium), dok, primjerice, vrste iz rodova Aegyptianella i Anaplasma parazitiraju u vakuolama eritrocita Neke erlihije kao sto je E. canis pretezno parazitiraju u mononuklearnim stanicama, a samo pokatkad u granulocitima, dok druge kao sto su E. phagocytophila, E. ondiri i E. equi uglavnom parazitiraju u granulocitima. U patogenezi rikecioza odreenu ulogu imaju njihovi endotoksini lipopolisaharidne grae Sojevi iste vrste rikecija mogu se razlikovati u virulenciji, sto se pokatkad podudara s nalazom odreenog plazmida i moze objasniti varijacijama u sastavu lipopolisaharida ili nazocnosti specificnih polipeptida

· ·

· · ·

Prosirenost

· · Rasprostranjenost veine rikecija uvjetovana je zastupljenosu clankonosca koji ih prenose na primarnog domaina Vrste koje prenosi vise clankonozaca (A. marginale) openito su jace prosirene od vrsta koje prenosi samo jedan clankonozac (E. phagocytophila).

72

Bakterijske bolesti

Razvojni ciklus krpelja Krpelji u uhu psa

73

Bakterijske bolesti

Tablica 2. Temeljni podaci o rikecijama vaznim za veterinarsku medicinu (prema Quinn i sur., 2002; Boone, 2001) Vrsta Rickettsia rickettsii Glavni domain i prosirenost covjek, pas; zapadna polutka, osobito istok USA, Centralna Amerika, Juzna Amerika. govedo; Afrika, Srednji istok, Azija, J. Amerika pas; Amerika, Azija, Afrika, Karibi i Mediteran konj; USA, Europa, Izrael pas; USA govedo; Istocna Afrika ovca; Afrika, Azija, Srednji Istok govedo, ovca i divlji prezivaci; Ujedinjeno Kraljevstvo, Irska i Skandinavija pas; USA, Izrael. konj; Sj. Amerika i Europa. domai i divlji prezivaci; Afrika, Karibi. Prijenos (vektor) endemski krpelji rodova Dermacentor, Rhipicephalus, Amblyomma. krpelji smei psei krpelj (Rhipicephalus sanguineus) vjerojatno krpelji; sezonski, kasna jesen, zimi krpelji vjerojatno krpelji. krpelji Ixodes ricinus Bolest i stanice u kojima parazitira pjegava groznica Stijenjaka u covjeka, krpeljna groznica u psa; vaskularni endotel govea erlihioza; monociti, makrofagi psea monocitna erlihioza; monociti, makrofagi konjska erlihioza; granulociti psea granulocitna erlihioza; granulociti govea petehijalna groznica; granulociti, monociti ovcja erlihioza; monociti, makrofagi krpeljna groznica, gravidne zivotinje mogu pobaciti; granulociti psea ciklicka trombocitopenija, obicno supklinicka bolest; krvne plocice Potomacka konjska groznica; monociti, crijevni epitel, mastociti heartwater; vaskularni endotel, makrofagi bolest trovanja lososima; uzrocnik prisutan u lososima u metacerkarijama metilja Nanophyetus salmincola; monociti, makrofagi, limfaticne stanice Elokominska metiljna groznica (blazi oblik); uzrocnik se nalazi zajedno sa N. helminthoeca ili sam; monociti, makrofagi, limfaticne stanice anaplazmoza; eritrociti anaplazmoza; rijetka i blaga bolest; eritrociti egipcijaneloza; eritrociti, leukociti, mononuklearne

«Ehrlichia bovis» E. canis E. equi E. ewingii «E. ondiri» «E. ovina» E. phagocytophila

«E. platys»

vektor nije poznat (vjerojatno krpelji) vektor nije poznat (metilj?) krpelji Amblyoma spp.

E. risticii Cowdria ruminantium

Neorickettsia helminthoeca

pas; zapadna obala Sj. Amerike

metilj

«N. elokominica»

pas, medvjed, rakun; zapadna obala Sj. Amerike govedo i drugi prezivaci; tropska i suptropska podrucja. ovca, koza, visoka divljac; Azija, Afrika, Europa, USA perad; J. Afrika, sjeverna i istocna

metilj

Anaplasma marginale A. ovis Aegyptianella pullorum

krpelji i drugi clankonosci, veterinarski instrumenti krpelji krpelji kao Argas persicus (moze prenositi i bakteriju

74

Bakterijske bolesti

Azija i Mediteran «» = vrste nesigurne pripadnosti 1. Porodica Rickettsiaceae

Borrelia anserina!)

stanice

Od nekoliko rodova sto ih obuhvaa ova porodica za humanu, a djelomice i veterinarsku medicinu, vazan je rod Rickettsia. 1.1. Rod Rickettsia (prema H. T. Rickettsu koji je prvi opisao uzrocnika pjegavog tifusa i umro od te bolesti) Pripadnici roda Rickettsia ne mogu se uzgojiti na umjetnim hranjivim podlogama, nego iskljucivo na nacin koji ukljucuje uzgoj u zivoj stanici. Uzrokuju pojedine oblike pjegavih tifusa i pjegavih groznica u ljudi. 1.1.1. Rickettsia prowazekii Uzrokuje pjegavi tifus, bolest koja se redovito javlja u tijeku rata i meu siromasnim pucanstvom. Uzrocnika pretezno prenosi prtena us (Pediculus humanus humanus), koja se inficira sisui krv bolesnika u stadiju rikecijemije. Razmnozava u crijevnom epitelu usi i izlucuje njenim izmetinama. Us ugiba 2-3 tjedna nakon sto se inficirala. Covjek se inficira utrljavanjem izmetina i uzrocnika u kozu na mjestu uboda nametnika, aerosolom kroz disni sustav ili kroz sluznicu oka. Kao mogui rezervoar infekcije u SAD spominje se letea vjeverica, a protutijela za tu rikeciju ustanovljena su i u drugih zivotinja (goveda, psa, magarca, koze). 1.1.2. Rickettsia typhi Po mikrobioloskim osobinama i patogenosti srodna je vrsti R. prowazekii. U ljudi uzrokuje bolest pod nazivom endemicni ili murini tifus (stakorski tifus). Prirodni rezervoari infekcije su naizgled zdravi, ali inficirani stakori. Zaraza se meu stakorima prenosi vektorom-stakorskom buhom (Xenopsylla cheopsis) Inficirani stakori dozivotno izlucuju uzrocnika izmetinama i na taj nacin covjek koji doe u doticaj s izmetom biva zarazen. Sirenju infekcije meu ljudima najvjerojatnije posreduju usi i buhe. Takoer postoji i misljenje da se covjek tom rikecijom moze inficirati i od nekih drugih zivotinja. 1.1.3. Rickettsia rickettsii (Rocky Mountain Spotted Fever, New World spotted fever, Tkickborne typhus fever, Sao Paolo fever) · Vrsta Rickettsia rickettsii uzrokuje pjegavu groznicu (pjegavi tifus) u podrucju Stijenjaka u SAD i u drugim zemljama Sjeverne, Sredisnje i Juzne Amerike, od koje, osim covjeka, obolijeva i pas koji boluju najcese bez klinicki vidljivih znakova bolesti (latentna infekcija) - Sojevi Rickettsia rickettsii razlikuju se po virulenciji Rickettsia rickettsii prenose krpelji iz rodova Dermacentor, Rhipicephalus i Ambliomma, koji se inficiraju hranei se krvlju malih glodavaca (vjeverice, voluharice) i drugih divljih i domaih zivotinja Inficirani krpelj moze prenijeti transovarijski i transstadijski uzrocnika na potmstvo Da bi se uzrocnik iz sline inficiranog krpelja prenio na covjeka ili zivotinju potrebno je da krpelj ostane pricvrsen na domainu priblizno 20-ak sati Priblizno 10% oboljelih ljudi inficira se u dodiru sa psima ili krpeljima Psi najcese oboljevaju u razdoblju od ozujka do listopada a bolest se ocituje povisenom tjelesnom temperaturom (>40 0C), anoreksijom, depresijom, konjunktivitisom, krvarenjima u mreznici, bolovima u misiima i zglobovima, ukocenim hodom, otezanim disanjem i edemima udova

· · · · ·

75

Bakterijske bolesti

Oboljele zivotinje pokatkad uginu u akutnom stadiju bolesti zbog hemoragicne dijateze ili tromboze vitalnih organa. Razudbom se najcese uoci znaci ope limfadenomegalije, splenomegalije i krvarenja · Etioloska dijagnoza bolesti u pasa postavlja se seroloskim postupcima, posebice posrednom imunofluorescencijom i imunoenzimnim testom (moze se pokusati uzgojiti uzrocnika iz krvi i tkiva na prijemljivim laboratorijskim zivotinjama-zamorcetu, livadnoj voluharici, u kokosjem zametku ili stanicnoj kulturi) · Uzrocnik je osjetljiv prema tetraciklinima, kloramfenikolu i fluorokinolonima · Zivotinje koje prebole, imune su na reinfekciju 1.1.4. Rickettsia conori Vrlo je prosirena po svijetu, uzrokuje mediteransku pjegavu groznicu (marsejsku groznicu, kenijski krpeljni tifus), koja se u Hrvatskoj javlja endemicki u juznim dijelovima zemlje · Prijenosnici, a i rezervoari infekcije su razlicite vrste krpelja a u nas je to smei psei krpelj Rhipicephalus sanguineus. · U sirenju mediteranske pjegave groznice sudjeluju razlicite latentno inficirane zivotinje, posebice pas, stakor i mis U skupinu uzrocnika pjegavih groznica koje prenose krpelji, a pojedine im zivotinje sluze kao domaini, ubrajaju se Rickettsia akari, uzrocnik rikecijskih kozica, Rickettsia australis, uzrocnik queenslandskog krpeljnog tifusa i Rickettsia sibirica, uzrocnik sjeverno-azijskog krpeljnog pjegavog tifusa. Glavni domain za R. akari je sivi kuni mis, a prijenosnik i domain misja grinja Allodermanyssus sanguineus. Za vrstu R. australis prirodni domaini su divlji glodavci i tobolcari, a prijenosnici krpelji iz roda Ixodes. Infekciju vrstom R. sibirica sire razliciti krpelji, a prirodni rezervoari za tu rikeciju su pojedini divlji glodavci i domae zivotinje, a takoer i krpelji. 1.1.5. Rickettsia (Orientia) tsutsugamushi Dijeli se u vise serovarova. Uzrokuje bolest sikarski tifus, koja je prosirena na Dalekom Istoku, Australiji i pacifickom otocju. Uzrocnik obitava u divljim glodavcima, a glavni prirodni domain mu je stakor, rjee voluharica. Sire ga larve grinje Leptotrombidium deliense, koje ga transovarijski prenose na potomstvo. Kako se iskljucivo larve hrane krvlju, samo u tom stadiju grinja moze prenijeti uzrocnika na covjeka. Predlozeno je da se ta vrsta izuzme iz roda Rickettsia i uvrsti u rod Orientia. ·

·

2. Porodica Ehrlichiaceae

Prema suvremenoj klasifikaciji ta se porodica dijeli na rodove Ehrlichia, Aegyptianella, Anaplasma, Cowdria i Neorickettsia.

2.1. Rod Ehrlichia (prema njemackom bakteriologu P. Ehrlichu)

· Erlihije su malene pleomorfne gram-negativne bakterije kojih velicina ovisi o razvojnom stadiju Bojenjem po Romanowskyu oboje se tamnoplavo do ljubicasto-crveno, a prema Machiavellu svjetlocrveno U preparatima obraenim solima srebra, crvene su i crno-smee boje Imaju stanicnu stijenku i obligatni su unutarstanicni paraziti leukocita Razmnozavaju se u intracitoplazmenoj vakuoli uz stijenku cirkulirajuih leukocita, diobom na dvoje

·

· · ·

76

Bakterijske bolesti

·

U monocitima se mogu ustanoviti tri morfoloski razlicita oblika: (1) elementarno tjelesce promjera manjeg od 1 µm kao pocetni oblik, (2) nesto vee inicijalno tjelesce i (3) nakupine (kolonije) elementarnih tjelesaca, priblizno velike 4 µm, koje se zbog svog izgleda naziva morule U obojenim razmascima krvi moze se nai vise desetaka takvih ukljucaka Za pojedine vrste je dokazano da ih prenose krpelji. Opisano je dvanaestak vrsta erlihija od kojih pojedine uzrokuju bolesti u psa, goveda, ovce, koze, konja i covjeka. U krvi na sobnoj temperaturi sacuvaju infektivnost 10 dana, u hladnjaku 14 dana, a pri ­80 0C godinu i pol.

· ·

2.1.1. Ehrlichia canis

· · · Erlihije se ne mogu uzgajati na umjetnim hranjivim podlogama, niti u kokosjim zamecima Ehrlichia canis moze se uzgojiti u primarnoj i linijskoj kulturi pseih monocita ili makrofaga Antigenski je srodna ostalim erlihijama, a razlikuje se od virusa i drugih mikroorganizama patogenih za pse Uzrocnika prenose krpelji, najcese pripadnici vrste Rhipicephalus sanguineus u kojima se uzrocnik razmnozava Za krpelja je krv domaina zarazenog erlihijom infektivna samo Ehrlichia canis in an agranulocyte tijekom akutne faze bolesti, koje ne traje dulje od dva tjedna Iako je E. canis dosada ustanovljena iskljucivo u kanida, pretpostavlja se da se krpelji tom erlihijom mogu zaraziti i od malih sisavaca (glodavci) Bolest u pasa poznata je pod nazivom psea monocitna erlihioza ili tropska psea pancitopenija a prosirenost bolesti podudara se sa rasprostranjenosu krpelja R. sanguineus kao rezervoarom i vektorom Patogeneza bolesti temelji se na imunopatoloskim reakcijama i djelovanju endotoksina Klinicki znaci akutne erlihioze pojave se 8-20 dana nakon ugriza krpelja, a traju 2-4 tjedna Bolest se ocituje groznicom, trombocitopenijom, leukopenijom i anemijom te jakom invazijom parenhimskih organa s perivaskularnim nakupljanjem plazma-stanica, osobito u pluima, mozdanim ovojnicama, bubrezima i slezeni a limfociti inficiranog psa razaraju vlastite monocite Za pseu erlihiozu osobito je karakteristican nalaz jake leukopenije i trombocitopenije a dokazano je da serum inficiranih pasa sadrzava topljivi faktor koji koci migraciju trombocita

·

·

· · · · ·

·

77

Bakterijske bolesti

· · · · · ·

· · · · · · ·

Veina pasa prezivi akutni napad, nakon kojega bolest prelazi u subklinicki oblik koji traje vise mjeseci ili godina, a ocituje se samo promjenama u krvnoj slici Pojedine zivotinja obole sa znacima tzv. tropske psee pancitopenije, od koje mogu uginuti zbog opseznih krvarenja u sluznicama, serozama i kozi, neuroloskih poremeaja, edema i iscrpljenosti Specificna otpornost prema infekciji erlihijama temelji se na stanicnoj imunosnoj reakciji, na djelovanju citotoksicnih T-limfocita, K-stanica i njihovih citokina Prva protutijela pripadaju IgM i IgA razredu, a pojave se sedam dana nakon infekcije, a nakon tri tjedna pojave se i protutijela IgG razreda, kojih titar raste, dok se titar protutijela IgM i IgA razlicito ponasa Za dijagnostiku bolesti znacajno je da inficirani psi tvore protutijela neovisno o pojavi klinickih znakova bolesti Iako je u pojedinim pokusima zapazeno da imunosni serumi smanjuju sposobnost razmnozavanja erlihija u makrofagima, openito se drzi da titar protutijela nije pouzdan pokazatelj imunosti, a protutijela mogu poticati razmnozavanje erlihija opsonizacijom protutijela olaksavaju prijanjanje uzrocnika na povrsinu makrofaga (ali ne i cjelokupni proces fagocitoze, jer erlihije mogu izbjei ucinku lizosomnih enzima) Posebno izrazena osjetljivost njemackih ovcara prema infekciji vrstom E. canis tumaci se njezinim imunosupresijskim djelovanjem na pse spomenute pasmine Dijagnoza psee erlihioze postavlja se bojenjem krvnih razmazaka Giemsinim postupkom i nalazom tamnoljubicasto obojenih kokoidnih bakterija promjera 0,5 µm, ili ukljucaka velicine do 4 µm, u citoplazmi monocita i limfocita Erlihije je najlakse uociti u krvnim razmascima priblizno trinaestog dana nakon infekcije Postupkom posredne imunofluorescencije dokazuju se protutijela u krvnom serumu zarazenih pasa pomou antigena uzgojenog u kulturi stanica pseih makrofaga Ovisno o pasmini i trajanju infekcije, titar protutijela koleba od 1:10 - 1:10.240, i vise Ekstremno visoki titar (1:163.840) upuuje na kronicni tijek bolesti; iznenadni pad titra protutijela obicno se dogodi prije uginua U lijecenju erlihioze uzrokovane vrstom E. canis najdjelotvorniji su tetraciklini (tetraciklin hidroklorid, oksitetraciklin, doksiciklin), a lijecenje je uspjesno i kloramfenikolom; fluorokinoloni nisu djelotvorni

2.1.2. Ehrlichia equi

· Uzrocnik je konjske erlihioze, koja se obicno javlja sezonski, u kasnu jesen i zimi Ustanovljena je u SAD, u pojedinim europskim zemljama i Izraelu Pokusno se uzrocnikom moze inficirati magarac, ovca, koza, pas, macka i majmun E. equi parazitira u citoplazmi neutrofilnih i eozinofilnih leukocita Uzrocnika vjerojatno prenose krpelji (Ixodes pacificus) Klinicki znaci bolesti su povisena temperatura, depresija, anoreksija, edemi udova, petehijalna krvarenja na sluznicama, zutica i ataksija Odrasli konji obicno obole s izrazenijim znacima nego zdrebad, ali oboljele zivotinje rijetko uginu Hematoloski nalaz upuuje na anemiju, leukopeniju i trombocitopeniju

· · · ·

· ·

78

Bakterijske bolesti

· · · · ·

Pokatkad se uzrocnikom inficiraju psi i obole s klinickim znacima. Nakon preboljenja konji su odreeno vrijeme imuni prema reinfekciji Imunost se osniva na stanicnoj i humoralnoj obrambenoj reakciji Dijagnoza bolesti postavlja se nalazom morula u neutrofilnim leukocitima, u krvnim razmascima obojenim prema Giemsi, i seroloski, posrednom imunofluorescencijom Uzrocnik je osjetljiv prema tetraciklinskim antibioticima Imunoprofilaksa se ne provodi.

2.1.3. Ehrlichia ewingii

Uzrocnikom je psee granulocitne erlihioze, bolesti koja protjece u blagom, klinicki jedva prepoznatljivom obliku. Uzrocnika prenose krpelji, pretezno napada neutrofilne leukocite.

2.1.4. «Ehrlichia ondiri»

Uzrocnik je govee petehijalne groznice (sin. Ondiri bolest), koja se javlja u domaih i divljih prezivaca, pretezno u goveda, u visinskim predjelima u Keniji i Tanzaniji, redovito u prigodi kad se neinficirane zivotinje uvedu na podrucje u kojem se bolest javlja enzootski. Bolest se ocituje iznenadnom pojavom agalakcije, groznicom i opseznim petehijskim krvarenjima po vidljivim sluznicama. Gravidne zivotinje pobace, smrtnost je visoka. Pretpostavlja se da uzrocnika prenose krpelji koji nastanjuju ta podrucja. Najprije se razmnozava u slezeni, iz koje se siri u ostale organe. E. ondiri parazitira u citoplazmi cirkulirajuih granulocita, rjee u mononuklearnim stanicama. Pleomorfna je i u citoplazmi inificiranih stanica nalazi se u obliku malenih tjelesaca okrugla ili jajolika oblika (0.3 µm), te veih tjelesaca ili mikrokolonija, koje su velike 3-4 µm. Giemsinim postupkom ti se ukljucci oboje plavicasto ili ruzicasto. Uzrocnik se uglavnom odrzava pasazama na govedima ili ovcama, a cuva se u tekuem dusiku. Sojevi E. ondiri razlikuju se meusobno u antigenskim osobinama i po patogenosti. Iako je dokazan i transplacentni prijenos. Pojedine pasmine goveda izrazito se razlikuju primljivosu za infekciju. E. ondiri osjetljiva je prema oksitetraciklinu, a otporna prema penicilinu, streptomicinu i kloramfenikolu.

2.1.5. Ehrlichia phagocytophila

Krpeljna groznica (sin. pasna groznica) sto je ova erlihija uzrokuje u domaih i divljih prezivaca, ustanovljena je u Ujedinjenom Kraljevstvu, Irskoj i Skandinaviji. Postoje podaci da se javlja u Indiji i J. Africi. Bolest je blage naravi, ali je vazna zbog cestih sekundarnih infekcija koje su posljedica supresijskog djelovanja uzrocnika na humoralnu i stanicnu imunoreaktivnost. E. phagocytophila obligatni je unutarstanicni parazit polimorfonuklearnih leukocita i monocita, u kojima se razmnozava u citoplazmenoj vakuoli. Uzgaja se u kokosjem zametku i stanicnim kulturama. Od domaih prezivaca od krpeljne groznice najcese obole ovca i govedo, rjee koza. Uzrocnika pretezno prenosi krpelj Ixodes ricinus, u kojem prezivi do godinu dana. Vjerojatno ga mogu prenijeti i drugi clankonosci, a prenosi se i onecisenim instrumentima. Nakon preboljenja, zivotinje mogu dugo nositi uzrocnika u krvi i biti rezervoar infekcije. U ovaca to razdoblje potraje i do dvije godine. Bolest se u mladih zivotinja ocituje znacima groznice, smanjenim prohtjevom za hranom i tjelesnim prirastom. U krava je smanjena proizvodnja mlijeka, gravidne zvotinje mogu pobaciti. Za dva tjedna veina oboljelih zivotinja se oporavi, ali prvotnu erlihiozu cesto zakompliciraju sekundarne infekcije gnojnim bakterijama (krpeljna pijemija janjadi). Za vrijeme zivota za bolest je karakteristicni nalaz leukopenije i prolazne trombocitopenije, a nakon uginua splenomegalija i krvarenja u crijevu. Pojedine pasmine goveda otpornije su prema infekciji od drugih. Specificna otpornost prema ponovnoj infekciji nije jednako kvalitetna i ne traje podjednako u svih zivotinja, sto bi mogla biti posljedica razlika u antigenskim osobinama sojeva kojima su inficirane. Trajanje imunosti u ovaca koleba od nekoliko mjeseci do vise od godinu dana. Protutijela se mogu ustanoviti

79

Bakterijske bolesti

RVK i neizravnom imunofluoresccencijom. U prva tri tjedna nakon infekcije pripadaju IgM, a poslije toga IgG. Titar protutijela podudara se s otpornosu prema infekciji homolognim sojem. Dijagnoza bolesti postavlja se na osnovi epizootioloskih podataka i klinickih znakova bolesti, uz nalaz plavo obojenih nakupina uzrocnika (moruala) velicine 0.7-3.0 µm u granulocitma i monocitima, u krvnim razmascima obojenom Giemsinim postupkom. Morule sadrzava vise od 70% neutrofilnih leukocita. E. phagocytophila osjetljiva je prema tetraciklinima i tilozinu, slabije osjetljiva prema kloramfenikolu i sulfametazinu, a otporna prema penicilinu, streptomicinu i ampicilinu.

2.1.6. Ehrlichia platys

E. platys uzrokuje pseu ciklicku trombocitopeniju, bolest koja je ustanovljena u SAD, Grckoj i juznoj Italiji. Razmnozava u krvnim plocicama, u kojima se obojena prema Romanowskyu nalazi pojedinacno (1 µm) ili u nakupinama (morulama) velikim 2-3 µm. Antigenski se razlikuje od vrste E. canis. Kako nije uzgojena in vitro, kao antigen za pripremu protutijela i za izvoenje seroloskih reakcija koriste se inficirane psee krvne plocice. Pretpostavlja se da infekciju vrstom E. platys sire krpelji. Kako se u krvi inficiranih pasa mogu ustanoviti protutijela za vlastite krvne plocice, drzi se da je trombocitopenija posljedica autoimunosne reakcije. Klinicki znaci infekcije obicno nisu izrazeni. Bolest se pokatkad ocituje groznicom, anoreksijom, letargijom, mrsavljenjem, anemijom i uveitisom. Na infekciju vrstom E. platys upuuje hematoloski nalaz jake trombocitopenije i mikroskopski nalaz ukljucaka u krvnim plocicama. Protutijela se mogu dokazati neizravnom imunofluorescencijom, priblizno dva tjedna nakon infekcije. U lijecenju se najcese rabe tetraciklinski antibiotici.

2.1.7. Ehrlichia risticii

· · · · · · · · · · · · · · · · · Ehrlichia risticii uzrokuje monocitnu erlihiozu konja (sin. Potomacna konjska groznica, konjski erlihijski kolitis), bolest je prosirena u SAD, a ustanovljena je i u pojedinim europskim zemljama Morfoloski je slicna ostalim erlihijama Razmnozava se u fagosomima monocita diobom na dvoje Uzgaja se u stanicnim kulturama monocitno-makrofagnih linija Ima pojedine zajednicke antigene sa vrstom E. sennetsu i nekim drugim erlihijama Prema nalazu protutijela moze se zakljuciti da se tom erlihijom, osim konja, spontano mogu inficirati pas, macka i neke druge zivotinje Inficirani psi pokatkad obole s klinicki izrazenim znacima Uzrocnik naseljava epitelne stanice kripta u kolonu, monocite, tkivne makrofage i mastocite - Konji obicno obole ljeti, a pretpostavlja se da u sirenju infekcije odreenu ulogu ima metilj U svom tipicnom obliku, bolest se javi iznenada praena povisenom tjelesnom temperaturom, depresijom, anoreksijom, i leukopenijom Kasnije, tijekom bolesti pojave se edemi na donjem dijelu udova i trbuha, kolike, profuzni proljev i sepavost; u kobila je opisan pobacaj Veina inficiranih konja ne pokazuje znakove bolesti Preboljenjem infekcije konji stjecu odreenu otpornost prema reinfekciji, ali imunosni mehanizmi pri ovoj bolesti nisu dovoljno prouceni a pretpostavlja se da se otpornost temelji na humoralnoj i stanicnoj imunosnoj reakciji Bolest se moze objektivno dijagnosticirati izdvajanjem uzrocnika iz krvi u akutnoj fazi bolesti, ali to rijetko uspijeva Od seroloskih reakcija, najbolji rezultati postignuti su nalazom porasta titra protutijela posrednom imnuofluorescencijom i imunoenzimnim testom Istrazuje se mogunost uporabe genetskih postupaka za dokazivanje uzrocnika U lijecenju se obicno rabi oksitetraciklin, amikacin i kloramfenikol Povoljni rezultati u imunoprolaksi postignuti su uporabom inaktivirane vakcine

80

Bakterijske bolesti

2.1.8. «Ehrlichia bovis» i «Ehrlichia ovina»

«Ehrlichia bovis» uzrokuje mononuklearnu erlihiozu u goveda, a «Ehrlichia ovina» je uzrocnik te bolesti u ovaca, u tropskim i suptropskim podrucjima. U citoplazmi mononuklearnih stanica inficiranih zivotinja, posebice monocita, nalaze se tvorevine velike 2 do 10 µm u promjeru. Bioloski ciklus tih erlihija ukljucuje pojavu inicijalnih tjelesaca promjera 2-8 µm, morule koje zapravo predstavljaju inicijalna tjelesca sto se raspadaju u elementarna tjelesca, i elementarna tjelesca velicine 0.2-0.8 µm u promjeru. Osim u mnonuklearnim stanicama, te se erlihije rijetko se nalaze u limfocitima, a nisu ustanovljene u granulocitima i endotelnim stanicama. Vrsta E. bovis antigenski je srodna s pojedinim vrstama erlihija i vrstom C. ruminantium. U prijenosu E. bovis i E. ovis sudjeluju krpelji iz rodova Hyalomma, Rhipicephalus i Amblyomma.

2.1.9. Ehrlichia sennetsu

Antigenski je slicna vrsti E. canis, a uzrocnik je erlihioze u ljudi (Senetsu groznice, zarazne mononukleoze), koja se javlja u jugoistocnoj Aziji, a seroloski je utvrena i u SAD. Pretpostavlja se da u sirenju infekcije sudjeluju krpelji, ali to nije dokazano.

2.2. Rod Aegyptianella

Pri infekciji egipcijanelama u citoplazmi eritrocita u krvnim razmascima obojenim Giemsinim postupkom nalaze se ukljucci razlicita oblika, u promjeru veliki 0.3-4.0 µm. Ukljucci sadrze vise od dvadeset okruglih inicijalnih tjelesaca (bakterijskih stanica), koja su velika do 0.8 µm. Incijalno tjelesce je infektivni oblik egipcijanela, koji se dijeli diobom na dvoje. Osim u eritrocitima, egipcijanele se mogu nai u leukocitima, mononuklearnim fagocitima i slobodne u krvnoj plazmi. A. pullorum, jedina vrsta u tom rodu, uzrokuje u peradi krpeljnu anemiju, koja je prosirena u mediteranskim zemljama, Juznoj Africi i Jugoistocnij Aziji. Ustanovljena je u kokosi, guske, patke, prepelice i noja. Oboljele zivotinje su bez apetita, imaju nakostrijeseno perje, proljev, anemiju i hiperemiju. Pri razudbi ustanovi se poveana jetra i slezena i krvarenja na seroznim opnama. Uzrocnika prenose krpelji roda Argas. Osjetljiv je prema tetraciklinima i pleuromutilinu (tiamulin).

2.3. Rod Anaplasma

· Anaplazme su obligatne intracelularne parazitske bakterije, koje se ne mogu uzgojiti na umjetnim hranjivim podlogama · Razmnozavaju se diobom na dvoje a morfoloski su slicne ostalim rikecijama · U mikroskopskim preparatima obojenim prema Romanowskom anaplazme se vide u rubnom podrucju eritrocita, uz stanicnu stijenku, kao ljubicasto-crveno obojeni ukljucci (morule), veliki 0.3-1.0 µm · Okrugla su ili jajolika oblika, a u svakom se ukljucku nalazi od nekoliko do deset inicijalnih tjelesaca promjera 0.3-0.4 µm; svako inicijalno tjelesce predstavlja zasebnu infektivnu jedinicu, koja ima DNA i RNA, okruzena je dvoslojnom opnom, nema cvrstu stanicnu stijenku · Kad dospije na povrsinu eritrocita, invaginacijom stijenke inicijalno tjelesce bude uvuceno u citoplazmu, u kojoj se nalazi u vakuoli okruzeno otkinutim dijelom stjenke eritrocita · Razmnozavanjem inicijalnog tjelesca diobom na dvoje nastaju novi ukljucci. · Prenose ih krpelji kao bioloski vektori, a ostali clankonosci sto grizu kao mehanicki vektori - Bolest uzrokovana patogenim anaplazmama obicno se ocituje anemijom · Lijecenje se provodi tetraciklinima · Uzrocnici anaplazmoze u domaih i divljih prezivaca su vrste A. marginale, A. centrale, A. ovis i A. caudatum (sin. Paranaplasma caudatum)· Najvise podataka u literaturi odnosi se na vrstu A. marginale, koja uzrokuje anaplazmozu u goveda i drugih prezivaca A. ovis rijetko uzrokuje anaplazmozu u ovce, a ustanovljena je i u visoke divljaci i koze · caudatum moze se ustanoviti u goveda zajedno s vrstom A. marginale, ali njezino znacenje kao uzrocnika anaplazmoze nije pouzdano dokazano

81

Bakterijske bolesti

centralis vaznija je kao vrsta kojom se telad moze vakcinirati protiv infekcije vrstom A. marginale, nego kao uzrocnik bolesti Glavne osobine anaplazama (Krieg i Holt, 1984; Quinn i sur., 1994) Vrsta A. marginale A. centrale Domain govedo i drugi prezivaci, visoka divljac govedo Smjestaj u eritrocitima pretezno rubni pretezno u sredistu Privjesak nema nema Bolest izrazeni oblik anaplazmoze

·

openito blagi oblik anaplazmoze blagi do izrazeni A. caudatum govedo pretezno rubni ima oblik anaplazmoze blagi do izrazeni ovca, visoka pretezno rubni nema A. ovis oblik bolesti divljac, koza · Anaplasma marginale moze se uzgojiti u eritrocitima goveda suspendiranih u otopini posebna sastava · Opisan je postupak uzgoja u kulturi stanica kunije kostane mozdine i linijskim kulturama stanica krpeljnog podrijetla · Anaplazme imaju zajednicke antigene i antigene kojima se meusobno razlikuju pojedine vrste i sojevi unutar vrste · Anaplazmoza je prosirena u tropskom i suptropskom podrucju, od koje uglavnom obolijevaju goveda (rjee drugi prezivaci) u dobi od godinu dana i starija · Bolest se ocituje znacima groznice, anemije i zutice · Anemija vjerojatno nastaje na osnovi imunosne reakcije na inficirane eritrocite i njihovom uklanjanju od strane makrofaga · Znakovi bolesti su izrazeniji u zivotinja koje se uvode u zarazeno podrucje, nego u onih koje na tom podrucju borave · -U zivotinja mlaih od godinu dana znakovi bolesti su blagi a nakon nestanka simptoma i dalje su kliconose, dok u starijih zivotinja bolest moze biti perakutnog tijeka sa smrtnim ishodom · Uzrocnik se prenosi sa subklinickih inficiranih goveda ili divljih prezivaca na zdrave razlicitim putevima a u prijenosu pretezno sudjeluju krpelji roda Boophilus kao i drugi hematofagni dvokrilci, moze se prenijeti i onecisenim instrumentima, kroz placentu i konjunktive · Uzrocnik dospije u krv nakon ugriza krpelja, procesom endocitoze ulazi u eritrocite i u njima se razmnozava · Tri do cetiri tjedna nakon infekcije, u stjenci eritrocita nalaze se nova inicijalna tjelesca, od kojih diobom na dvoje u rubnom podrucju eritrocita nastaju ukljucci; u obliznje eritrocite uzrocnik ulazi nakon sto se oslobodi iz inficiranog eritrocita, ili u njih prodre izravno · Zivotinja koja se oporavi ostaje kliconosom i do dvanaest godina. · Etioloska dijagnoza anaplazmoze postavlja se mikroskopskim nalazom ukljucaka u eritrocitima u krvnim razmascima obojenim prema Giemsi ili akridinoranzom · Uzrocnik se moze dokazati izravnom imunofluorescencijom i lancanom reakcijom polimerazom (PCR) · S razlicitim stupnjem pouzdanosti, dijagnoza se postavlja seroloskim reakcijama: kapilarnom aglutinacijom, posrednom imunofluorescencijom, RVK, aglutinacijom i imunoenzimnim testovima · Vrsta A. marginale osjetljiva je prema tetraciklinima i imidokarb-dipropionatu, koji se rabe u lijecenju bolesti i u suzbijanju latentne infekcije · Imunost kod anaplazmoze vjerojatno je pretezno stanicnoga tipa i temelji se na premuniciji · Zbog poveane otpornosti, bolest poprima latentni oblik, u kojem je uzrocnik u malom broju stalno prisutan u organizmu a zivotinja je zastiena od reinfekcije homolognim sojem, ali se moze inficirati heterolognim sojem uzrocnika

82

Bakterijske bolesti

· ·

Opisano je nekoliko vakcina koji doprinose poveanoj otpornosti, u tom smislu sto u imuniziranih zivotinja sprecavaju pojavu bolesti, ali ne i infekcije Vakcine sadrzavaju virulentne ili atenuirane sojeve, odnosno inaktiviranog uzrocnika s dodatkom adjuvanta

2.4. Rod Cowdria

· · · Kaudrije su malene pleomorfne bakterije, kokoidna (0.2-0.5 µm) ili jajolika, rijetko stapicasta oblika (0.2-0.3 x 0.4-0.5 µm) U vakuolama citoplazme endotela krvnih zila prezivaca nalaze se u skupinama Unutar vakuola endotelnih stanica kapilara i makrofaga razmnozavaju se diobom na dvoje, pri kojoj najprije nastaju tzv. mrezasta tijela, koja se postupno smanjuju i preko intermedijarnih tjelesaca pretvaraju u elementarna tjelesca. Nakon propadanja stanica elementarna tjelesca se oslobode a ulaskom u novu stanice zapocinje novi ciklus razmnozavanja, koji traje 5-6 dana Kaudrije se mogu uzgojiti u kulturi endotelnih stanica

·

2.4.1. Cowdria ruminantium

· Jedina je vrsta u rodu Cowdria i uzrokuje septikemijsku zaraznu bolest kaudriozu, poznatiju pod engleskim nazivom «heartwater» (engl. heart, srce; water, voda); od kaudrioze obolijeva govedo, ovca i koza, ostali prezivaci rijetko Bolest je prosirena u Saharskoj Africi i Karibskim otocima Uzrocnika prenose krpelji iz roda Amblyomma, a kao mogui rezervoar navode se glodavci; izvan domaina C. ruminantium brzo ugiba

· ·

Cowdria ruminantium, u mozgu goveda

Opstitotonus i kontrakcija misia Uprljana perinealna regija ekstramiteta · Kaudrioza se ocituje iznenadnom pojavom groznice, kojoj se pridruzuju simptomi od strane sredisnjeg zivcanog sustava (zvakanje, trzanje ocnih kapaka, kretanje u krug, nemogunost ustajanja) i velikom smrtnosu · Patoanatomski bolest se ocituje nakupljanjem tekuine u osrcju, grudnom kosu i peritonealnoj supljini, edemom i punokrvnosu plua, krvarenjima po sluznicama i serozama · Slezena, limfni cvorovi i jetra su poveani · S klinicki izrazenim znacima obicno oboli telad, janjad i jarad, a zdrave odrasle zivotinje tek ako se uvedu u zarazeni uzgoj · Pretpostavlja se da se uzrocnik najprije razmnozava u stanicama sinusoida limfnih cvorova, iz kojih dospije u krv i naseli endotel kapilara u mozgu s posljedicnim krvarenjima i transudacijom · Smatra se da su poremetnje od strane sredisnjeg zivcanog sustava posljedica djelovanja endotoksina · U zivotinja koje prebole kaudriozu uzrocnik opstane vise mjeseci

83

Bakterijske bolesti

·

· · · · · · · · · ·

U zivih zivotinja etioloska dijagnoza kaudrioze moze se samo pokusati postaviti bojenjem mikroskopskih preparata po Giemsi nacinjenih iz bioptata mozdane kore i nalazom nakupina uzrocnika u endotelu kapilara (negativan nalaz ne iskljucuje infekciju) Tocna dijagnoza postavlja se nakon uginua pretragom patohistoloskih preparata mozdane kore ili nekog drugog organa U postavljanju etioloske dijagnoze vrlo je koristan bioloski pokus na prijemljivim prezivacima -Seroloska dijagnoza postavlja se nalozom protutijela posrednom imunofluorescencijom, imunoenzimnim testom, Western blot postupkom i lancanom reakcijom polimerazom (PCR) Lijecenje tetraciklinskim pripravcima, osobito ako se zapocne na vrijeme dovodi do izljecenja Sojevi C. ruminantium antigenski se razlikuju, sto se ne podudara s njihovom patogenosu Imunost na reinfekciju homolognim sojem moze potrajati tri mjeseca do pet godina, ovisno o vrsti zivotinje Imunost prema kaudriozi vjerojatno je stanicnog, a ne humoralnog tipa U imunoprofilaksi kaudrioze koristi se specifican nacin imunizacije zarazavanjem slabo virulentnim sojevima, uz istovremeno praenje temperature vakciniranih zivotinja i primjenu antibiotika (tetraciklina), cim temperatura poraste Pasazom na kulturama goveih endotelnih stanica proizveden je atenuirani soj vrste C. ruminantium, prikladan za imunizaciju ovaca i koza Glavnu poteskou u imunoprofilaksi i dalje predstavlja antigenska razlicitost sojeva C. ruminantium

2.5. Rod Neorickettsia

· · · · Neorikecije su pleomorfne gram-negativne bakterije, kokoidna, kokobacilarna ili prstenasta oblika, pojedinacno velike priblizno 0.3 µm Pokatkad se mogu ustanoviti stapicasti oblici dugi do 2 µm Dobro se boje Giemsinim postupkom, a mogu se dokazati postupkom oblaganja solima srebra prema Levaditiju Meu pripadnicima roda Neorickettsia navode se dvije vrlo srodne vrste, Neorickettsia helminthoeca i Neorickettsia elokominica.

84

Bakterijske bolesti

BAKTERIJSKA VRSTA STAPHYLOCOCCUS

Gram-pozitivni koki (kuglicaste stanice) u nepravilnim nakupinama aerobne ili fakultativno anaerobne bakterije, katalaza- pozitivne, oksidaza-negativne, nepokretne · rastu na uobicajenim hranjivim podlogama s ili bez dodatka krvi · patogeni stafilokoki : S. aureus, S intermedius i veina sojeva S. hyicus su koagulaza-pozitivni Stafilokoki vazni u veterinarskoj medicini: (1) S. aureus (2) S. intermedius (3) S. hyicus (4) S. epidermidis (5) S. saprophyticus (6) S. caprae (7) S. equorum (8) S.simulans (9) S. delphini (10)S. chromogenes · ·

S. aureus

Laboratorijska dijagnostika

Izravni mikroskopski preparat Izdvajanje (1) Identifikacija (2) izgled kolonija a) pigment b) hemoliza Mikroskopski preparat Postupci dokazivanja patogenosti izdvojenih sojeva stafilokoka: a) koagulaza b) DNAza c) protein A Biokemijski testovi · · Odreivanje osjetljivosti na antibiotike Fagotipizacija

85

Bakterijske bolesti

Staphylococcus

The bacterial genus Staphylococcus is split into two main groups: S. aureus: A cause of soft tissue infections, as well as toxic shock syndrome (TSS). It can be distinguished from other species of Staphylococcus by a positive result in a coagulase test ability to clot plasma (all other species are negative). Non-aureus species such as S. epidermidis (coagulase-negative). Staphylococci are non-motile, Gram-positive cocci, ~1 µm in diameter. The spherical cells occur in irregular clusters [Greek staphyle = bunch of grapes]. The term staphylococcus is also used for any bacteria with such a growth pattern.

Staphylococcus epidermidis Gram-positive cells ~1 µm diameter, arranged like "bunches of grapes". You can get a longer, better quality version of this video on the Microbiology Video Library CD. Broadcast quality (520 line) digital video: 3 minutes 30 seconds duration, no soundtrack. Supplied on PAL format miniDV tape plus accompanying notes. If you are interested in obtaining this video or in specific video commissions, please contact us.

S. epidermidis is a normal microbial inhabitant of human skin and mucosal surfaces but may spread to the blood through breaks in mucosal and skin integrity. This bacterium is an opportunistic pathogen. Those most susceptible to infection are intravenous drug users, newborns, elderly, and those using catheters or other artificial appliances. The organism produces a glycocalyx "slime" that acts as a glue adhering it to plastic and cells, and also causes resistance to phagocytosis and some antibiotics. Microbiology by L.M.Prescott et al. A balanced, comprehensive introduction to all major areas of microbiology. The Fifth Edition has been updated extensively to reflect the latest discoveries in the field. (Amazon.co.UK)

86

Bakterijske bolesti

Bakterijska vrsta Streptococcus

· · · · Gram-pozitivni koki koji se pojavljuju u parovima ili nizovima razlicite duljine aerobne ili fakultativno anaerobne bakterije, katalaza-negativne, oksidaza-negativne, nepokretne rastu na podlogama s dodatkom krvi (i/ili eskulina) neki vazniji streptokoki: (1) S. pyogenes (A) (2) S. agalactiae (B) (3) S. dysgalactiae (C) (4) S. equi subsp. equisimilis (C) (5) S. equi subsp. equi (C) (6) S. equi subsp. zooepidemicus (C) (7) Enterococcus faecalis (D) (8) S. equinus (D) (9) S. bovis (10)S. porcinus (E) (11)S. canis (G) (12)S. suis tip 1-34 Streptococcus pneumoniae. (13)S. uberis (14)S. pneumoniae

Openito o razlikovanju streptokoka

· hemoliza (beta)-hemoliza: potpuna zona hemolize uokolo kolonije (alfa)-hemoliza: zelenkasta zona djelomicne hemolize (gama)-hemoliza: nema hemolize · openita je tvrdnja da su -hemoliticni streptokoki patogeni za zivotinje · precipitacijom po Lancefieldovoj streptokoki su svrstani u seroloske skupine oznacene velikim slovima abecede, a raspodjela se osniva na skupno specificnim polisaharidima koji su sastavni dio stanicne stijenke streptokoka

Laboratorijska dijagnostika

Izravni mikroskopski preparat Izdvajanje Identifikacija (1) izgled kolonija (2) mikroskopski preparat kolonija obojenih po Gramu (3) katalaza test (negativna za razliku od stafilokoka) (4) odreivanje pripadnosti seroloskoj skupini po Lancefieldovoj CAMP test: kultura bakterije Staphylococcus aureus nanese se po sredini agara u koji je dodana ovcja ili govea krv (krvni agar) a kultura pretrazivanog streptokoka (skupina B) nanese se okomito na kulturu stafilokoka na udaljenosti 1 do 1.5 mm : pozitivan CAMP test ocituje se zonom potpune hemolize u obliku glave strelice (streptokoki skupine B tvore metabolite koji upotpunjuju lizu eritrocita koji su samo djelomice lizirani beta-hemolizinom stafilokoka) · · ·

87

Bakterijske bolesti

Ineks

Actinobacillus pleuropneumoniae, 46 Americka trulez legla, 3 Anaplazmoza, 72 Anthrax, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Antibiots terapija antraksa, 8 Apscesi u bubrezima, 20 Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes, 20 Arcanobacterium (actinomyces) pyogenes;, 18 atroficni rinitis, 42 B. abortus, 25 B. anthracis, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 B. canis, 25 B. cereus, 3, 11, 13 B. larvae, 3 B. melitensis, 25 B. neotomae, 25, 26 B. ovis, 25 B. piliformis, 3 B. suis, 25 bakterijemija, 22 Balanopostitis, 20 Bojenje metilenskim modrilom, 50 Bojenje po Giemsi, 50 Bolest kruzenja, 60 Brucella Abortus Disease (Brucellosis) in Beef Cattle, 27 Brucella melitensis in Texas, 36 Brucellacapt®, 35 Buffered Acidified Plate Antigen (BAPA), 28 Burkholderia mallei, 62 Burkholderia pseudomallei, 62 CAMP test, 19, 86 CDC, 5 Centers for Disease Control and Prevention, 5, 8 CF, 28 Chlamydia trachomatis, 48 Chlamydophila (prije Chlamydia) pecorum, 47 Chlamydophila (prije Chlamydia) pneumoniae, 47 Chlamydophila abortus, 47 Chlamydophila caviae, 47 Chlamydophila felis, 47 Chlamydophila psittaci, 47 Circling disease, 60 Cistitis, 20 Clostridium, 16 Clostridium piliforme, 3 Complement Fixation, 28 Concentration Fluorescent Immuno, 28 Corynebacterium, 18 crijevne infekcije i proljev, 52 Cutaneous infections, 6 Cokoladni agar, 45 Dermacentor andersoni (sumski krpelj), 22 Distinctive properties of genus Brucella, 34 Ehrlichia bovis, 79 Ehrlichia ondiri, 77 Ehrlichia ovina, 79 Ehrlichia phagocytophila, 78 Ehrlichia platys, 78 Ehrlichia sennetsu, 79 ELISA, 27 Elokominska metiljna groznica, 72 Encefalitis, 59 Endemicni ili murini tifus, 73 enteritis, 65 enzootska pneumonija, 42 enzootski pobacaj ovaca, 52 epididimitis, 25 Equigenitalis, 43 erysipelothrix rhusiopathiae, 21 eschar, 6, 9 Francisella tularensis, 22 Gastrointestinal anthrax, 7 Glasser-ova bolest, 45 Gnojna bronhopneumonija, 20 Gnojna upala plua,, 20 Govea petehijalna groznica, 72 Granulomatozna zarista, 23 H. influenzae, 45 H. paragallinarum, 45 H. parasuis, 45 Haemophilus, 43 Haemophilus avium, 43 Heartwater, 72 hepatitis, 52 Herd Depopulation, 29 Herd Management, 29 Inhalation anthrax, 7, 10 Klinicki znakovi, 60 kolera peradi, 40, 42 konjunktivitis, 50 Krpeljna groznica, 78 Krvni agar, 3, 19, 21, 23, 41, 54, 86 L. monocytogenes, 60 Limfangitis, 20 Listerijski pobacaj, 60 Ljetni mastitis, 20 M. haemolytica, 41, 42 macji pneumonitis, 52 Malteska groznica, 25 mastitis, 20, 42, 45, 52, 62, 65 Meningitis prasadi, 45 Modificirani Ziehl-Neelsen (MZN, 50 nekroticni stomatitis, 65 neplodnost stada, 25

88

Bakterijske bolesti

opa infekcija praena konjunktivitisom, 65 orhitis, 25, 45 otitis externa, 65 P. multocida, 40, 41, 42 Pasna groznica, 78 PCFIA, 28 perikarditis, 52 Pigmenti vrste P. aeruginosa, 64 Pijelonefritis, 20 Pleuropneumoniae, 43 pleuropneumonija, 42 pobacaj, 50, 52 Pobacaj, 60 poliartritis, 50 poliartritis/poliserositis, 52 Porodica Bacillaceae, 3 Porodica Chlamydiaceae, 47 Porodica Ehrlichiaceae, 67, 74 Porodica Parachlamydiaceae, 47 Porodica Simkaniaceae, 47 Porodica Waddliaceae, 47 Postupak po Castanedi, 50 Postupak po Macchiavelliju, 50 Potomacka konjska groznica, 72 Psea granulocitna erlihioza, 72 Pseudomonas aeruginosa, 62 RB-51, 31 Red Chlamydiales, 47, 52 Rhodococcus equi, 18, 19, 20 Rickettsia, 72 Rickettsia conori, 74 Rikecije, 67 Rod Aegyptianella, 79 Rod Anaplasma, 80 Rod Bacillus, 3 Rod Brucella, 24

Rod Chlamydia, 47 Rod Chlamydophila, 47 Rod Cowdria, 81 Rod Ehrlichia, 67, 74 Rod Neorickettsia, 82 Rod Rickettsia, 73 Roda Haemophilus, 43 RVK, 27 S. agalactiae, 86 S. equi, 86 S. equinus, 86 S. porcinus, 86 S. pyogenes, 86 S. uberis, 86 Senetsu groznica, 79 Septicni artritis, 20 septikemija, 65 Skin infection, 6 Smanjenje nesivosti, 45 spondilitis, 25 Spore B. anthracis, 3 Strain-19 vaccine, 31 Stakorski tifus, 73 Titar antitijela, 23 transportna groznica, 42 Tyzzer-ova bolest, 3 ulcer, 6 undulirajua groznica, 25 upala zracnih vreica, 52 Vektori, 67, 80 Vrsta Listeria, 54 Vrsta Pasteurella, 40, 42 Vrsta Staphylococcus, 84 Zarazna korica pilia, 45 Zarazne mononukleoza, 79 Zivcani oblik listerioze:, 60

89

Bakterijske bolesti

Information

Microsoft Word - specskripta_Obradjena2.doc

89 pages

Report File (DMCA)

Our content is added by our users. We aim to remove reported files within 1 working day. Please use this link to notify us:

Report this file as copyright or inappropriate

223150

You might also be interested in

BETA
Microsoft Word - specskripta_Obradjena2.doc